Введение к работе
Актуальность исследования
Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые в течение многих лет службами здравоохранения большинства государств по предотвращению распространения гепатита С (ГС), эта инфекция и в настоящее время является актуальной мировой проблемой. По данным экспертов на земном шаре насчитывается более 500 млн. человек, инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), в Российской Федерации их число приближается к 5 млн.
Ситуацию в значительной мере осложняет отсутствие вакцины против ГС и высокая частота протекания инфекции в скрытой бессимптомной форме. Поэтому актуальными задачами для здравоохранения всех стран являются: профилактические меры по снижению риска заражения ВГС, повышение эффективности выявления инфицированных лиц и проведение действенной противовирусной терапии. Для диагностики гепатита С в настоящее время применяется комплекс методов, включающих определение в сыворотке крови обследуемых людей антител к вирусным антигенам с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблота, а также обнаружение вирусной РНК ВГС с использованием технологий амплификационного тестирования нуклеиновых кислот (NAT).
NAT-тесты актуальны в трансфузиологии, так как позволяют выявлять РНК ВГС в ИФА-отрицательных пробах крови, полученных в период сероконверсионного окна (Жибурт и др., 2006). В современные алгоритмы первичного обследования и проведения противовирусной терапии NAT-тесты включены для выявления, количественного определения и генотипирования ВГС (в зависимости от генотипа ВГС назначают дозы препаратов и продолжительность лечения).
Российские медицинские учреждения в настоящее время не располагают достаточным ассортиментом диагностических наборов отечественного производства с требуемыми аналитическими характеристиками и актуальными для лабораторной диагностики потребительскими качествами. Представленные на отечественном рынке импортные диагностические тесты ведущих мировых производителей ограниченно доступны вследствие высокой стоимости. Поэтому для существенного улучшения ситуации с NAT-тестированием ВГС в России актуальна разработка и внедрение новых отечественных диагностических наборов.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является разработка, валидация и апробация наборов реагентов для количественного определения и дифференциации генотипов 1, 2, 3 вируса гепатита С на основе ПЦР в реальном времени.
Задачи исследования
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
подобрать специфические праймеры и зонды для выявления РНК ВГС; выполнить оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени; совместить этапы обратной транскрипции и ПЦР;
-
провести оптимизацию методики проведения количественного анализа путем разработки алгоритмов обработки исходных флуоресцентных данных.
-
разработать композицию праймеров и генотип-специфичных флуорогенных зондов, обеспечивающую максимальную специфичность и позволяющую в одной пробирке одновременно выявлять генотипы 1, 2 и 3 ВГС; провести оптимизацию условий проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени;
-
на основе проведенных исследований разработать диагностические наборы для выявления РНК и генотипирования ВГС; определить их основные аналитические и диагностические характеристики; провести апробацию.
Научная новизна
В рамках разработки процедуры проведения количественного анализа предложен алгоритм устранения разрывов/выбросов в графиках флуоресцентных кривых с последующей обработкой фильтром высокочастотного шума. Такой алгоритм позволяет значительно повысить точность анализа при наличии в флуоресцентных кривых скачков и разрывов.
Предложен оригинальный алгоритм введения поправки на внутренний контрольный образец (ВКО) для учета потерь НК в процессе про-боподготовки, суть которой заключается в смещении значения Cq ВГС на Д Cq ВКО относительно среднего Cq ВКО по всей постановке.
При достигнутой воспроизводимости анализа (SD<0,3 logw(KOH4., МЕ/мл) и линейности (с эффективностью амплификации около 100%
во всем диапазоне определяемых концентраций) предложен метод определения вирусной нагрузки с одним образцом сравнения, что позволило повысить производительность теста.
Предложен оригинальный подход к дизайну генотип-специфичных зондов. Зонды с новым дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены. Основными преимуществами бинарных зондов является высокая специфичность и возможность типирования мононуклеотидного полиморфизма, расположенного в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов (по сути, альтернатива коротким зондам с дорогостоящими модификациями, повышающими Тт, такими как LNA, MGB).
Практическая значимость
Разработанный подход для выявления и количественного определения РНК вируса гепатита С в сыворотке (плазме) крови с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступного набора реагентов «РеалБест РНК ВГС», выпускаемого ЗАО «Вектор-Бест» и прошедшего государственную регистрацию. Разработанный тест может использоваться как для высокочувствительного скринирования донорской крови, так и в клинической практике для:
подтверждения диагноза гепатит С,
ведения больных с хроническим гепатитом С,
определения активности ВГС-инфекции,
принятия решения о начале терапии,
прогнозирования исхода терапии и необходимости ее продолжения,
определения вирусологического ответа на противовирусную терапию.
Разработан подход к дизайну бинарных генотип-специфичных зондов, позволяющих типировать мононуклеотидный полиморфизм, в пределах непротяженного консервативного участка 10-12 нуклеотидов.
Разработанный набор для дифференциации генотипов 1, 2 и 3 с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени лег в основу коммерчески доступных наборов реагентов «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип», выпускаемых ЗАО «Вектор-Бест» и прошедших государственную регистрацию.
Разработанный набор «РеалБест РНК ВГС-генотип» для комплексной ПЦР-диагностики ВГС включает реакционную смесь для выявления, количественного определения РНК и реакционную смесь для генотипирования ВГС. Набор с такой комплектацией удобен для применения в клинической практике на этапе обследования пациентов до начала проведения противовирусной терапии для комплексной ПЦР-диагностики ВГС.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработанный алгоритм проведения количественного анализа позволяет достигнуть высокой воспроизводимости результатов анализа за счет предложенной системы обработки исходных флуоресцентных данных и процедуры определения вирусной нагрузки с возможностью учета потерь НК в процессе пробоподготовки, а также эффективности амплификации.
-
Зонды с оригинальным дизайном, названные бинарными, позволяют дифференцировать последовательности, содержащие одиночные замены.
-
Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС» обладает следующими характеристиками:
аналитическая чувствительность 15 МЕ/мл
аналитическая специфичность-100%
линейный диапазон измеряемых концентраций - 102-107 МЕ/мл
сходимость (прецизионность) - коэффициент вариации количественных оценок в логарифмических единицах варьировал от 0,5 до 3,5% при концентрациях вирусной РНК 104-107 МЕ/мл и от 2,5 до 12% при концентрациях вирусной РНК 102-103 МЕ/мл.
4. Набор реагентов «РеалБест РНК ВГС 1/2/3» обладает следующи
ми характеристиками:
аналитическая чувствительность - 400 МЕ/мл
аналитическая специфичность - 100%.
Апробация работы и публикации
Налажено серийное производство наборов, разработанных в ходе настоящего исследования на базе ЗАО «Вектор-Бест». Для наборов «РеалБест РНК ВГС», «РеалБест РНК ВГС-1/2/3» и «РеалБест РНК ВГС-генотип» получены государственные регистрационные удостоверения № ФСР 2008/02288, № ФСР 2010/09021 и № ФСР 2010/09022, соответ-
ственно. По результатам исследований опубликовано 4 работы в научных журналах, 3 из которых входят в перечень ВАК. Работа была представлена на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г. в Новосибирске и на V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров в 2009 г. в Москве, а также доложена на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в 2009 г.
Объем и структура диссертации
Похожие диссертации на Количественное определение вируса гепатита C методом ПЦР в реальном времени и его генотипирование с использованием флуорогенных бинарных зондов
