Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Экология города 8
1.1.1 Экологические функции газонов 9
1.1.2 Состояние газонов в городах 10
1.2. Действие тяжелых металлов на растения 11
1.2.1 Влияние тяжелых металлов на рост и развитие растений 11
1.2.2. Действие тяжелых металлов на клетки растений 18
1.2.3. Устойчивость растений к тяжёлым металлам (ТМ) 23
1.3. Влияние засоления на растения 29
1.4. Клеточная селекция 36
1.4.1. Клеточная селекция на устойчивость к засолению 36
1.4.2. Клеточная селекция на устойчивость к тяжелым металлам 43
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 47
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
3.1. Экологическая экспертиза противогололёдных материалов (ПГМ) 52
3.1.1. Испытание фитотоксичности ПГМ в фазе вегетативного роста растений
при внесении водных растворов реагентов в почву 57
3.2. Разработка условий получения и культивирования каллуса и регенерации растений 59
3.3. Получение газонных трав, толерантных к засолению 62
3.3.1. Определение чувствительности культивируемых тканей и растений к NaCl 62
3.3.2. Получение солеустойчивых клеточных клонов и растений 67
3.3.3. Характеристика растений-регенерантов 71
3.3.4. Проверка наследования признака солеустойчивости 74
3.3.5. Проверка устойчивости к бишофиту растений, толерантных к NaCl... .80
3.4. Получение растений, толерантных к ионам меди 83
3.4.1. Определение чувствительности культивируемых тканей и растений к меди 83
3.4.2. Отбор и характеристика толерантных к меди растений 88
3.5. Эффективность клеточной селекции 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
ВЫВОДЫ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
Введение к работе
Один из важнейших элементов озеленения городов - создание газонов различного назначения. Их роль в условиях нарушенной экологии городов непрерывно растет. Газоны имеют не только декоративное значение, но и выполняют огромную экологическую, санитарно-гигиеническую роль,
Ф оздоравливают окружающую среду, защищают почву от водной и ветровой
эрозии, а город от пылевых образований. Газоны оказывают успокаивающее действие на человека, снимают усталость.
Газоны, расположенные в городе, постоянно испытывают действие техногенных и антропогенных факторов. Среди техногенных факторов
Р*' наибольшую опасность представляют соли тяжелых металлов.
В последние годы из-за использования противогололедных смесей в почвы весной наряду с тяжелыми металлами в значительном количестве поступают соли. Это приводит к неблагоприятному для роста и развития растений изменению химических и физико-химических свойств почвы. Хлоридный ион, составляющий 50% используемых противогололедных смесей, один из самых агрессивных компонентов городских почв. Весной около многих автомагистралей и на улицах города засоление почв достигает среднего и сильного значения от 0,4 до 1% (Шевякова и др., 1997, 2000). Такое засоление является пределом для нормального роста и
^ развития большинства видов древесно-кустарниковых растений и газонных
трав. В Москве гибель более половины деревьев вызвана ненормированным применением противогололедных средств. Характерное действие
загрязняющих веществ на городские газоны - «краевой эффект», состоящий в образовании не покрытых растительностью участков придорожных газонов вдоль проезжей части.
Данные экологические проблемы решаются неэффективно, погибшие от засоления виды растений заменяются теми же видами, которые ждет та же участь. Решение данной проблемы - создание растений, устойчивых к неблагоприятным факторам мегаполиса и жесткий контроль за экологической обстановкой города.
Для получения растений, устойчивых к загрязнениям почвы, наряду с традиционными методами селекции перспективно использовать современные биотехнологические подходы, которые уже хорошо зарекомендовали себя при получении растений, толерантных к различным экологическим стрессовым факторам: засухе, засолению, низким и высоким температурам и др. В настоящее время получены клеточные линии, устойчивые к некоторым тяжелым металлам( Гончарук и др., 2001), однако регенерация из них фертильных растений остается серьезной проблемой. Получены клеточные линии перца и кукурузы, устойчивые к осмотическому стрессу (Diaz, 1994, Долгих и др., 1994) растения устойчивые к засолению( Ларина, 1995, Белянская и др., 1995). Информации о получении клеточных линий и растений, устойчивых к промораживанию, низким и высоким температурам мало,болыпих успехов добиться не удалось.
Среди первых работ на устойчивость к замораживанию была работа И.И.Туманова (1977) каллусную ткань Picea abies сначала закаливали
охлаждением, а затем замораживали. Были получены устойчивые клеточные линии, однако получить растения не удалось. Получены клеточные культуры картофеля, устойчивые к морозу, однако растения оказались стерильными (Swaaij, 1986). Получены каллусные культуры кукурузы , толерантные к низким температурам (устное сообщение, Долгих, 1996), единственное сообщение о получении с помощью кулыуры клеток жароустойчивых растений сделано на кукурузе (Долгихи др., 1994).
Цель и задачи исследования
Целью нашей работы было получение с помощью методов биотехнологии газонных трав, толерантных к засолению и солям меди.
Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:
-на основании изучения литературы по загрязнению почв мегаполисов определить диапазоны концентраций хлорида натрия и ионов меди в почве;
-провести оценку фитотоксичности ряда противогололедных реагентов, предложенных для использования в городе Москве;
-на примере 2 практически важных видов газонных трав оптимизировать условия культивирования каллусных культур овсяницы и полевицы и регенерации растений;
-разработать условия клеточной селекции для отбора устойчивых к хлориду натрия и солям меди каллусных линий газонных трав;
- из отобранных каллусных линий, толерантных к хлориду натрия и солям меди, получить растения-регенеранты, устойчивые к этим токсикантам;
-проверить сохранение признаков солеустойчивости и толерантности к меди в следующих поколениях вьщеленных регенерантов.
Экология города
Человек создал совершенно новую среду обитания. Он построил города. Современный город представляет собой уникальную экосистему , характерной особенностью которой является загрязнение окружающей среды. Городская экосистема - это гетеротрофная антропогенная экосистема, имеющая три особенности :
- зависимость, т.е. необходимость постоянного поступления ресурсов и энергии;
- неравновесность, т.е. невозможность достижения экологического равновесия;
- постоянная аккумуляция твердого вещества, приводящая к повышению уровня поверхности города.
Унылое бесплодие каменной кладки и асфальта имеет один аналог в дикой природе - экосистему вулканического пепла и застывшей лавы. Города являются паразитами биосферы, потребляющими огромное количество кислорода, воды и других природных .ресурсов, а продуцируют только углекислый газ. Количество видов, живущих в городе ничтожно мало по сравнению с другими экосистемами. Городское озеленение может уменьшить пагубное влияние экосистем мегаполисов на биосферу и улучшить условия жизни человека внутри города. Зеленые насаждения в условиях города способны задерживать десятки тонн пыли, концентрировать в листьях тяжелые металлы, очищать воздух, инактивировать действие различных патогенов и обогащать воздух кислородом. Однако большинство растении, растущих в городе, не могут адаптироваться к постоянно увеличивающемуся загрязнению окружающей среды.
К экологическим функциям газона относят:
1) улучшение микроклимата, коротко подстриженная зелень способствует интенсивному испарению влаги из почвы, в результате создается повышенная влажность приземного слоя (примерно на 10%). Следствие этого - падение температуры, в жаркое время она на 3-5 градуса ниже по сравнению с мощеным покрытием.
2) в дерновом слое происходит быстрая минерализация органических веществ, способствующая очищению почвы от вредных микроорганизмов.
3) газон оказывает ингибирующее действие на некоторые микроорганизмы, которые находятся в воздухе.
4) газон гасит вибрации и шумы, производимые движение автотранспорта.
5) газон поглощает пыль, приносимую со стороны проезжей части.
6) газон закрепляет почву, предохраняя ее от распыления и сноса водой на мостовые.
В озеленении городов используют специальные газоны для декоративных целей( партерные газоны, мавританский газон, спортивные газоны), для ипподромов, обочин, откосов дорог и др. Однако практически все имеющиеся газоны созданы исключительно для нормальных экологических условий и страдают от неблагоприятного влияния техногенных и антропогенных факторов ( Шевякова и др., 1997, 2000).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами нашего исследования было 2 вида газонных трав: овсяница красная красная (Festuca rubra) и полевица побегоносная (Agrostis stolonifera). Фитотоксичность противогололедных реагентов проверяли на другом виде полевице - полевице гигантской. Растения выращивали в почве в & сосудах в условиях теплицы, при температуре 20 С и естественном освещении.
Условия культивирование каллусных культур и регенерации растений . Первичный каллус получали из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга(МС), содержащей ЗОг/л сахарозы, 500мг/л гидролизата козеина и 7 г/л агар агара.. Концентрация 2,4-Д варьировали в пределах Семена предварительно стерилизовали коммерческим отбеливателем «Белизна». Простерилизованные зерновки раскладывали в чашки Петри на поверхность агаризованной среды ( по 20 семян для овсяницы и 30 для полевицы на чашку) и культивировали при температуре 26 и влажности 70% на свету интенсивностью 2000 лк при длине светового дня 16 час. Через 30 дней культивирования определяли % каллусообразования , как отношение количества семян образовавших каллус к общему количеству семян.
Для роста каллуса использовали среду МС с добавлением от 1 до 3 мг/л 2,4-Д. Раз в месяц клетки пересаживали на свежую питательную среду. Регенерацию растений проводили на среде МС без гормонов, укоренение на среде МС с 2мг/л НУК. Эффективность морфогенеза определяли как долю каллусов, регенерировавших побеги, от общего числа каллусов.
Укоренившиеся регенераты высаживали в почву.
Условия клеточной селекции. Первичный каллус массой 15-20мг высаживали на селективную среду МС содержащей в качестве селектирующего агента 1 или 2% хлорида натрия или 150 мг/л меди. После культивирования в течение 1 месяца отбирали светлые экспланты увеличившиеся в размере. Культивирование отобранных каллусов во Ф пассаже проводили при тех же условиях, что и в первом пассаже.
Регенерацию и укоренение растений также проводили в селективных условиях
Оценку степени токсичности ПГМ и чувствительности к действию реагентов проводили путем проращивания семян овсяницы и полевицы в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной растворами тестируемых реагентов в концентрациях 0,05-1,5%. Всхожесть семян определяли через неделю, как выраженное в процентах отношение проросших семян к общему количеству посаженных семян.
Оценку устойчивости , каллусных культур и растений к засолению и ионам меди, проводили для каллусных тканей по увеличению сырой массы иннокулюмов после месяца культивирования на средах с разным содержание селективных факторов, а для растений по всхожести семян в почве, содержащей NaCl или CuS04 и увеличению массы. Семена обрабатывали марганцовокислым калием и промывали водой. Рост растений оценивали в почве через 2 месяца после посадки, по увеличению средней сухой массы одного растения. В каждом варианте опыта анализировали по 200 семян, 200 растений и 150 каллусов, опыты повторены трижды.
Проверка растений-регенерантов. Полученные из устойчивых клонов растения-регенеранты высаживали в грунт без селективных факторов, состоящий из 3 частей почвы, 1 части торфа и 1 части песка. После адаптации в грунте , для определения солеустойчивости и устойчивости к ионам меди, растения подстригали до высоты 10см, затем вносили в почву в расчете на сухой вес хлорид натрия или сульфат меди путем полива до содержания в почве заданной концентрации хлорида натрия в пределах от 0 до 2% и ионов меди 150мг/кг. Проверка наследования признаков солеустойчивости и устойчивости к ионам меди.
Для проверки наследования соответствующих признаков у растений-регнерантов, выросших в грунте, собирали семена, вьщерживали их при комнатной температуре в сухом виде в течение 6 месяцев. Семена проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге и в почве, анализировали всхожесть и высоту растений в контрольных и селективных условиях
Растения-регенеранты высаживали в почву без селективных факторов. После адаптации в грунте для определения солеустойчивости растения подстригали до высоты 10см, затем вносили в почву NaCl в концентрациях от 0 до 2%. Через месяц оценивали долю выживших и увеличение высоты растений, за 100% принимали средний прирост исходных растений в почве без соли.
Экологическая экспертиза противогололёдных материалов (ПГМ)
Учитывая негативное для растений последствие применения хлористого натрия для борьбы с гололедом, по заданию правительства Москвы рядом организаций предложены новые ПГМ. Нами было проведено сравнительное изучение различных ПГМ на прорастание семян газонных трав полевицы и овсяницы.
Результаты лабораторных испытаний нового поколения ПГМ показали, что выраженное отрицательное действие реагентов на прорастание семян полевицы и овсяницы и на рост растений проявилось, начиная с 0,05 % реагента. С увеличением действующей концентрации токсичность всех реагентов резко возрастала. Летальной концентрацией для прорастания семян для всех реагентов, включая техническую соль, оказалось их содержание в воде 1,0-1,5% (Табл 1,2).
По степени опасности все испытанные реагенты можно отнести к двум группам: к 1-ой группе могут быть отнесены Бишофит, ХКМ твердый и жидкий как относительно безопасные при условии соблюдения принятых норм их расхода в течение зимнего периода. В эту же группу относительно безопасных , по биотестам овсяница и полевица, может быть отнесен также Нордикс-П. В 2-ю группу реагентов с возможными отрицательными последствиями их действия на растения вошли Антиснег-1 и НКММ. Высокая фитотоксичность обоих реагентов проявилась при разведении нативных препаратов (0,5-1 г/ 10000 мл воды), что во много раз превышает степень токсичности NaCl для этой тест-системы.
Для оценки влияния ПГМ на рост растений реагенты вносили в почву в концентрации 0,1-0,5 % и оценивали отрастание трав после скашивания. По сравнению с технической солью несколько меньшую токсичность показали все реагенты, кроме НКММ.
У полевицы не отмечалось значительного угнетения роста в ф присутствии бишофита и хлорида кальция при концентрации в почве 0,5% реагента, (рис. 1 ), реакция овсяницы была подобной. Особо следует обратить внимание на отсутствие выраженной фитотоксичности у Антиснег-1, что отмечали ранее при действии этого реагента на прорастание семян (табл.3 и рис.1).
Тем не менее, опыты с почвенной культурой подтвердили, что НКММ имеет повышенную фитотоксичность по отношению ко всем биотестам и не зависит от видовой специфики исследованных трав.
Результаты, полученные в опытах с внесением реагентов в почву, 1ч указывают, что почвенный поглощающий комплекс может резко изменить реакцию растений на остаточные количества ПГМ после применения их в течение зимы. Это относится к компонентам ПГМ, которые могут связываться в почве органикой и минералами, а также нейтрализоваться в случае кислой рН. Можно полагать, что отсутствие выраженной а фитотоксичности у препаратов, содержащих аммоний, при внесении их в почву вызвано выше указанными свойствами почв. Поскольку все испытанные 111 М обладают определенной фитотоксичностью, актуальной является задача получения растений, толерантных к засолению. Все реагенты первой группы (бишофит, ХКМ) содержат токсичный для растений ион хлора. Кроме того, техническая соль до сих пор , широко применяется в борьбе с гололедом, хотя и обладает большей фитотоксичностью, чем выбранные 111 М. Поэтому при разработке биотехнологии получения устойчивых к 111 М газонных трав в качестве селективного агента был выбран хлорид натрия. Предполагалось, что толерантные к NaCl растения могут проявить перекрестную устойчивость к бишофиту и ХКМ.
