Введение к работе
Актуальность проблемы. По данным FAO к 2030 году ожидается увеличение населения планеты до 8 - 10 миллиардов. В связи с этим в 21-ом веке человечество столкнется с рядом новых трудностей, для решения которых потребуются принципиально новые подходы. Основная проблема, ожидающая человечество в ближайшие десятилетия - продовольственная. Эффективность современного сельскохозяйственного производства не позволит удовлетворить постоянно растущие потребности человечества.
Несмотря на огромные достижения традиционной селекции растений, некоторые проблемы сельского хозяйства решить такими методами невозможно или очень сложно. Хотя селекция ведется уже несколько тысяч лет, но ее общий принцип фактически остался прежним: скрещивание разнородных в генетическом отношении форм и последующий отбор в гибридном потомстве экземпляров с набором желательных признаков. Таким способом происходит совершенствование существующих культур за счет придания им новых ценных качеств. Но этот метод обладает несколькими недостатками, а именно: продолжительностью селекционного процесса, случайностью комбинирования генов в результате рекомбинации, низким выходом нужных генотипов, невозможностью переноса признаков из филогенетически отдаленных видов, потребностью в больших площадях, зависимостью от времени года.
С развитием биологической науки, в селекции, кроме обычного скрещивания, стали использовать и другие методы, такие как мутагенез, клеточная селекция и вегетативная, или соматическая гибридизация. Но, несмотря на возлагавшиеся надежды, все эти методы не произвели ожидавшейся "революции" в селекции сельскохозяйственных культур. Мутагенез характеризуется случайностью мутаций и, как правило, полученные формы растений обладают пониженной жизнеспособностью. Клеточная селекция направлена на реализацию признаков, уже заложенных в геноме исходных форм. Вегетативная, или соматическая гибридизация (слияние протопластов) позволяет преодолеть нескрещиваемость неродственных видов, но сочетание родительских признаков у получаемых форм так же случайно. Введение же определенного гена в организм с минимальным нарушением его генотипа стало возможным лишь с развитием методов генной инженерии.
Генная инженерия - это перенос генов, выделенных из одних организмов, в другие. Главное преимущество генной инженерии в том, что она позволяет перенести отдельный ген, отвечающей за конкретный признак, что исключает случайные комбинации признаков и разрушение уже сложившегося и вполне удовлетворительного генотипа. Универсальность генетического кода позволяет использовать гены, выделенные из любых организмов. Таким образом, становится возможным получение признаков недостижимых методами традиционной селекции, например, получить голубую розу. Опираясь на достижения молекулярной биологии и используя технику "in vitro" становится достижимой цель селекционеров - изменение единственного признака без нарушения сложившегося генотипа сорта. Комбинация методов генетической инженерии и традиционных способов селекции позволяет эффективно объединять полезные признаки, вносимые гетерологичным генетическим материалом и комплекс уникальных сортовых признаков, созданных многолетним трудом селекционеров. В мировой практике в настоящее время уже накоплен большой опыт генно-инженерного модифицирования сельскохозяйственных культур, приобретших после создания или повышения естественной устойчивости к болезням, вредителям и абиотическим стрессам повышенную продуктивность а также улучшенное качество продукции. Трансгенные растения становятся своебразными «растительными фабриками» для производства как препаратов медицинского назначения (антитела, съедобные вакцины и т.п.), так и сырья для биотехнологической промышленности например биодеградабельного пластика или паутинного шелка. Более того, по мере расширения генно-инженерных программ, в практическое использование вовлекаются все новые и новые гены, придающие растениям новые, иногда необычные свойства. Одним из ярких примеров создания по сути новой культуры явилось получение коллективом ученых возглавляемым Инго Потрикусом так называемого «Золотого риса», способного как синтезировать провитамин А, так и аккумулировать достаточное для полноценного питания количество железа. Таким образом генно-инженерным методом удалось преодолеть основные недостатки этой основной для миллиардов людей продовольственной культуры и достичь сбалансированного состава ее питательных компонентов.
Технология генетического модифицирования растений впервые была разработана в середине 80-х годов в целях получения новых трансгенных сельскохозяйственных культур с улучшенными агрономическими характеристиками. Наиболее ярким показателем эффективности технологии генетического модифицирования (молекулярной селекции) являются данные о возделываемых площадях генетически модифицированных (ГМ) культур. Они также отражают темпы коммерциализации научных разработок в этой сфере и их внедрения в производство. Ежегодно на протяжении последних лет США, Бразилия, Аргентина, Канада и Китай являются странами, в которых возделывается подавляющая часть ГМ культур, таких как соя, кукуруза, хлопчатник и рапс. По данным на 2010 год мировая площадь угодий под ГМ культурами составила 148 миллионов га (James, 2011). Прирост по сравнению с 2009 годом составил 10% или 14 млн. га, а по сравнению с 1996 годом площадь под ГМ культурами возросла более чем в 87 раз (от 1.7 до 148 млн. га).
Ведущими ГМ культурами по итогам 2010 года стали: соя - 53% (65.8 млн.га), кукуруза - 30% (37.3 млн.га), хлопчатник - 12% (15.5 млн.га), рапс - 5% (5.9 млн.га). На протяжении периода с 1996 до 2008 года устойчивость к гербицидам являлась неизменно ведущей новой агрономической характеристикой всех ГМ культур, после которой следует устойчивость к насекомым обусловленная Bt-токсином. Так, в 2001 году соя, кукуруза и хлопчатник, устойчивые к гербицидам, занимали 63% (79 млн.га) общей мировой площади ГМ культур, а культуры с геном Bt-токсина - 15% (19.1 млн.га), сорта с двумя- тремя признаками 22% (26.9 млн.га)(James, 2009).
Все приведенные выше статистические данные относятся исключительно к ГМ культурам, которые уже запущены в масштабное производство. Однако этих данных недостаточно для формирования полной картины скорости развития этой сферы знания, а также прогнозирования ожидаемых изменений в мировой сельскохозяйственной индустрии. Эти недостатки компенсируются широко доступной информацией о проводимых в мире полевых испытаниях трансгенных культур. Так, лидирующее место в мире по числу всех ежегодно проводимых полевых испытаний занимают США: с 1987 до 1998 гг общее их число возросло в 120 раз с 9 до 1086, в последующие годы оно равнялось 982 (1999 г), 882 (2000 г), 1111 (2001 г), 845 (2002 г). Из них на долю кукурузы приходится 4049, хлопчатника - 590, картофеля - 777, табака - 227. Необходимо также отметить, что ГМ формы таких ведущих плодово-ягодные культур как яблоня, груша, виноград и земляника по данным департамента сельского хозяйства США также успешно проходят стадию полевых испытаний: яблоня - 62, груша - 10, виноград - 80, земляника - 67 (FTR Database of USA).
Одним из основных направлений, где успешно применяется генетическая инженерия стало решение проблемы устойчивости к насекомым вредителям. В настоящее время в этой области достигнут значительный прогресс, гены, отвечающие за устойчивость к болезням и вредителям, клонированы, охарактеризованы и уже получены трансгенные растения. Одним из первых в растения был перенесен ген Bt-токсина Bacillus thuringiensis, широко применяющегося с 60-х годов инсектицида биологического происхождения (Perlak и др.,1990). Этот инсектицид обладает узконаправленной токсичностью к насекомым и является безвредным по отношению к животным и человеку. Поскольку ген имеет бактериальное происхождение, то экспрессия его в растениях недостаточна для эффективного подавления развития насекомых (тысячные доли трансгенного токсина от тотального белка растительной клетки). В связи с этим были проделаны успешные работы по оптимизации нуклеотидного состава, что позволило увеличить экспрессию в сотни раз. В последние годы уровень экспрессии нативных генов Bt-токсина Bacillus thuringiensis в растениях достигнут путем увеличения в тысячи раз копийности гена при переносе его в хлоропласты биолистическим методом (Mc Bridge и др.,1995).
Другой областью, в которой достигнуты значительные успехи, стала защита растений от вирусных заболеваний (Smith и др.,1994; Nelson и др.,1988). Потери продукции от вирусных заболеваний весьма ощутимы, особенно в отношении тех культур, которые размножаются вегетативно. Открытие в 2000е годы феномена РНК интерференции открывает возможности создания форм растений высокоустойчивых к большинству известных фитовирусов.
В последние годы появляется все больше и больше работ по использованию в селекции плодовых культур методов генной инженерии, которые позволяют преодолеть многие недостатки и ограничения традиционной селекции. Помимо прочих, в отношении плодовых культур генная инженерия обладает еще одним преимуществом. Мировое производство некоторых из наиболее экономически важных плодовых культур умеренной и субтропической зон основано на выращивании всего нескольких сортов. Эти сорта в основном удовлетворяют производителей и потребителей и их замена на новые, более лучшие, сорта идет очень медленно. Идеальным вариантом в этом случае было бы улучшение в привычных сортах только одного или нескольких признаков. К сожалению, этого не удается достичь с помощью традиционной селекции, но вполне возможно добиться методами генной инженерии. В настоящее время коммерчески возделывается в США устойчивая к вирусу папайя и в 2010 году получено разрешение на выращивание там же вирусоустойчивой сливы.
Исторически селекционная работа с культурными растениями всегда была направлена на увеличение урожайности, устойчивости к насекомым, повышение качества продукции, а также ее привлекательности для покупателя, что имеет особую актуальность в производстве продукции цветоводства. Усилия селекционеров в декоративном растениеводстве в основном направлены на изменение эстетических качеств - цвета, формы, аромата, на продолжительности жизни после срезки.
Наиболее привлекательная часть растения - это цветок. В идеале горшечное растение - это плотная шапка цветов, покрывающая зеленую часть растения. Фитогормоны играют важную роль в контроле размера и формы растения. Соотношение ауксины:цитокинины может быть изменено в трансгенных растениях экспрессирующих онкогены из Ті-плазмид Agrobacterium tumefaciens или Ri-плазмид A.rhizogenes. Например, констутивная экспрессия rolC гена, кодирующего цитокинин-(3-глюкозидазу из Ri-плазмиды привели к повышению уровня цитокининов, изменению архитектуры ряда растений.
Таким образом, технология генетического модифицирования нашла широкое применение в создании новых форм сельскохозяйственных культур с улучшенными характеристиками. Более того, в ближайшее десятилетие будет не только продолжаться рост площади мировых с/х угодий занятых ГМ культурами, но и принципиально расширится видовой ассортимент возделываемых культур.
Исходя из вышеизложенного, проблема разработки методов молекулярной селекции, в первую очередь генетической трансформации, и создание трансгенных сортов основных сельскохозяйственных культур России приобретает стратегическое значение с точки зрения продовольственной безопасности и независимости, а владение современными методами биотехнологии и диагностики растений является основой для предотвращения превращения России в свалку отходов биотехнологической индустрии развитых стран.
Цель исследований. Целью исследований являлась разработка генно-инженерных методов улучшения хозяйственно-ценных признаков садовых растений. В ходе исследования решались следующие задачи:
достижение эффективной регенерации садовых растений из соматических тканей;
создание векторных систем для переноса и экспрессии гетерологичных генов в садовые растения и разработка методов их трансформации на основе подбора вирулентных штаммов и селективных агентов;
оценка влияния присутствия растительного интрона и сигналов клеточной компартментализации на уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях;
изучения влияния экспрессии гена RolC на архитектуру и физиологию трансгенных растений на примере хризантемы и актинидии;
экспрессия гена bar в клоновых подвоях плодовых культур (яблони и груши) с целью получения растений устойчивых к гербицидам на основе фосфинотрицина
оценка влияния модификации гипервариабельной области гена bt токсина CryIAbl на изменения спектра его токсичности;
создание векторных конструкций для переноса в растения гена thaumaninII и изучение влияния его экспрессии на устойчивость к патогенам и вкусовые качества плодов трансгенных растений;
получение растений устойчивых к поражению вирусами с использованием постранскрипционного замалчивания генов;
проведение полевых испытаний полученных трансгенных растений на проявление перенесенных признаков.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основе оптимизации состава питательных сред, источников эксплантов и условий культивирования разработана методика эффективной адвентивной регенерации побегов из соматических тканей декоративных, ягодных и плодовых культур, эффективность, которой, в частности для косточковых культур, значительно превосходит результаты, достигнутые другими исследователями.
Разработаны схемы негативной селекции по степени устойчивости к антибиотикам (канамицин, гигромицин, генетицин) и позитивной селекции на маннозе в том числе впервые для косточковых культур на примере вишни и культурного сорта сливы. Проведен сравнительный анализ эффективности селекции трансформантов с различными селективными маркерными генами: nptII, hpt и pmi. Впервые при трансформации соматических тканей древесных были получены трансгенные растения с использованием метода позитивной селекции без генов устойчивости к антибиотикам.
Показано положительное влияние присутствия растительного интрона PIV2 в конструкции гетерологичного гена на уровень и стабильность его экспрессии в вегетативных и генеративных тканях земляники, яблони и груши. Впервые показана возможность использования различных лидерных последовательностей клонированных из травянистых видов растений, кодирующих сигнальные пептиды, для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в трансгенных растениях косточковых культур на примере сливы.
Впервые получены трансгенные растения актинидии коломикты, трансформированные селективными генами nptII, hpt и, впервые, геном rolC A. rhizogenes. Изучены некоторые морфологические особенности rolC - трансформантов актинидии, впервые изучено содержание активных форм цитокининов (зеатина и зеатин-рибозида), ИУК и АБК в растениях актинидии коломикты, трансформированных геном rolC. Показано стабильное изменение гормонального статуса rolC-трансформантов актинидии по сравнению с нетрансформированными растениями. Показана потенциальная возможность изменения габитуса надземной части древесных растений посредством переноса в их геном гена rolC из A. rhizogenes.
Показано изменение гормонального статуса ro/C-трансформантов хризантем сорта White Snowdon, предположительно являющегося причиной изменения: архитектуры растений; структуры генеративных органов; морфологии пыльцевых зерен - ведущее к потере фертильности. Показана возможность использовать ro/C гена в практическом цветоводстве для получения горшечных и декоративных форм у вегетативно размножающихся культур. При изучении изменений, вызванных экспрессией в растениях гена ro/C из A.rhizogenes в хризантемах обнаружено присутствие гомологичных ro/C гену последовательностей в геноме ряда сортов хризантем.
Впервые получены трансгенные растения хризантемы, экспрессирующие укороченный ген 5-эндотоксина CrylAbl. Впервые достоверно установлена токсичность продуктов генов 5-эндотоксина для нового класса членистоногих - акарид при их экспрессии в трансгенном растении.
Осуществлена трансформация клоновых подвоев яблони и груши геном обуславливающим устойчивость к гербицидам на основе фосфинотрицина и показана устойчивость полученных форм к высоким дозам коммерческих препаратов гербицидов в полевых условиях.
Впервые получены трансгенные растения земляники садовой яблони и груши с геном thaumatinII. Показано положительное влияние экспрессии тауматина на устойчивость к фитопатогену Botrytis cinerea на примере земляники. Достигнуто улучшения вкуса плодов у нескольких линий земляники, яблони и груши с экспрессией тауматина. Впервые в России проведены полевые испытания ГМ растений земляники? яблони и груши. По результатам молекулярно-генетических анализов, биологического тестирования и полевых испытаний среди трансгенных клонов, содержащих ген thaumatin II, отобраны перспективные линии с улучшенным вкусом плодов и повышенной устойчивостью к Botrytis cinerea. Отобранные перспективные линии с геном thaumatin II обладают улучшенными агрономическими характеристиками.
На основе использование феномена РНК интерференции и разработанных оригинальных методиках трансформации косточковых культур получены трансгенные линии культурного сорта сливы устойчивые к вирусу Шарки (PPV).
Полученные формы трансгенных растений прошли испытания в полевых условиях и продемонстрировали достоверное изменение агрономических характеристик обусловленное экспрессией гетерологичных генов и могут далее внедряться в с/х производство или использоваться в качестве исходного материала в традиционных селекционных программах.
Апробация работы основные результаты исследований доложены на международных научных конгрессах: 10th FESPP Congress "From molecular mechanisms to the plant: an integrated approach" Firenze, Italy, September, 1996; XXV International Horticultural Congress Brussels, Benelux, August, 1998; EUCARPIA XV-th General Congress for Crop Quality and resistance, Veterbo, Italy, September, 1998; Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва, (2003, 2005, 2007); XVth International plant protection congress. Beijing, China, May, 2004; 11th IAPTC&B Congress Biotechnology and sustainable agriculture 2006 and beyond Beijing, China, August, 2006; 9-th International Plant Molecular Biology Congress, St.Louis, Missouri, USA ,October, 2009; 12th IAPB Congress, St.Louis, Missouri, USA, June 2010; 28th International Horticultural Congress. Lisboa, Portugal, August 2010; 2-й Международный Конгресс "ЕвразияБио-2010" Москва, Россия, апрель, 2010. симпозиумах и конференциях: EUCARPIA 19-th International Symposium Improvement of Ornamental Plants, Angers, France, July, 1998; Symposium of Fruit Breeding and Genetics, Dresden, Germany, September, 1999; VIII International Pear Symposium, Ferrara-Bologna, September, 2000; International Symposium on Asian Pears, Tottori, Japan, August, 2001; EUCARPIA 19-th International Symposium of Fruit Breeding and Genetics, Angers, France, September, 2003; Industrial microbiology and biotechnology conference. Anaheim, CA, USA, July, 2004; 5th International strawberry symposium. Coolum Beach, Queensland, Australia, September, 2004; ISHS International Symposium Genetic modifications- Challenges and Opportunities for horticulture in the world. Shi, Norway, September 2007; I International Symposium on Biotechnology of Fruit species. Dresden, Germany, September, 2008; First Symposium on Horticulture in Europe. Vienna, Austria, February 2008; 21st International conference on virus and other graft transmissible diseases of fruit crops" Neustadt, Germany, July 2009.; International Symposium on Plum pox virus, Sofia, Bulgaria September, 2010; XI International Pear Symposium. Rio Negro Valley of Argentina, November 2010.
Объем и структура диссертации. Диссертация в виде научного доклада изложена на 55 страницах, иллюстрирована 20 таблицами и 23 рисунками, состоит из разделов «Общая характеристика работы», «Объекты и методы исследований», «Результаты исследований», «Выводы», списка работ по теме диссертации, включающего 58 статей в ведущих российских и зарубежных рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки, 3 патентов и 1 заявку, на которую получено положительное решение.
