Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Введение
1.1. Актуальность проблемы 4
1.2. Цель и задачи исследования 7
Глава 2 Применение метода ПФИА для анализа физиологически активных веществ (Литературный обзор)
2.1. Принципы поляризации флуоресценции 10
2.2. Основы поляризационного флуороиммуноанализа 14
2.3. Достоинства, ограничения и пути развития ПФИА 16
2.4. Техника эксперимента 19
Резюме к главе 2 30
Глава 3 Особенности получения иммунореагентов и определения наркотиков методом ПФИА
3.1. Синтез иммуногенов и флуоресцеин-меченных трейсеров для определения метамфетамина
3.2. Влияние гетерологичности структуры флуоресцеин- меченного трейсера на чувствительность определения метамфетамина
3.3. Влияние длины мостика в трейсерах на константуаффинности и чувствительность определения метамфетамина методом ПФИА
3.4. Разработка определения бензфетамина и метамфетамина 41
3.5. Стратегия получения иммунореагентов для определения 44 наркотиков группы фенилалкиламинов
3.6. Особенности определения эфедрина и 51 фенилпропаноламина методом ПФИА
3.7. Оптимизация методик и корреляция результатов ПФИА с 57 данными других методов определения фенилалкиламинов
3.8. Определение опиатов и бензодиазепинов методом ПФИА 61 Резюме к главе 3 67
Глава 4 Получение иммунореагентов и оптимизация условий 68
определения лекарств и гормонов методом ПФИА
4.1. Определение фенобарбитала и барбамила как 69 наркотических веществ
4.2. Влияние структуры иммуногена и флуоресцентных 79 трейсеров на специфичность и чувствительность определения фенобарбитала в сыворотке крови
4.3. Разработка методов ПФИА для определения антибиотиков 90 хлорамфеникола, бензилпенициллина, гентамицина, канамицина и стрептомицина
4.4. Сравнение определения антибиотика гентамицина 96 методами ФИА с детекцией поляризации и интенсивности (тушения) флуоресценции
Применение метода поляризации флуоресценции для определения ферментов 235
Пути развития других иммунофлуоресцентных методов 239
Общие закономерности по выбору иммунореагентов и разработке методов ПФИА физиологически активных веществ251
Список физиологически активных веществ, для определения которых были разработаны методики ПФИА 252
Выводы 253
Список литерату эы 255
Список сокращений 269
- Актуальность проблемы
- Принципы поляризации флуоресценции
- Синтез иммуногенов и флуоресцеин-меченных трейсеров для определения метамфетамина
Введение к работе
Актуальность проблемы 4
Цель и задачи исследования 7 Глава 2 Применение метода ПФИА для анализа физиологически 9
активных веществ (Литературный обзор)
Принципы поляризации флуоресценции 10
Основы поляризационного флуороиммуноанализа 14
Достоинства, ограничения и пути развития ПФИА 16
Техника эксперимента 19 Резюме к главе 2 30
Актуальность проблемы
В результате эволюции человека и всего общества в биосфере циркулирует все большее число различных чужеродных для человека и животных органических соединений, происходят существенные изменения в организме человека, в составе и качестве пищи, происходят глобальные изменения в окружающей среде. Все эти изменения необходимо как минимум контролировать, что требует развития аналитических методов по определению изменений состояния окружающей среды по многочисленным параметрам.
В современном российском обществе злоупотребление наркотическими средствами является одним из наиболее актуальных вопросов медицины и социальной практики. Постоянный рост потребления наркотических средств ті одурманивающих веществ, приобретающий угрожающие масштабы, приводит к формированию ситуации, когда остро встает проблема передозировок и острых отравлений наркотическими и лекарственными средствами, нередко . заканчивающихся смертельным исходом. Для получения достоверной картины отравления и решения вопросов экспертной практики, связанных с исследованием биологического материала на наличие наркотических средств, на предварительном этапе судебно-химического исследования необходимо использовать высокочувствительные и специфичные методы анализа.
Все возрастающее применение пестицидов, минеральных удобрений, лекарств, поверхностно-активных и многих, других биологически активных веществ приводит к серьезным экологическим проблемам. Среди пестицидов наиболее широкое применение находят хлорсодержащие пестициды, которые способны накапливаться и загрязнять почву, водоемы и продукты питания, - оказывая при этом токсическое воздействие на организм человека и животных. Именно эти соединения являются основными загрязнителями рек и грунтовых
" 5 вод [1-3]. Для решения проблемы загрязнения окружающей среды в первую очередь необходимо выявлять загрязненные регионы и источники заражения. Экологический контроль неблагоприятных регионов осуществляется во всех развитых странах, однако известно, что этой проблеме уделяется мало внимания. Одна из причин того, что экологический мониторинг развивается столь медленно - техническая сложность и высокая стоимость анализа, а также невысокие производительность и массовость определений. Те же проблемы актуальны для массового контроля пищевых продуктов - необходимы простые и экспрессные методы определения основных загрязнителей [4].
Прежде всего необходимо контролировать содержание так называемых физиологически акгивных веществ, к которым относятся наркотики, лекарства, {у гормоны, пестициды, детергенты, ксенобиотики и др. соединения.
Исключительная важность определений этих веществ связана с необходимостью быстрого, простого и точного определения их влияния на организм человека и животных. Для получения статистически верных определений физиологически активных веществ необходимо проводить сотни, тысячи и более определений. Поэтому к современным тест-системам предъявляются следующие основные гребования: простота выполнения анализа, непродолжительность по времени постановки, высокая производительность, низкая стоимость определений и др. Традиционно для определения содержания физиологически активных веществ применяют хроматографические методы анализа (ХМ) [2, 5, 6], а также тонкослойную хроматографию [7], проточно-инжекционные методы [8], капиллярный электрофорез [9, 10]. Эти методы незаменимы в тех случаях, когда нужно строго идентифицировать искомое вещество или определить одновременно несколько веществ. Однако эти методы не лишены и недостатков. К ним следует отнести высокую стоимость аппаратуры и необходимость высокой квалификации персонала. Кроме того, анализу каждого образца предшествует длительная пробоподготовка, занимающая время от нескольких часов до нескольких суток. Это .делает весьма затруднительным скрининг и мониторинг веществ, который обычно требует периодического анализа большого числа образцов или единичных образцов на множество
определяемых веществ. Техническая оснащенность ХМ постоянно
совершенствуется, что увеличивает их чувствительность, точность, и, в то же время, стоимость соответствующего оборудования. Кроме того, следует отметить, что ХМ малопригодны для оперативного контроля в полевых условиях.
Достижения последних лет в области аналитической химии связаны с развитием биоаналитических методов анализа, которые позволяют преодолеть вышеупомянутые трудности. Оценка производительности, стоимости и точности наиболее распространенных на сегодняшний день методов анализа показала, что для скрининга природных образцов на содержание пестицидов с экономической точки зрения более удобны экспрессные иммунохимические методы анализа (ИХМ) [11-14].
В основе ИХМ лежит высокоспецифическая и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами. Антитела - это белки класса иммуноглобулинов (мол. масса 150000 дальтон), которые вырабатываются в иммунной системе любого позвоночного животного или человека в результате проявления защитной реакции (иммунитета) при попадании в него чужеродного вещества антигена. Антиген - это вещество, которое индуцирует образование антител. Однако вещества с молекулярной массой менее 1000 дальтон (к которым относятся большинство физиологически активных веществ) не являются иммуногенными, но приобретают иммуногенность после их присоединения к более крупным молекулам (например, белкам типа альбумина). Такие низкомолекуляриые вещества называют гаптенами, для них . антитела получают путем иммунизации подопытных животных их конъюгатом (комплексом) с белком.
Достоинствами ИХМ являются: 1) простота и быстрота выполнения определения, 2) возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях, 3) несложная пробоподготовка образца, исключающая деградацию веществ, которая для водных образцов чаще всего не требуется (так называемый, непосредственный анализ - direct assay). ИХМ обладают также высокой точностью. Более того, ИХМ не требуют дорогостоящей аппаратуры (большинство ИХМ основано на фотометрическом, флуориметрическом, люминесцентном или электрохимическом детектировании), а полуколичественную оценку проводят визуально [15]. К недостаткам ИХМ относят узкую специфичность определения и влияние компонентов матрицы. В то же время для экологического мониторинга наиболее актуально определять не индивидуальное соединение, а целую группу веществ.
Иммунохимические методы широко используют в аналитической практике, различных областях медицины, микробиологической и пищевой промышленности [16-18]. На протяжении нескольких десятилетий их успешно применяют в медицинской диагностике для обнаружения вирусов, гормонов, лекарственных препаратов. Успех ИХМ легко проследить на примере лабораторных анализов в медицине. Еще десяток лет назад в этой области господствовали хроматографические методы. Однако сейчас в медицинских диагностических лабораториях хроматограф используют только в единичных случаях, когда необходимо подтвердить результаты ИХМ. Все чаще определение различных биологически активных веществ проводят ИХМ.
Лидирующее положение среди ИХМ определения физиологически активных веществ занимает гетерогенный твердофазный ИФА (ELISA -Enzyme linked immuno-sorbent assay). Его доля среди ИХМ определения пестицидов, например, составляет около 90% [19]. В методах ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детектирования ферментативной метки. ИФА посвящено множество работ в отечественных и иностранных журналах. Так, в российской литературе теория ИФА, принципы его разработки и оптимизации изложены в обзорах [20-21]; применение ИФА для определения пестицидов - в [22-24]. Некоторые из последних обзоров иностранных авторов по основам ИФА и тенденциям его развития для определения пестицидов представлены в [25-27], особенности проведения определения в объектах окружающей среды - [28-30], а в продуктах питания - [2, 31, 32].
Принципы поляризации флуоресценции
Настоящая работа направлена на решение следующих проблем:
нахождение путей синтеза иммунореагентов (производных антигенов, иммуиогенов, флуоресцеин-меченных соединений) и их дизайн;
выбор стратегии по разработке экспресс-методик для идентификации и количественного определения низкомолекулярных физиологически активных веществ методом ПФИА;
адаптация разработанных методик для анализа реальных объектов, производство наборов иммунореагентов, утверждение документации и практическое применение.
Для достижения поставленной цели были решены следующие задачи:
осуществить синтез иммуиогенов и флуоресцентных трейсеров;
получить высокоспецифические антитела к изучаемым соединениям;
разработать оптимальные методики определения;
определить аналитические характеристики разработанных методик и апробировать их на модельных смесях и экспертном материале;
изучить стабильность иммунореагентов и разработанных тест-систем;
сравнить результаты определения физиологически активных веществ в реальных объектах с помощью разработанного поляризационного флуороиммуноанализа и других аналитических методов.
Научная новизна работы:
Создано новое направление в биоаналитической химии, связанное с синтезом и изучением новых иммунореагентов, и на этой основе разработаны гест-системы для целого ряда физиологически активных веществ.
Впервые разработаны методики определения многих наркотиков, лекарств, детергентов, пестицидов и других низкомолекулярньтх веществ, обладающих физиологической активностью, методом ПФИА. Синтезированы иммуногены и треисеры - антигены, меченные флуоресцеином, специфичные дггя определения как индивидуальных соединений, так и целого класса близких по структуре соединений. Разработаны высокочувствительные методики определения 38 веществ из различных групп методом ПФИА.
Изучено влияние структуры коныогатов гаптенов с белками-носителями (иммуиогенов) на специфичность и аффинность образующихся антител. Найдены закономерности в структуре трейсеров, влияющие на чувствительность ПФИА. Определены оптимальные пары антител и трейсеров для наиболее специфичного и чувствительного определения как индивидуального соединения, так и группы веществ. Структуры меченных флуоресцеином антигенов (трейсеров) для определения эфедрина и амобарбитала защищены патентами. Оптимизированы условия определения исследуемых соединений применительно к поляризационным флуориметрам: TDx-анализатору фирмы Abbott (США), Веасоп-2000 фирмы PanVera Corp. (США) и экспериментальному образцу АФП-2 (ВНИИБП, Россия). Созданы наборы реагентов для проведения ПФИА в автоматическом режиме на приборе TDx, которые используются в диагностических лабораториях для определения наркотиков. Впервые созданы комбинированные реагенты (однореагентные тест-системы) для экспресс-определения эфедрина, метамфетамина, гентамицина, атразина, метбензатурона и др. В целях упрощения постановки ПФИА приготовлены комбинированные реагенты для. определения веществ, состоящие из заранее полученного иммунокомплекса антител и трейсера. Использование комбинированного реагента значительно упрощает методику определения и сокращает время качественного анализа до нескольких минут. Однореагентные іест-системьі намного более стабильны при хранении, чем растворы антител и трейсеров. Градуировочные графики стабильны для количественных расчетов в течение длительного времени (до месяца).
Практическая значимость работы: впервые получены следующие иммунореагенты: производные с активными функциональными амино- или карбоксильными группами для низкомолекулярных физиологически активных соединений, их конъюгаты с флуоресцеином (треисеры) и белками (иммуногены), поликлональные и моиоклопальные антитела; 9 создана опытная партия иммунореагентов, проведена апробация и утверждена документация для тест-систем для определения наркотиков;
предложены методики определения пестицидов, детергентов и других загрязнителей в водных объектах окружающей среды и пищевых продуктах;
оптимизированные пары иммунореагентов успешно применены для разработки новых методик определения низкомолекулярных соединений методами ИФА и иммуносенсоров.
Положения, выдвигаемые на защиту:
новые подходы к созданию иммунореагентов для определения ряда наркотиков, лекарств, гормонов, пестицидов и детергентов;
изучение влияния структуры иммунореагентов и нахождение закономерностей, которые влияют на специфичность и чувствительность поляризационного флуороиммуноанализа;
принципы по оптимизации методик ПФИА для определения физиологически активных соединений;
создание новых схем проведения ПФИА. Апробация работы. Результаты работы были многократно доложены, в том Ф числе в виде устных докладов на 28 конференциях, список которых приведен в конце автореферата.
Синтез иммуногенов и флуоресцеин-меченных трейсеров для определения метамфетамина
Метамфетамин является одним из наиболее распространенных синтетических наркотиков. Хотя наркотическое влияние оказывает только (d)- метамфетамин синтезируемый наркотик имеет смесь изомеров, поэтому и определять надо обе формы метамфетамина, В соответствии с этим, антитела и трейсеры на метамфетамин получали из рацемической смеси метамфетамина. Схемы синтеза производных метамфетамина с различной длиной ножки, различающихся количеством углеродных атомов в углеводородной цепи, приведены на рис. 3,1.2. В соответствии с доступностью исходных реагентов, в реакции с метамфетамииом использовались либо бром-алкилфталемиды (которые затем восстанавливались гидразином), либо бром-алкилнигрилы (которые затем восстанавливались алюмогидридом лития). Полученные аминопроизводные метамфетамина с различной длиной мостика использовались в реакции с ФИТС для получения трейсеров, а аминобутильное производное также конъюгировалось с белком KLH карбодиимидным методом. Полученный иммуноген использовали для иммунизации 6 овец по стандартной методике с полным и неполным адъювантом Фрейда, Еженедельно отбирались небольшие аликвоты крови от животных (1-2 мл), и определялся титр антител. Проводили раститровку антител с гомологичным трейсером па основе аминобутилметамфетамина, и за титр принимали разведение антител, которое давало поляризацию флуоресценции 200 тР. Ежемесячно, через неделю после «подстегивания» животных, согласно стандартной схеме иммунизации отбирали большую порцию крови (примерно 750 мл) и выделяли антисыворотку. В результате отбора лучших антисывороток после нескольких месяцев иммунизации удалось получить значительный объем антисыворотки, которая использовалась в коммерческих целях.
Рис 3 I 2 Схемы синтеза производных (II) с различной длиной ножки между метамфетамином (I) и аминогруппой, различающихся количеством углеродных атомов (n = 2,4,5,7) в углеводородной цепи, и соответствующих трейсеров (Ш) и иммуногенон (IV) для получения антител.
На рис. 3.1.3 приведена временная зависимость получаемого титра антисыворотки от времени иммунизации на примере одной овцы. Следует отметить, что все овцы дали иммунный ответ и имели примерно подобные кривые раститровки, что свидетельствует о правильном выборе иммуногена и методики получения антител. Поэтому некоторые антисыворотки были объединены в одну антисыворотку, так что объем и высокий титр антител позволял их использовать u в неограниченном количестве для исследований, производства и продажи.
Титр антител заметно возрастал после первого и второго месяца иммунизации, после чего титр оставался практически на неизменном уровне. Более того, после прекращения иммунизации на полгода и последующего возобновления иммунизации, титр практически сразу возрастал до максимального значения. Т.е. антисыворотку с высоким титром можно получать уже после двух циклов иммунизации и возобновлять иммунизацию после некоторого перерыва.
Похожие диссертации на Поляризационный флуороиммуноанализ физиологически активных веществ
