Введение к работе
1. Актуальность темы. Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров в таких областях как медицина, косметология, пищевая промышленность, ветеринария, а также в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней.
Сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса. Они страдают от болезней и вредителей, бесконтрольного применения пестицидов и избытка удобрений, а также других неблагоприятных факторов. В этих условиях защита растений от болезней и стрессов является особенно актуальной. Одним из наиболее перспективных способов повышения защитных ответов растений является метод индуцирования их устойчивости с помощью экологически безопасных биогенных элиситоров (Метлицкий Л.В., Озерецковская О.Л., 1985; Durrant, Dong, 2004), к числу которых относится хитозан (Hadwigcr L.A., 1984).
Элиситоры - соединения, вызывающие или индуцирующие защитные механизмы в растительных тканях и тем самым предохраняющие растения от болезней и стрессов (Тарчевский И.А., 2002) Препятствием в использовании хитозана в качестве элиситора является его плохая растворимость в воде при нейтральном рН, с чем, по-видимому, частично может быть связана его невысокая биологическая активность. Для рсшсігия этой проблемы предпринимаются попытки снижения молекулярной массы хитозана, создания композиционных препаратов на его основе, а также синтеза новых производных, водорастворимых при нейтральном значении рН.
Одной из возможностей интенсификации защитных свойств хитозана является его комбинация с салициловой кислотой (СК) (Панина Я.С., 2005). Известно, что СК принимает участие в процессе формирования устойчивости растений (Васюкова Н.И., 1999; McDowell, Dung], 2000; Тарчевский И.А., 2002; Durrant, Dong, 2004), и является сигнальной мобильной молекулой, способной транспортироваться по тканям растений,
вызывая их системную устойчивость. Создание и использование на практике композиционных препаратов хитозана с сигнальными молекулами, обладающих высокой скоростью и интенсивностью индуцирования в растениях системных защитных реакций, являются достаточно перспективными.
Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в получении низкомолекулярного хитозана и его производных с салициловой кислотой для поиска среди них новых высокоэффективных защитных препаратов, индуцирующих фитофтороустойчивость и стимулирующих процесс залечивания механических поранений у клубней картофеля. Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:
-
Оптимизировать метод ферментативного гидролиза высокомолекулярного хитозана (ВМХ 700 кДа) с помощью ферментного препарата (ФП) Фитопаин и определить условия получения низкомолекулярных образцов хитозана (НМХ) с заданной молекулярной массой 5-50 кДа.
-
Разработать технологическую схему производства НМХ из ВМХ с помощью ФП Фитопаин.
-
Исследовать влияние степени дезацетилирования (СД), молекулярной массы (ММ) и концентрации полученных образцов хитозана, на элиситорную и репарационную способность тканей клубней картофеля. Из полученных НМХ выбрать образец, обладающий наибольшей биологической активностью.
-
На основе выбранного образца хитозана, синтезировать его производные с салициловой кислотой (СК), изучить их биологическую активность. Определить препарат, проявляющий наибольшую способность индуцировать локальную и системную устойчивость клубней картофеля. Разработать технологическую схему его получения.
Научная новизна работы. Установлена возможность гидролиза ВМХ (700 кДа) ферментным препаратом Фитопаин. Оптимизирован метод и подобраны условия для получения образцов НМХ с заданной характеристикой молекулярной массы от 5 до 50 кДа. Разработана технологическая схема и подобраны условия проведения ферментативного гидролиза хитозана с помощью Фитопаина. Наибольшей элиситорной и репарационной активностью обладает образец хитозана с ММ 5 кДа и СД
85%, индуцирующий фитофтороустойчивость и стимулирующий процесс залечивания механических поранений клубней картофеля. Показано, что элиситорная и репарационная активность хитозана имеет не только локальный, но и системный характер.
С целью интенсификации защитных свойств хитозана (ММ 5 кДа и СД 85%) были синтезированы его производные с системной мобильной сигнальной молекулой СК. Впервые проведенный скрининг производных хитозана позволил установить, что наибольшим защитным эффектом обладает М-2-гидрокси-3-мстоксибензил-М-пиридоксхитозан, который в диапазоне испытанных концентраций превосходит свойства исходного хитозана. Установлено, что N-2-гидрокси-З-метоксибензил-М-пиридоксхитозан обладает:
элиситорпой активностью, защищая картофель от возбудителя фитофтороза;
репарационными свойствами, активно залечивая участки механических поранений клубней картофеля и тем самым предохраняя их от проникновения инфекции;
защитными и репарационными свойствами в низких концентрациях (0,1-1 мкг/мл), в которых исходный хитозан активностью не обладает.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе НМХ (5 кДа), полученного, по разработанной методике, ферментативным гидролизом с помощью ФП Фитопаин, был синтезирован новый высоко активный препарат - элиситор, способный в малых концентрациях повышать фитофтороустойчивость и репарационную активность клубней картофеля.
Фитофтороз является одной из наиболее вредоносных болезней
картофеля, уносящей в годы эпифитотий до 50% его урожая.
Репарационная способность картофеля также нредстав.іиет немалую
важность для сельскохозяйственного производства, поскольку пораненная
поверхность клубней, неизбежная при уборке и транспортировке,
открывает возможность беспрепятственного проникновения инфекции.
Полученный препарат (М-2-гидрокси-3-метоксибензил-М-
пиридоксхитозан) даже в малых концентрациях интенсифицировал защитные ответы картофеля и увеличивал скорость их распространения, что является весьма существенным для сохранения урожая.
Апробаиия работы. Основные положения работы были представлены на 4-ом Международном научно-практическом симпозиуме «Микробные биокатализаторы и их роль в нано- и биотехнологии», (г. Москва, 2008); Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Технологии и оборудование химической, биологической и пищевой промышленности» (г. Бийск, 2008); 9-ой международной конференции «Современные перспективы исследования хитина и хитозана» (г. Ставрополь, 2008); 5-ом съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2008); 9 International Conference of the European Chitin Society (Venice, Italy, 2009); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (г. Щелково, 2009); 10-ой международной конференции "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (г. Нижний Новгород, 2010).
Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования в лаборатории инженерии ферментов (Центр «Биоинженерия» РАН) и в лаборатории биохимии фитоиммупитета (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН), а также обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения,
выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 406
страницах машинописного текста, содержит -ч п таблиц
иу -у рисунков, библиографию из -7 ^^наименований, из них О б на иностранном языке.
Благодарности. Автор благодарит за поддержку и внимание сотрудников лаборатории инженерии ферментов Центра «Биоинженерия» РАН: к.х.н. А.В. Ильину, к.х.н. С.А. Лопатина, к.х.н. А.Н. Левова, Д.В. Курек, А.В. Бакулина, а также сотрудников лаборатории биохимии фитоиммупитета, Института Биохимии А.Н. Баха РАН: проф., д.б.н. О.Л. Озерецковскую, к.б.н. Г.И. Чаленко, к.б.н. Н.Г. Герасимову.
