Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным ВОЗ (2012), аскаридозом в мире ежегодно инфицируется от 1 до 1,5 млрд. человек, большинство из которых составляют дети дошкольного и школьного возраста. В Российской Федерации ежегодно регистрируется несколько десятков новых случаев инфицирования указанной инвазией (Романенко Н.А., Семенова Т.А., 2007), что определяет её актуальность.
Одним из наиболее эффективных способов борьбы с гельминтозами является ранняя диагностика. Однако применяемые в настоящее время методы имеют низкую чувствительность и специфичность. Информативность овоскопии недостаточна даже после предварительного обогащения проб, в особенности у больных с низкой интенсивностью инвазии или на поздних стадиях заболевания. Яйца гельминта могут не обнаруживаться при одновременном паразитировании особей одного пола (3–5%), неполовозрелых или старых самок (Романенко Н.А. с соавт., 2008). Проблематична диагностика аскаридоза в раннюю миграционную фазу заболевания, когда специфическая терапия наиболее эффективна и существенно снижается риск осложнений заболевания. В связи с этим предложены рентгенологическая идентификация эозинофильных инфильтратов, мигрирующих в легочной ткани, ряд иммунологических методов, однако, отношение к результатам их практического применения со стороны профессионального сообщества пока достаточно разноречиво (Горохов В.В. с соавт., 2008).
В контексте вышеуказанного достаточно перспективным представляется разработка способов диагностики Аscaris lumbricoides на основании молекулярно-генетических методов, в частности полимеразной цепной реакции, характеризующиеся исключительно высокой чувствительностью и специфичностью. При этом существенно могут быть снижены временные затраты и появляется возможность экспресс-детекции аскарид как в различных клинических образцах, так и во внешней среде.
Целью исследования является конструирование тест-системы для детекции Ascaris lumbricoides в клиническом материале и сравнительная оценка информативности её практического применения для повышения эффективности лабораторной диагностики аскаридоза у детей на ранних стадиях заболевания.
Задачи исследования:
-
Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК Ascaris lumbricoides, представленных в GenBank/DDBJ,для выявления фрагментов, применимых в качестве ДНК-мишени и конструирования на этой основе тест-системы для их детекции методом ПЦР.
-
Разработка опытного образца тест-системы для полимеразной цепной реакции Аscaris lumbricoides в исследуемом материале.
-
Эпидемиологический анализ заболеваемости аскаридозом в Республике Башкортостан и обоснование выбора оптимальной возрастной группы обследуемых для адекватной сравнительной оценки информативности разработанной тест-системы и существующих способов прямого обнаружения Аscaris lumbricoides.
-
Сравнительная оценка информативности разработанной тест-системы для обнаружения Ascaris lumbricoides в клиническом материале (фекалии) и в объектах окружающей среды (почва, вода).
-
Составление практических рекомендаций по применению созданной тест системы для диагностики аскаридозной инвазии и санитарно-паразитологического контроля объектов внешней среды на Ascaris lumbricoides.
Научная новизна. Впервые был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов 18S рРНК Ascaris lumbricoides, Diphyllobothrium latum, Clonorchis sinensis, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica, Hymenolepis diminuta, Hymenolepis nana, Necator americanus, Opisthorchis viverrini, Paragonimus westermani, Strongyloides stercoralis, Taenia solium, Trichinella spiralis. При этом были выявлены уникальные последовательности гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides, не имевшие гомологии с нуклеотидными последовательностями указанных гельминтов, к которым были подобраны праймеры AscarFor и AscarRev для высокоспецифичной детекции и идентификации Ascaris lumbricoides в исследуемом материале на разных стадиях их развития.
Впервые создана тест-система для ранней диагностики кишечной стадии аскаридоза, основанная на обнаружении фрагментов гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides. Обоснованы оптимальные условия для амплификации искомых фрагментов в различных клинических образцах от пациентов с различными клиническими вариантами аскаридоза, а также - в образцах объектов внешней среды.
Практическая значимость. На основании проведенных исследований предложена диагностическая система, обеспечивающая лабораторную диагностику аскаридоза на ранних стадиях заболевания, при которых специфическая детекция Аscaris lumbricoides рутинными методами проблематична.
Проведена сравнительная характеристика информативности способа специфической детекции Аscaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания, определены основные показания к практическому использованию с учетом существующих методов лабораторной диагностики и накопленного при их использовании опыта.
Предложен алгоритм ранней лабораторной диагностики аскаридоза, обеспечивающий максимум диагностических данных при минимуме материальных и временных затрат.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты выполненной работы послужили основой для разработки патента на изобретение. Получен патент на изобретение РФ № 2424525 от 20.07.2011 на «Способ специфической детекции Аscaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания».
Результаты исследований внедрены в учебный процесс и используются в учебной работе на кафедре фундаментальной и прикладной микробиологии, кафедре лабораторной диагностики института последипломного образования и на кафедре эпидемиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Праймеры к фрагменту гена 18S рРНК Ascaris lumbricoides обеспечивают надежную специфическую амплификацию ДНК Ascaris lumbricoides размером 489 пн при исследовании тотальной ДНК, выделенной из клинического материала (кал, отделяемое слизистых, кровь) и из объектов внешней среды.
-
Обоснована группа больных с аскаридозной инвазией, инфицированность в которой характеризовалась наибольшими значениями, для адекватной сравнительной оценки информативности новых методов лабораторной диагностики аскаридоза, в том числе в будущих разработках.
-
«Способ специфической детекции Аscaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания» (патент РФ № 2424525 от 20.07.2011) по информативности превосходит наиболее широко применяемый в настоящее время метод овоскопии и может использоваться для раннего обнаружения не только яиц Аscaris lumbricoides, но и их личинок в клиническом материале вне зависимости от формы и фазы заболевания.
-
Выявление аскариды с помощью ПЦР – может быть включено в официальный перечень методов диагностики аскаридоза и методов санитарно-паразитологического контроля состояния объектов внешней среды (почвы, вода), что позволит оптимизировать диагностическую подсистему эпидемиологического надзора за данной инвазией.
Апробация работы. Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры фундаментальной и прикладной микробиологии, кафедры эпидемиологии и кафедры лабораторной диагностики института последипломного образования ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, протокол №11 от 29 июня 2012г.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на «Национальных лабораторных днях» (Москва, 2008); II Конгрессе педиатров стран СНГ «Ребенок и общество: проблемы здоровья, развития и питания» (Астана, 2010); 73-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2008), II Международной студенческой научной конференции с участием молодых ученых «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010).
Публикации. Основные материалы диссертации в полном объеме отражены в 5 публикациях, в том числе в 3 рецензируемых изданиях, 1 статья – в другом издании, 1 - в материалах конференций, 1 – патент на изобретение РФ (№ 2424525 от 20.07.2011 «Способ специфической детекции Аscaris lumbricoides в клиническом материале на различных стадиях заболевания»).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, глава «Материалы и методы исследования», 5 глав собственных исследований, заключение, выводы. Список литературы содержит 220 источников, в том числе 111 отечественных и 109 зарубежных авторов.
Похожие диссертации на Разработка и оценка информативности нового способа детекции Ascaris lumbricoides при паразитарных заболеваниях у детей
