Введение к работе
Актуальность темы. Бактерии Bacillus mesentericus - фитопатогенные бактерии, поражающие лен, тыкву, кукурузу, свеклу, плоды апельсина, абрикоса, кабачков и других растений, клубни картофеля, семенники капусты, коробочки хлопчатника и т.п., и тем самым наносящие значительный экономический ущерб сельскохозяйственным и перерабатывающим предприятиям (Аскалонов, 1962; Меркулов, 2011).
Бактерии Bacillus mesentericus в ассоциации с Bacillus subtilis являются возбудителями картофельной болезни хлеба. Разрушение структуры хлеба и разложение содержащихся в нем веществ, связано с продуцированием этими видами бактерий активных протеолитических и амилолитических ферментов (Медведев, 2010). Спороносным бактериям Bacillus mesentericus, особенно их термофильным формам, отводится значительная роль в процессах самосогревания зерна (Пельц, 2003).
Бактерии Bacillus mesentericus являются возбудителями порчи пищевого сырья и продуктов питания, вызывают отравления, характеризуемые острым течением болезни по типу отравлений, вызываемых Bacillus cereus.
В настоящее время в бактериологических лабораториях идентификация бактерий Bacillus mesentericus, основана на выделении чистой культуры микроорганизмов и изучении их биохимических свойств. Этот метод трудоемок и не достаточно эффективен из-за выраженного полиморфизма ферментативных свойств бактерий Bacillus mesentericus. Поэтому перед исследователями стоит задача разработки достоверного и метода индикации и идентификации названных микроорганизмов. Классическая схема идентификации бактерий рода Bacillus первой морфологической группы по R. Gordon (1973) чрезвычайно материало затратная и трудоемкая. На сегодня вопрос о разработке ускоренной схемы идентификации Bacillus mesentericus остается открытым.
Мы предлагаем использовать для индикации и идентификации Bacillus mesentericus использовать специфичные бактериофаги, позволяющие достоверно идентифицировать пищевые контаминанты и проводить их дифференциацию на биотипы и фаговары внутри вида.
Патентный поиск и анализ литературных данных свидетельствует, что в настоящий момент в Российской Федерации не разработаны методики индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus с помощью бактериофагов в объектах санитарного надзора. Применение этих методик позволит в сжатые сроки найти и идентифицировать бактерии вида Bacillus mesentericus, в течение 25 часов, используя минимальное количество расходных материалов.
Цель исследования – разработать биотехнологические параметры изготовления фагового препарата для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания.
Задачи исследования:
1. Изучить распространение бактерий Bacillus mesentericus в пищевых продуктах.
2. Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении бактерий Bacillus mesentericus.
3. Изучить основные биологические свойства (литическую активность и ее спектр, специфичность, температурную устойчивость, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.
4. Сконструировать биопрепарат для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания.
5. Разработать технологические параметры изготовления биопрепарата на основе фагов.
6. Разработать схему ускоренной индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания титра фага с использованием созданного биопрепарата.
7. Разработать экспресс-метод идентификации бактерий Bacillus mesentericus с помощью бактериофагов.
Научная новизна. Впервые выделены из проб почвы и изучены по основным биологическим свойствам специфичные бактериофаги Bacillus mesentericus, из них для конструирования биопрепарата отобраны фаги Bm–3 УГСХА и Bm–8 УГСХА, имеющие наиболее широкий спектр литического действия и высокие показатели литической активности, незначительно изменяющиеся при хранении в течение 12 месяцев.
Разработаны биотехнологические параметры изготовления лабораторной серии биопрепарата для индикации и идентификации Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания.
Доказана возможность применения схемы фагоиндикации Bacillus mesentericus в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов c применением созданного биопрепарата.
Предложен экспресс-метод выделения и идентификации бактерий вида Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора с помощью созданного фагового биопрепарата.
Практическая значимость.
Использование разработанных схем фагоиндикации и фагоидентификации бактерий Bacillus mesentericus открывает перспективы их использования в лабораторной практике для оценки качества пищевого сырья и продуктов питания растительного и животного происхождения, позволяющие сократить время исследования до 25 часов (при постановке РНФ) и до 32 часов (при фагоидентификации) и снизить экономические затраты на исследования.
Результаты изучения биологических свойств бактериофагов Bm–3 УГСХА и Bm–8 УГСХА и методика фагоиндикации бактерий Bacillus mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания подтверждены актом производственных испытаний в ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» (22.10.2012), утвержденным директором Юсуповым Р.М., актами комиссионных испытаний в ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (17.09.2012), утвержденными первым проректором – проректором по науке, профессором Исайчевым В.А.
По материалам диссертационных исследований разработана нормативно-техническая документация: «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии фагов Bm–3 УГСХА и Bm–8 УГСХА для индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus» и «Методические рекомендации по ускоренной индикации и идентификации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора с применением специфичных бактериофагов», рассмотренная на научно-техническом совете и утвержденная первым проректором – проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» (16.10.2012), размещенная в виде электронного ресурса на сайте научной библиотеки ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» и предназначенная для аспирантов и научных сотрудников, специализирующихся в области биотехнологии и микробиологии
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина».
Положения, выносимые на защиту:
-
Используя схему выделения бактериофагов из объектов санитарного надзора применительно к бактериям Bacillus mesentericus, выделено и селекционировано 22 изолята специфических бактериофагов, изучены основные биологические свойства (спектр литического действия, литическая активность, специфичность, изменение литической активности при хранении, устойчивость к температуре).
-
На основе селекционированных фагов бактерий Bacillus mesentericus Bm–3 УГСХА и Bm–8 УГСХА, которые обладали наиболее высокими титрами литической активности и широким спектром литического действия был сконструирован биопрепарат. Разработаны технологические параметры его изготовления.
-
Результаты исследований свидетельствуют, что разработанный экспресс-метод идентификации бактерий Bacillus mesentericus с применением биопрепарата на основе фагов Bm–3 УГСХА и Bm–8 УГСХА, позволяет определить видовую принадлежность Bacillus mesentericus за 25 часов.
-
Эксперименты демонстрируют, что схема ускоренной индикации бактерий B. mesentericus в пищевом сырье и продуктах питания методом реакции нарастания титра фага (РНФ), применяя сконструированный биопрепарат, позволяет обнаружить бактерии Bacillus mesentericus за 25 часов в концентрации 103 м.к./г.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина» и была поддержана 3 грантами Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса 2011, 2012» («УМНИК»), грантом «Молодые новаторы аграрной России» некоммерческой организации «Ассоциация образовательных учреждений АПК и рыболовства» и Федеральной целевой программой «Поддержка научных исследований, проводимых коллективами научно-образовательных центров по научному направлению «Науки о жизни (Живые системы)»» (Шифр лота 2012-1.1-12-000-2008, наименование «Бактериофаги как природные биосенсоры для индикации и идентификации бактериальных агентов, вызывающих пищевые инфекции и порчу пищевого сырья»).
Апробация работы:
Все научные положения и выводы по результатам диссертационной работы обеспечены глубокой проработкой литературного материала, согласованностью полученных теоретических и экспериментальных данных с результатами исследований, которые были представлены на: III Международной научно – практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука 21 века» (Ульяновск, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее», посвященного 90-летию Заслуженного профессора Московского университета Н.С. Егорова (Москва, 2011), Научно-практическом семинаре с международным участием «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности» (Ульяновск, 2011), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), VI Международной научно-практической конференции «Аграрная наука – сельскому хозяйству» (Барнаул, 2011), III Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи – путь к обществу, основанному на знаниях» (Москва, 2011), III Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), II-й конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 2012).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад соискателя состоит в планировании и проведении экспериментальных исследований в рамках диссертационной работы, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, перечня сокращений и условных обозначений, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 126 страницах, включают 26 таблиц и 12 рисунков. Список использованных литературных источников включает 182 наименования, в том числе 54 зарубежных.
Похожие диссертации на Разработка фагового препарата Bacillus mesentericus и область его практического применения
