Биологически активные вещества в ветеринарии Крыжановская Елена Викторовна

Содержание к диссертации

Введение

1 .Общая характеристика работы 5

1.1. Актуальность темы 5

1.2. Цель и задачи исследований 11

1.3. Научная новизна 12

1.4. Апробация работы

1.5. Основные положения и результаты, выносимые на защиту 15

1.6. Публикации 15

1.7. Структура и объем диссертации

2. Литературный обзор 16

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы 46

3.2. Результаты исследований 51

3.2.1. Применение низкомолекулярного сукцината хитозана в качестве иммуномодулятора при вакцинации телят против пастереллеза

3.2.2. Антимикробный эффект влияния кислоторастворимого хитозана против возбудителей туберкулеза

3.2.3. Сорбционные свойства хитозана и его применение при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных

3.2.4. Антиметастатическая активность олигомеров хитозана в фитохитодезтерапии

3.2.5. Изучение биологической антиаксидантной активности хитозана и его производных

3.2.6. Антиоксидантная активность пребиотика для птиц «Авистим»

3.2.7. Ранозаживляющие свойства хитозана 73

3.2.8. Влияние ферментного препарата коллагеназы на функционально-технологические свойства мясопродуктов

3.2.9. Производство лечебно-профилактических кормовых белковых добавок-синбиотиков для сельского хозяйства

3.2.10. Кормовая биологическая добавка для выращивания бройлерных цыплят

3.2.11. Испытание автолизата хлебопекарных дрожжей в составе питательной среды при производстве препарата «Ларвиоль -паста»

3.2.12. Яично-дрожжевой гидролизат в качестве лечебно- 83

профилактической подкормки для пчел

3.2.13. Исследование in vitro антагонистической активности и чув- 86

ствительности к антибиотикам бактерий -пробиотиков L.Plantarum шт. М-30 и B.Subtilis шт. В-1948

3.2.14. Обеспечение качества и безопасности производства биологически активных веществ в биотехнологии

3.3 .Обсуждение результатов исследованийю 92

4. Практические предложения 100

5. Выводы 101

6. Список литературы

• Научная новизна
• Публикации
• Применение низкомолекулярного сукцината хитозана в качестве иммуномодулятора при вакцинации телят против пастереллеза
• Влияние ферментного препарата коллагеназы на функционально-технологические свойства мясопродуктов

Введение к работе

Актуальность темы. Биологически активные вещества (БАВ), неспецифические средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т.д.), используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество обрабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветеринарии.

Биологически активные вещества (БАВ), обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхождения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и цитокины. Пептиды представляют собой, в основном, экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологически активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интерлейкины, монокины и интерфероны.

Незаразные болезни молодняка сельскохозяйственных животных в первые дни жизни широко распространены в животноводстве и являются одной из основных проблем ветеринарной практики. Болезни молодняка сельскохозяйственных животных имеют повсеместное распространение и их лечение, и профилактика являются неотложными задачами ветеринарии.

Из незаразных заболеваний молодняка наиболее часто регистрируют желудочно-кишечные болезни, которые составляют у молодняка до 10-дневного возраста 60-90%. Связано это, прежде всего с нарушением технологии содержания и кормления животных, а также несовершенством естественной защиты их организма к воздействию неблагоприятных факторов

внешней среды. Желудочно-кишечные болезни телят наносят огромный ущерб животноводству вследствие высокой заболеваемости и падежа (до 100%), затрат на лечебные мероприятия, снижения продуктивных качеств и племенной ценности животных. Хотя изучение данной проблемы посвящено много работ, и для лечения этой группы заболеваний предложено много схем, все же до настоящего времени не удается достигнуть 100% сохранности молодняка. Гительсон С.С. (1974), Ежиков А.А. (1970), Зароза В.Г. (1984) и др. (1984) установили, что наибольшее распространение среди болезней телят имеет диспепсия, заболеваемость которой на молочных фермах и комплексах составляет 80%-95%, а летальность от 15% до 70%. Причем, заболевание имеет сложную этиологию, что создает трудности в диагностике и лечении. При заболеваниях в ранний период жизни регистрируется высокая летальность в связи с тем, что болезни чаще протекают на фоне иммунодефицитов.

Проблема иммунной недостаточности у молодняка сельскохозяйственных животных выходит на первое место, особенно при переводе хозяйств на промышленную основу и создания комплексов с большой концентрацией поголовья животных на малой территории. Это способствует тому, что у животных создается недостаточный иммунный фон и возможно снижение напряженности иммунитета. Болезни органов пищеварения у молодняка, как правило, протекают на фоне пониженной резистентности организма. Поэтому разработка новых препаратов и схем лечения желудочно-кишечных заболеваний у молодняка, способствующих повышению неспецифической резистентности, является перспективным направлением.

В связи с вышеизложенным, проблема поиска новых биологически активных препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка весьма актуальна.

Хитозан в настоящее время используется в различных областях народного хозяйства. Особого внимания заслуживает применение его в ветеринарии и медицине. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, об-

ладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П., 2002; Быкова В.М., Немцев СВ., 2002; Allan G.G., Peyron M., 1989).

Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (рН 5-6). Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а также на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высокой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, стимулирует клеточных и гуморальный иммунитет (Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев СМ., Фролова М.А., 2001; Червинец В.М., Бондаренко В.М., Комаров Б.А., 2002; Muzarelli r.a.a., 1988). Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб.

В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной степени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгиста-тические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А., 2003; Червинец В.М., Албулов А.И., Червинец Ю.В., 2006).

Туберкулез наносит значительный экономический ущерб животноводству страны, что связано с широкой распространенностью болезни, необходимостью убоя реагирующих на туберкулин животных в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и населенных пунктах (Смолья-нинов Ю.И., Донченко А.С и др., 2005.). Поэтому поиск новых препаратов для антимикробной терапии туберкулеза и других заболеваний является на сегодняшний день актуальной задачей (Капков Л.Г., Smith J., Wood E., Domish M., 2004).

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров во многих областях, в том числе вете-

ринарии и медицине. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен. Хитозан, благодаря уникальной структуре и положительному заряду, является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др., что определяет перспективы его использования в качестве ингибитора липолитических ферментов (Sumiyoshi M., Mhurchu С).

Изучение биоактиоксидантов показало их существенную роль в поддержании уровня свободно радикальных реакций и регулировании обмена липидов в мембранах клетки. Важно, что существование системы регуляции было обнаружено практически для всех изученных внутриклеточных и клеточных мембран клеток животных, растительных организмов и микроорганизмов.

Важнейшим элементом поддержания здоровья животных а, значит, продуктиности и сохранности) являются доброкачественные корма, т.е. корма, свободные от чужеродных вредных для организма веществ. Одни из самых опасных чужеродных примесей - микотоксины (ядовитые низкомолекулярные метаболиты плесневых микроскопических грибов). Даже следы микотоксинов в кормах (30-100 мкг/кг) приводят к потере продуктивности, снижению иммунитета и воспроизводительных функций. Особо актуальна проблема микотоксинов у тех видов, у которых основу рациона составляет зерно и продукты его переработки у птиц.

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных (Сафонов Г.А., Калинина Т.А., Романова В.П., 1992; Панин А.Н., Серых Н.И., 1993; Сидоров М.А., Субботин В.В., 1988; Тихонов И.В., Гаврилов В.А., 2003).

На основании литературных данных известно, что к числу высокоэффективных лечебно-профилактических средств специалисты относят пробио-тики (Воронин Е.С., 1989; Панин А.Н., 2000; Fuller R., Gibson G., 2000 и др.). По мнению многих специалистов, основополагающим принципом при создании пробиотиков является использование микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры животных (Бовкун Г.Ф., 1999; Сидоров М.А., 2000; Berg R., 1998 и др.).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки. Использование пробиотиков в ветеринарии затрагивает довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишечного биоценоза и распространении на коррекцию иммунной, гормональной и ферментной систем молодняка животных (Вилыпанская Ф.Л., 1987; Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б., 1995; Грачева Н.М., Партий О.С, Леонтьева Н.И., 1996; Парфенов А.И., 1998; Малик Н.И., 2002).

Широкое применение в медицине и ветеринарии препаратов на основе лактобацилл и бифидобактерии при острых кишечных инфекциях и дисбак-териозах показало их эффективность и перспективность (Малик Н.И., 2000; Субботин В.В., и др., 2001).

Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на промышленную основу производства, является птицеводство. Доля препаратов для птиц составляет 95% мирового рынка лечебных препаратов для животных (более 7 млрд. долларов в стоимостном выражении).

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилактики, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности птицы, улучшения качества конечного продукта. Один из способов ее решения - разработка и применение биологически активны веществ (БАВ) нового поколения, которые характеризуют высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта птицы, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относят эубиотики - пробиотики и пребиотики (Антипов В.А., 1991; Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., 2003; Данилевская Н.В., Субботин В.В., 2005).

Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков.

Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммунитет, зоотехнические показатели, могут служить естественными стимуляторами роста и обладать токсико- и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших. Эффективность решения этой проблемы определяется использованием качественно новых методов производства продуктов питания, а также привлечением новых сбалансированных источников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганизмов. Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности использования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В.А., 1975; Беликов В.М., 1977; Шкляр Б.Х., 1977; Латов В.К., 1990; Римарева Л.В., 1993; Иванова Л.А., 1998; Неклюдов А.Д., 2000; и др.).

Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрожжевая биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, аминокислотный набор которых приближается к животному белку, а также безопасностью и абсолютным отсутствием токсичности дрожжей. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать дрожжи как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок.

Природные цеолиты обладают уникальными свойствами адсорбции, ионообменной, каталитической и детоксикационной способностью. Благодаря своему кристаллохимическому строению цеолиты биохимически активны и кислотоустойчивы. Поэтому их применение в различных отраслях постоянно расширяется.

В настоящее время животноводство и птицеводство в России испытывает большую потребность в кормовых белковых продуктах для своего развития и становления. Особенный дефицит кормовых белковых продуктов стал заметно ощущаться в настоящее время, так как в 90-х годах были остановлены крупнотоннажные заводы БВК, производящие кормовые дрожжи на основе углеводородов «паприн» (Ермишина И.Г. и др., 2005). Кормовые белковые продукты, полученные на основе микробиологического синтеза, по своему химическому составу и питательной ценности не уступают традиционным белковым кормам, таким, как соевый шрот, мясокостная мука, рыбная мука и др.

Сложившаяся в мире ситуация с потреблением мяса и мясных продуктов требует рационального использования сырья, повышения эффективности производства и улучшения качества готовой продукции. Для решения вышеуказанных проблем необходимо разрабатывать и внедрять в производство новейшие методы обработки мяса с целью использования при производстве различных мясопродуктов не только высокосортного сырья, но и сырья, обладающего повышенной жесткостью и требующего длительной термообработки (Рогова Н.В., Снегур Ф.М. и др., 2007)

При разработке методов обработки низкосортного сырья, содержащего большой процент соединительной ткани, необходимо учитывать, чтобы метод не приводил к потере массы, не ухудшал органолептические свойства и технологические характеристики готового продукта и позволял интенсифицировать процесс производства мясопродуктов, отличающихся высокой пищевой и биологической ценностью.

Следовательно, исследования, теоретическое обоснование и разработка новых биологически активных веществ (БАВ) для нужд ветеринарии являются актуальными.

1.2.Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований

- разработка теоретического обоснования и практического применения существующих и разработка принципиально новых биологических веществ с использованием современных методов биотехнологии для нужд ветеринарии. Для решения цели исследований были поставлены следующие задачи:

1 .Теоретически обосновать использование БАВ в ветеринарной практике. 2.Исследовать влияние хитозана на механизм гомеостаза и гуморальную и неспецифическую защиту организма у животных.

3.Изучить антибактериальную активность хитозана к штаммам микобак-терий и, в частности, для профилактики и лечения туберкулеза.

4.Провести работы по активации хитозана для повышения его сорбцион-ных свойств при использовании в качестве кормовых добавок для КРС. 5.Исследовать антиметастическую активность олигомеров хитозана и его применение в сочетании с экстрактом противоонкологического фитосбора.

6.Изучить антиоксидантную активность и ранозаживляющую способность хитозана при использовании на животных.

7.Обосновать использование коллагеназы, пробиотиков, синбиотиков для профилактики и лечения в ветеринарии.

8.Изучить возможность использования в качестве кормовых добавок и компонентов питательных сред цеолита, автолизата хлебопекарных дрожжей, яично-дрожжевого гидролизата для использования в различных отраслях сельского хозяйства.

9.Осуществить практическое использование рассмотрение БАВ в ветеринарии.

10.Рассчитать предполагаемую экономическую эффективность от широкого применения исследованных БАВ в ветеринарии.

1.3. Научная новизна. Применение препаратов низкомолекулярного сукцината хитозана вызывает усиление функционирования механизмов го-меостаза у животных (телят), усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также активирует факторы, характеризующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

Впервые экспериментально подтверждено, что хитозан обладает бакте-риостатическим и ранозаживляющим действием по отношению к патогенным возбудителям заболеваний животных и птиц и при нанесении им химических и термических ожогов.

Впервые разработана методика активации хитозана, которая позволила получить сорбент с емкостью на 40-60% больше, чем у исходного полимера. Показано, что акцинат и сукцинат хитозана со степенью деацетилирования 87-97% и молекулярной массой 50-250 кДа обладает максимальной сорбционной емкостью (80-10 мг/г) и успешно испытан на животных и птицах.

Показано, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловливает ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана оказало ра-диопроекторное действие.

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6% у животных опытных групп по сравнению с контролем.

Антиметастатический синергизм действия в фитохитодезтерапии возможен при сочетании олигомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнаруженный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергети-ческого антиоксидантного (и, по-видимому, поливакцинного) действия экстрактов лекарственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосборов и при сочетании с полиэлектролитами природного происхождения.

Разработана технология получения фитохитодезов - биологически активных добавок к пище, состоящих из сухих экстрактов сбора лекарственных растений и хитозана полифракционного состава в виде его водорастворимой формы.

Впервые в результате анализа полученных экспериментальных данных установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы улучшает качественные характеристики готового продукта при внесении его в мясное сырье.

Впервые разработанный кормовой белок-добавка - синбиотик «Правита» по сравнению с другими кормовыми белковыми продуктами обладает более высокой питательной ценностью и биопротекторными свойствами в качестве кормовой добавки для птиц.

Результаты исследования кормовой биологической добавки (цео-лит+культура Echerichia coli VL 613) подтвердили ее эффективность взамен дорогого кристаллического лизина.

Разработанная кормовая добавка с использованием цеолита при добавлении в питательную среду была успешно использована при культивировании клеток перепелиных эмбрионов глубинным способом, позволила увеличить конечную концентрацию клеток.

Все изготовленные серии препарата для борьбы с личинками кровососущих комаров Aedes aegipty с использованием культуры B.thusingiensis H-14 шт. 1501 и автолизата хлебопекарных дрожжей в качестве компонента питательной среды по биологической активности соответствовали требованиям НТД и оказались эффективными.

Применение яично-дрожжевого гидролизата в качестве лечебно-профилактической добавки для подкормки пчел, обеспечивает профилактику заболевания пчел - нозематоза, компенсации белковой недостаточности и ускорения процессов жизнедеятельности пчелиных семей.

Впервые установлено, что бактерии L.planturum, шт. М-30 и B.subtilis,

шт. В-1948, обладают достаточным уровнем антогонистической активностью к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Кроме того, они обладают достаточным уровнем устойчивости к широкому кругу антибиотиков, что позволяет сочетать антибиотическую и пробиотическую терапию в случае эпидемии в хозяйствах.

1.4. Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований были использованы при совершенствовании технологий производства хитозана, биопрепаратов, используемых для профилактики, лечения, а также повышения резистентности и продуктивности животных. Аттестовано производство и получено Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных. Зарегистрировано в Российской Федерации. Утверждено заместителем Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосаниарному надзору Е.А.Непоклоновым 15 мая 2007г.

1.5. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

- Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП,
Щелково, 2007г.;

- Ш Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству, Москва, 2007г.

1.6. Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

1. Теоретическое обоснование и практическое использование хитозана для гуморальной и неспецифической защиты организма животных, по антибактериальной активности, сорбционных свойств, антиметастической активности и оксидантной активности для профилактики и лечения в ветеринарии.

2. Использование ферментного препарата коллагеназы для улучшения качественных характеристик мяса и мясных продуктов.

3. Теоретическое обоснование и практическое применение пробиотиков, синбиотиков в сельском хозяйстве.

4. Исследование и практическое применение различных кормовых добавок и компонентов питательных сред при выращивании бройлерных цыплят, препаратов против кровососущих, нематоза пчел, антибиотико- и пробиотикоскопию и повысить эффективность фитопрепаратов на основе хитозана в случае угрожающей ситуации в сельском хозяйстве.

1.7. Публикации. По результатам диссертации опубликовано работ, в
том числе статей в научных журналах, докладов в сборниках научных конференций.

1.8. .Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 192 страницах машинописного текста и состоит из следующих

разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсужде-

ние полученных результатов, выводы и данные о практическом использовании научных выводов, список использованной литературы 348 источников, в

том числе 217 отечественных и 131 зарубежных. Работа содержит 18 таблиц, 9 рисунков, 52 страницы приложений.

Научная новизна

Цель и задачи исследований: Цепь настоящих исследований: - разработка теоретического обоснования- и практического применения существующих и разработка принципиально новых биологических веществ с использованием современных методові биотехнологии для нужд ветеринарии. Для решения цели исследований были поставлены следующие задачи: 1 .Теоретически обосновать использование БАВ в ветеринарной практике. 2.Исследовать влияние хитозана на механизм гомеостаза и гуморальную и неспецифическую защиту организма у животных. 3.Изучить антибактериальную активность хитозана к штаммам микобактерий с целью дальнейшего использования этих свойств для профилактики и лечения туберкулеза. 4.Провести работы по активации хитозана для повышения" его сорбцион-ных свойств при использовании в качестве кормовых добавок для крупного рогатого скота. 5.Исследовать антиметастическую активность олигомеров хитозана и его применение в сочетании с экстрактом противоонкологического фитосбора. б.Изучить антиоксидантную и ранозаживляющую активность хитозана с использованием лабораторных животных. 7.0босновать использование коллагеназы, пробиотиков,- синбиотиков для профилактики и лечения в ветеринарии. 8.Изучить возможность использования в качестве кормовых добавок и компонентов питательных сред цеолита, автолизата хлебопекарных дрожжей, яич-но-дрожжевого гидролизата для дальнейшего применения в различных отраслях сельского хозяйства. 9.0существить практическое использование разработанных и сследованных БАВ в ветеринарии. Ю.Рассчитать предполагаемую экономическую эффективность от широкого применения исследованных БАВ в ветеринарии.

Научная новизна Применение препаратов низкомолекулярного сукци-ната хитозана вызывает усиление функционирования механизмов го-меостаза у животных (телят), усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также активирует факторы, характеризующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

Впервые экспериментально подтверждено, что хитозан, обладает бакте 13 риостатическим и ранозаживляющим действием по отношению к патогенным возбудителям заболеваний животных и птиц и при нанесении им химических и термических ожогов.

Впервые разработана методика активации хитозана, которая позволила получить сорбент с емкостью на 40-60% больше, чем у исходного полимера.

Показано, что акцилат и сукцинат хитозана со степенью деацетилирования 87-97% и молекулярной массой 50-250 кДа обладает максимальной сорбционной емкостью (80-10 мг/г) и успешно испытан на животных и птицах.

Показано, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловливает ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана оказало радиопротекторное действие.

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6% у животных опытных групп по сравнению с контролем.

Антиметастатический синергизм действия в фитохитодезтерапии возможен при сочетании олигомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнаруженный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергетического антиоксидантного (и, по-видимому, поливакцинного) действия экстрактов лекарственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосборов и при сочетании с полиэлектролитами природного происхождения.

Разработана технология» получения фитохитодезов - биологически активных добавок к пище, состоящих из сухих экстрактов сбора лекарственных растений и хитозана полифракционного состава в виде его водорастворимой формы.

Впервые в результате анализа полученных экспериментальных данных установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы улучшает качественные характеристики готового продукта при внесении его в мясное сырье.

Впервые разработанный кормовой белок-добавка - синбиотик «Правита» по сравнению с другими кормовыми белковыми продуктами обладает более высокой питательной ценностью и биопротекторными свойствами в качестве кормовой добавки для птиц.

Результаты исследования кормовой биологической добавки (цео-лит+культура Echerichia coli VL 613) подтвердили ее эффективность взамен дорогого кристаллического лизина.

Разработанная кормовая добавка с использованием цеолита при добавлении в питательную среду была успешно использована при культивировании клеток перепелиных эмбрионов глубинным способом, позволила увеличить конечную концентрацию клеток.

Все изготовленные серии препарата для борьбы с личинками кровососущих комаров Aedes aegipty с использованием культуры B.thusingiensis Н-14 шт. 1501 и автолизата хлебопекарных дрожжей в качестве компонента питательной среды по биологической активности соответствовали требованиям НТД и оказались эффективными.

Применение яично-дрожжевого гидролизата в качестве лечебно-профилактической-добавки для подкормки пчел, обеспечивает профилактику заболевания пчел - нозематоза, компенсации белковой-недостаточности и ускорения процессов жизнедеятельности пчелиных семей.

Впервые установлено, что бактерии L.planturum, шт. М-30 и B.subtilis, шт. В-1948, обладают достаточным уровнем антогонистической активностью к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Кроме того, они обладают достаточным уровнем устойчивости"к широкому кругу антибиотиков, что позволяет сочетать антибиотическую и пробиотическую терапию в случае эпидемии в хозяйствах.

Публикации

Важно, что микроорганизмы, выделенные из одного вида: животного, имеют слабую адгезивную способность кэнтероцитам другого видаживотных, либо не прикрепляются\к ним; совсем (320,322). Поэтому рекомендуется использовать для приготовления пробиотических_ препаратов;микроорганизмы, вьщеленные от животных, для которых этот препарат предназначен. Механизм, с помощью которого лактобацилы прикрепляются; к клеткам: кишечника животных и человека, изучен не достаточно: Назрела необходимость разработки поколения экологически безопасных препаратов; способных.занять свое место в системе мероприятий; по обеспечению запртл животных (76);

По мнению ряда отечественных и зарубежных авторов; (76,100,408;1Г5ЦІ17,ГЩ165; 167-172, 298),наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотики, в состав которых входят живые бактерии; из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза (лактобациллы био-фидобактерии, стрептококки и др.) и экзогенных микроорганизмов (бациллы, дрожжи и др.).

По сообщениям российских ученых, используемые в нашей стране пробиоти-ки ацидофилин, пропиацид, пропиовит, лактобактерин, максилин, руменолакт, энтерацид, бифидумбактерин, ромакол, бактерии SL, ветом и др., как правило, предназначены для профилактики и лечения ЖКБ молодняка, при этом сохранность животных и прирост массы тела повышаются на 2-15%, а продолжительность болезни и тяжесть ее течения уменьшаются на 1-2 дня, снижается острота технологических стрессов (174 - 176).

Согласно (211-214) лечебно-профилактическая эффективность таких препаратов как бифидумбактерин и лактобактерин при ЖКБ новорожденных телят составляет около 90%.

Субботин В.В. (195-198) изучил биологические свойства 15 штаммов микроорганизмов, относящихся к родам Lactobacillus, Streptococcus и Bifidobacterium. Им разработан пробиотик бифацидобактерин (лактобифадол), в состав которого были введены наиболее активные из изученных штаммов -Lacidophilus ЛГ-1 и B.adolescentis В-1. Автор изучил влияние бифапидобактерина на кишечную микрофлору телят и установил, что данный препарат, по сравнению с имеющимися на рынке аналогами, в значительно меньших дозах обеспечивает лечебно-профилактическую эффективность.

Пробиотики - это живые микроорганизмы или ферментированные ими продукты, которые оказывают благотворный эффект на здоровье макроорганизма. Кишечный нормобиоз -качественное и количественное соотношение микрофлоры различных отделов кишечника, которое соответствует физиологической норме конкретного вида животного. Физиологические функции нормальной микрофлоры, кишечника весьма разнообразны, но одной из основных является обеспечение колонизационной резистентности - совокупности механизмов, придающих стабильность самой нормальной микрофлоре и предотвращающих заселение организма хозяина (включая кишечник) посторонними, в том числе и патогенными микроорганизмами. В кишечнике нормальная микрофлора выполняет роль первичного неспецифического барьера, после прорыва которого инициируется включение других неспецифических механизмов защиты (199-201, 204-206). Благоприятное влияние пробиотиков на организм проявляется различными положительными эффектами, назнание которых основывается на применении пробиотикоте-рапии для предупреждения возникновения болезней ЖКТ, хотя эффект от действия данных препаратов в отличие от антибиотиков не столь сильный и быстрый, но более длительный и щадящий. Успех применения пробиотиков состоит в следующем: 1). колонизация ЖКТ пробиотическими микроорганизмами, проявляющимися антагонизм в отношении условно- патогенных и патогенных бактерий, вирусов и грибов; 2). улучшение нарушенного баланса микроорганизмов в кишечнике и устранение дисбактериозов в целом; 3). полезная метаболическая активность - продукция витаминов К, группы В, фолиевой кислоты, гидролиз желчных солей и холестерина; 4).- контроль продукции токсинов в кишечнике, предупреждение их избыточной выработки и попадания в кровоток; 5). оптимизация пищеварения и нормализация моторной функции кишечника путем выработки субстанций оказьшающих морфокинетическое действие; регуляция времени прохождения пиши по ЖКТ за счет участия в метаболизме желчных кислот; 6) компенсация в рационе питания дефицита аминокислот, витаминов и микроэлементов, а также степени усвоения корма; 7).-токсико- ирадиопротективное действие, снижающеевлияниенеблагоприятных экологических факторов.

Изучение влияния фруктоолигосахаридов показало значительное увеличение пробиотиков (лактобацилл, бифидобактерий). При скармливании бобов, сои, употреблении сахарной свеклы, молочной сьшоротки представители полезной микрофлоры размножаются в кишечнике очень интенсивно. Данные пребиотики ускоряют, стабилизируют и усиливают пролиферацию этих бактерий в ЖКТ, что, в свою очередь, влияет на качественный состав биотопа кишечника (30,62,66,76,126,123,273,278). Применение ФОС началось в Японии в 80- ых годах в качестве сахарозаменителей, но в дальнейшем, благодаря функциональным свойствам, они приобрели более важное значение. ФОС подразделяют на два вида: 1) инулин - из таких растений как аспарагус, сахарная свекла, лук, артишок и 2) инулиноподобный фруктан микробного происхождения.

Применение препаратов-синбиотиков в птицеводстве является несомненно актуальным на данном этапе развития отрасли, поскольку высокая интенсивность технологии приводит к уменьшению естественной резистентности организма птицы и настоятельно требует проведения внешней коррекции состояния сё здоровья (в том числе с помощью биопрепаратов - вакцин и пробиотиков).

Применение низкомолекулярного сукцината хитозана в качестве иммуномодулятора при вакцинации телят против пастереллеза

Первоначально опыты по определению выживаемости микобактерий были проведены на атипичном тестовом штамме M.smegmatis. Клетки M.smegmatic инкубировали с хитозаном краба с ММ-4-396 кДа и хитозаном восковой моли с ММ от 7-177 кДа в концентрациях 0,1% при температуре 37 С, на качалке. После этого пробы титровали и высевали на чашки Петри. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные хитозаном. По истечении 72 часов инкубации определяли количество жизнеспособных клеток (КОЕ). Результаты процента гибели клеток представлены на рис. 6 .

Из рис.6 следует, что процент гибели клеток М. smegmatis после 60 мин экспозиции при 37С и рН 6,8 оставлял 0-76% в зависимости от ММ испытанных хитозанов. Наименьшей чувствительностью клетки обладали к высокомолекулярным образцам хитозана с ММ 96 и 177 кДа. Высокомолекулярный крабовый хитозан с ММ 396 кДа в концентрации 0,1 % не обладал антибактерийным действием. Максимальной активностью в отношении клеток микобактерий обладали низкомолекулярные хитозаны с ММ 4-8,5 кДа.

На основании результатов проведенных опытов можно сделать вывод о том, что препараты низкомолекулярного водорастворимого хитозана краба с ММ 4-8,5 к Да и водорастворимые хитозаны из восковой моли с ММ 7-24 кДа эффективно действуют на исследуемый штамм M.smegmatis вызывая от 65 до 76% гибели клеток. Полученные нами результаты еще раз подтвердили данные других авторов о том, что со снижением ММ хитозана его антибактериальная активность увеличивается.

При определении минимального времени взаимодействия низкомолекулярного крабового хитозана с ММ 4 и 24 кДа, низкомолекулярного хитозана из моли с ММ 11 кДа с клетками M.smegmatis пробы отбирали через 10, 30, 80 и 120 мин. Было показано, что уже через 10 мин контакта хитозана с клетками до 70% клеток теряли жизнеспособность (рис. 6).

Таким образом, нами было показано, что хитозан обладает высокой антибактериальной активностью в отношении M.smegmatis. Максимальной способностью ингибировать рост микобактерий обладали низкомолекулярные образцы хитозана.

Все изучаемые хитозаны со свободными аминогруппами проявляли способность ингибировать рост М. avium. Хитозаны с ММ 58 и 87 кДа в концентрации 0.1 % полностью подавляли рост клеток М. avium. Клетки М. bovis менее чувствительны к действию хитозанов с ММ 58 и 87 кДа в концентрации 0,1 %. Процент гибели клеток составил 40% в случае взаимодействия клеток с хитозаном 58 кДа и 50% в случае контакта клеток с хитозаном 87 к Да. К хитозану с ММ 38 кДа бактерии М. avium оказались менее чувствительны. Процент гибели клеток составил 25%. А в случае взаимодействия с хитозаном клеток М. bovis (ММ 38 кДа) в концентрации 0,1% рост бактерий не угнетался.

Снижение антибактериальной активности (ММ 38-кДа; СД 78%)можноюбъ-яснить невысокой СД образца хитозана. Рядом авторов было показано, что степень антибактериальной активности связана не только с молекулярно-массовым распределением у хитозана, но и со СД хитозана. С увеличением СД количество NH2 групп хитозана увеличивается, следовательно, хитозан с большей СД обладает большим положительным зарядом. В результате чего хитозан способен взаимо 63 действовать с. анионными группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонентами бактериальной поверхности, вызывая их гибель. Следовательно, можно предположить, что хитозан, обладающий отрицательным зарядом, не должен оказывать на микроорганизмы антибактериального воздействия. Для проверки данного предположения клетки М. bovis и М. avium подвергли обработке хитозаном, имеющим отрицательный эаряд N-CVKUHHH хитозан с ММ 380 кДа. Результаты исследования показали, что N-сукцинил хитозан не обладает антимикробными свойствами в отношении ми кобактерий. Полученные результаты согласуются с литературными данными, где отмечается, что перемена знака заряда на противоположный ведет фактически к утрате антибактериальных свойств хитозана.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что хитозан обладает бактерио-статическим действием по отношению к возбудителю туберкулеза видов M.bovis и М avium, что указывает на перспективность дальнейших исследований с целью применения его для лечения и профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных и птиц.

Наиболее выраженный антимикробный эффект в отношении всех изучаемых тест-культур показали препараты кислоторастворимого хитозана с молекулярной массой (ММ) 58 и 87 кДа и степенью деацетилирования 80-80,3% (см.табл. 4). Отмечено отсутствие роста М. avium при содержании хитозана в среде в концентрации 0,05-0,3%; М. Bovis - 0,1-0,3%). Более низкие концентрации хитозанов вызывали торможение роста вышеназванных штаммов. Торможение роста М. intracellulare отмечено при 0,05-0,3% хитозана. Хитозан с ММ 87 кДа задерживал рост этого штамма при концентрации в среде 0,2-0,3%.

Влияние ферментного препарата коллагеназы на функционально-технологические свойства мясопродуктов

Использование препаратов низкомолекулярного сукцината хитозана вызывает усиление функционирования механизмов гомеостаза у животных (телят), усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также активирует факторы, характеризующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

Низкомолекулярный хитозан отличается от нативного достаточно узким молекулярно-массовым распределением, что придает ему определенные четко выраженные свойства. Например, фракция с молекулярной массой 80-150 кДа обладает высокой адгезивной, сорбционной и пленкообразующей активностью, хитозан с молекулярной массой 30-50 кДа оказывает стимулирующее действие на кишечную микрофлору, фракции 15-25 кДа легко проникают в кровь, с чем связана иммуномодулирующая и адаптогенная активность хитозана.

Атипичные микобактерии, как и возбудители туберкулеза, вызывают сенсибилизацию к туберкулину крупного рогатого скота. Они широко распространены во внешней среде и, попадая в организм, обуславливают повышенную чувствительность к туберкулину у млекопитающих. Данные бактерии используют как. тестовые при разработке дезинфицирующих препаратов при туберкулезе КРС. К хитозану с ММ 38 кДа бактерии M.avium оказались менее чувствительны (процент гибели клеток составил 25%), а в случае с M.bovis рост бактерий не угнетался. Вероятно, снижение антибактериальной активности связано с невысокой степенью деацетилирования образцов хитозана (СД 78%). С увеличением степени деацетилирования у хитозана увеличивается количество NH2 - групп, что позволяет ему оказывать на микроорганизмы антибактериальное воздействие. Хитозаны, обладающие свободными аминогруппами, оказывали влияние на рост микобактерий. Наличие NH2-групп хитозана придает полимеру положительный заряд, в результате чего он способен взаимодействовать с анионными группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонентами бактериальной поверхности, вызывая их гибель. Экспериментальные данные подтвердили, что хитозан обладает бактериостатическим действием по отношению к возбудителям туберкулеза.

Антибактериальная активность хитозана характеризуется воздействием хитозана на патогенную микробную флору посредством связывания макромолекул поликатиона с клеточной стенкой микроорганизмов, что приводит к нарушению адсорбентом целостности наружной микробной мембраны, в состав которой входят липополисахариды, гликопротеиды и фосфолипиды. Нарушение защитной микробной оболочки способствует большей уязвимости микроорганизма и повышению его чувствительности к антибиотикам. Про-тивомикробный эффект олигомеров хитозана также связан с их способностью проникать внутрь бактерий и влиять на механизм репродукции микробных тел. Кроме собственного антибактериального действия, хитозан может способствовать повышению чувствительности к антибиотикам некоторых устойчивых к ним микроорганизмов.

Роль сорбентов в различных областях жизнедеятельности человека и животных весьма существенна. Их широко применяют в промышленности, сельском хозяйстве, научных исследованиях. Особое место процессы адсорбции и абсорбции занимают в клетках и тканях животных и растений, в обмене веществ и, в частности, в процессах пищеварения и выведения из организма остатков пищи.

Методы лечения, основанные на процессах связывания и эвакуации из организма через желудочно-кишечный тракт с лечебной или профилактической целью эндогенных и экзогенных веществ, надмолекулярных структур и клеток, называются энтеросорбцией. Для этого используются различные эн-теросорбенты - вещества в твердом или гелевидном состоянии, которые, проходя через кишечную трубку и химически не видоизменяясь, сорбируют (поглощают) токсичные продукты.

К таким веществам относятся сорбенты на основе полиаминосахаридов хитина и хитозана, а также их производные, полученные из панцирей крабов, креветок и других гидробионтов. При применении в качестве энтеросорбента хитозан демонстрирует ряд уникальных возможностей: высокие сорбцион-ные свойства, способность угнетать избыточное выделение соляной кислоты желудком, позитивное влияние на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта.

Основным показателем высокой сорбционной емкости полимера является наличие нескольких функциональных групп в молекуле хитозана . Хитозан обладает большой селективностью и сорбционной емкостью по отношению к ионам металлов. Возможность применения хитозана как энтеросорбента в течение многих лет изучается отечественными и зарубежными исследованиями, которые подтверждают, что хитозан целесообразно использовать для фармакологической коррекции аномального содержания тяжелых металлов и радионуклидов.

Разработана методика активации хитозана, которая позволила получить сорбент с емкостью на 40-60% больше, чем у исходного полимера. Показано, что ацетат и сукцинат хитозана со степенью деацетилирования 87-97% и молекулярной массой 50-250 кДа обладают максимальной сорбционной емкостью (80-10 мг/г) и успешно испытаны на животных и птицах.

Повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловливает ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана оказало радиопротекторное действие.