Введение к работе
Актуальность темы. Значительную проблему в ветеринарии представляют собой респираторные вирусные инфекции другие заболевания инфекционной природы, которые наносят большой экономический ущерб промышленному животноводству (Дегтярев В.П. 1968; Воронин Е.С. 1989,1991; Сюрин В.Н. 1998; Белоусова Р.В., Преображенский Н.И., 2001; Петров А.М., 2002; Грязнева Т.Н., 2003; Белоусова Р.В. 2008).Одной из них является респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота – контагиозная болезнь, вызываемая респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), относящимся к семейству парамиксовирусов, роду – пневмовирусы. Болезнь проявляется поражением нижних отделов респираторного тракта, повышением температуры, затрудненным дыханием, одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем. Трудности культивирования, в свою очередь, затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.
Остается весьма важной разработка иммунологических средств и методов лабораторной экспресс-диагностики с использованием гомологичного вируса и антител.
Поэтому, что бы ускорить культивирование РС-вирусных штамов«Long» человека РС-вируса крупного рогатого скота для изготовления диагностикумов, разработки оптимальных условий репродукции вирусов, бактерий и микробов, которые позволили бы получить достаточное количество антисывороток, микробиального антигена и активного вируса, необходимых для производства средств лечения и специфической профилактики, приготовление лечебных и иммуностимулирующих препаратов, экспресс-диагностикумов, модификации иммунологических методов исследований явились актуальными в разрешении данных проблем.
Цель исследований. Целью работы явилась разработка эффективных методов культивирования респираторно-синцитиального вируса (РСВ) штаммов «РС-Б» крупного рогатого скота и «Long» человека в культуре клеток, а так же эффективного способа получения вирусных урожаев и бакмассы микроорганизмов, обеспечивающих максимальное накопление антигена для получения диагностических и иммунизирующих препаратов, простого и широкодоступного экспресс-метода диагностики РС-вирусных и микробиальных видов инфекции, иммунологического контроля лечебных, иммунопрофилактических и иммуностимулирующих препаратов.
Задачи исследований.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Изучить чувствительность первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток к штамму «РС-Б» респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота и штамму «Long» человека;
-
Разработать и рекомендовать оптимальные способы культивирования микроорганизмов (грамположительные, грамотрицательные и грибы), а так же респираторно-синцитиального вируса штаммов «РС-Б» и «Long»;
-
Изучить возможность использования РС-вируса, выращенного на различных культурах клеток, для изготовления стафилококкового, латексного и целлюлозного диагностикумов;
-
Разработать способ максимального получения и выделения РС-вирусных антигенов при культивировании и очистке для приготовления диагностических и иммунизирующих препаратов;
-
Испытать антигенные свойства РСВ штаммов «РС-Б» и «Long» человека на лабораторных животных и получить специфические сыворотки к ним в максимальных титрах;
-
Разработать способ максимального получения и выделения микроорганизмов и их антигенов на необогащенных средах.
-
Модифицировать иммунологические методы исследования для контроля за иммунизирующими свойствами разных антигенов РСВ in vito и in vivo;
-
Разработать иммуномодулятор для повышения титра антител и защиты животных от РСВ лабораторных животных при моделировании заболевания;
-
Испытать антимикробиальные средства с расширенным спектром действия для декотаминации питательных средств и биологических жидкостей;
-
Разработать препарат на основе антибиотика, обладающий противовирусным и антимикробным действиями ;
-
Приготовить антигенный РС-вирусный препарат, обладающий иммунизирующими свойствами.
-
Внедрить в производство биотехнологические экспресс-методы исследований
-
Апробировать разработанные противомикробные и антивирусные средства и иммунизирующие препараты.
Научная новизна исследования. Изучена репродуктивная способность штаммов «РС-Б» и «Long» в первичных, диплоидных, перевиваемых, гомологичных и гетерологичных культурах клеток.
Впервые подобраны наиболее продуктивные способы культивирования вирусов и микробов с использованием стимуляторов роста. Определены оптимальные условия их накопления.
Разработан и апробирован метод контроля размножения и учета инфекционной активности вируса.
Изучена возможность максимального получения микробиальных и вирусных антигенов, накопленных в различных культурах клеток и питательных сред, для изготовления иммунизирующих и экспресс-диагностических препаратов.
Модифицированы некоторые методы иммунологических исследований.
Разработан эффективный метод очистки и выделения антигенов РСВ.
Синтезированы и разработаны стимуляторы широкого спектра для роста микробов, вирусов, антителогинеза и перитонеальных макрофагов.
Приготовлена лекарственная форма на основе антибиотика для лечения вирусных и микробиальных заболеваний.
Разработан иммуностимулятор пролангированного действия с противовирусной и антимикробной активностью.
Синтезирован иммунизирующий препарат на основе сополимеров, содержащий антигены РСВ.
Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом и Авторскими Свидетельствами:
Патент РФ на изобретение №22816171 «Препарат для профилактики и лечения респираторных ЖКИ заболеваний бактериальной и вирусной этиологии с/х животных и способ профилактики и лечения репираторных и ЖКИ заболеваний бактериальной и вирусной этиологии с-х животных» по заявке № 2005110473 с приоритетом от 12.04.2005г.
А.С. № 1785659 « Способ определения РСВИ» по заявке №4250382 с приоритетом от 9.05.1987г.
А.С. № 1596252 « Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов» по заявке №44556827 с приоритетом от 03.07.1988г.
А.С. № 1719432 « Способ выделения вирусных антигенов» по заявке № 4825888 с приоритетом от 15.05.1990г.
А.С. №1655983 « Способ культивирования РСВ» по заявке №4651255 с приоритетом от 14.02.1989г.
А.С. №1834288 « Способ культивирования микроорганизмов» по заявке №4800510 с приоритетом от 11.03.1990г.
А.С. № 1785660 «Способ определения РСВИ» по заявке № 4253592 с приоритетом от 29.05.1987г.
А.С. № 1785658 « Способ диагностики гриппозной инфекции» по заявке № 4252494 с приоритетом от 29.05.1987г.
А.С. № 1767517 « Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментально животного» по заявке № 4838673 с приоритетом от 13.06.1990г.
А.С. № 1561687 « Способ для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях» по заявке № 4406971 с приоритетом от 4.03.1988г.
Положительно решение о выдаче изобретения по заявке 4678450/14(054942) « Средство для лечения заболеваний, вызванных вирусной инфекцией» с приоритетом от 13.03.1989г.
Практическая значимость работы. Разработка и внедрение полученных препаратов, соединений и способов позволят решить важные научно-производственные проблемы, имеющие большое народно-хозяйственное значение.
Разработан лабораторный регламент стимулированного культивирования РСВ и др. вирусов в культуре клеток для изготовления специфического РСВ антигена, необходимого для экспресс-диагностики РСВ и др. видов инфекции у животных.
Изготовлено 66 микросерий целлюлозного диагностикума, из которых 51 серия использована для выявления антител к РС-вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз в лабораторных и производственных испытаниях.
Установлен неспецифический эффект стимулированного роста вирусов в связи с применением стимулятора триптоксида. Неприспособленные к питательным средам и клеткам вирусы в присутствии триптоксида и УФЛ-экспонированной сыворотки позволяют получить за короткий отрезок времени максимальный урожай.
Выявлена неспецифическая активность пинексида- препарата, обладающего стимуляцией роста грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, мицелиальных и дрожжевых грибов на необогащенных питательных средах. Значительно сокращены время появления первых колоний и максимальное накопление бакмассы.
Доказана высокая специфичность простота постановки и учета результатов исследований при использовании экспресс-диагностикумов на основе латексных частит и порошковой целлюлозы. Впервые показана возможность получения стабильной композиции диагностикумов в связи с применением 10%-го кальция хлорида и глютаральдегида. ФБР, рН 7,3±0,1, 1% БСА, краситель азур II обеспечивают получение быстрых и достоверных результатов на предметных стеклах в качественном и количественном титрованиях.
Показана эффективность выделения вирусных антигенов с применением преципитационной смеси (ПС) и экстракционной смеси (ЭС). Вирусные белки, полученные в результате выделения и очистки вирусов на низкоскоростных центрифугах во много раз превышают известные способы. Об этом свидетельствуют результаты электрофореза (ЭФ) и определения белка в вирусных антигенах.
Проведена широкая апробация модифицированной пластиковой чашки Петри для проведения иммунологических, фармакологических, вирусологических и других исследований. Простое получение камеральных опытов позволило значительно упростить постановку, время и результаты экспериментов по определению реакции торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) РТМЛ(М), реакции Ерне-Каненгема (РЕК), бляжкообразующим единицам (БОЕ), цитопатическому действию (эффекту) ЦПД и тд. Контроль репродуктивной активности вирусов стал очевиднее в камере чашки Петри, содержащей взвесь культуры клеток в питательной среде. За короткий отрезок времени (6-10ч.) ЦПЭ виден по БОЕ.
Средство для стимулированного получения ПМФ стало возможным в связи с использованием А-2ПТК(смеси гидроокиси алюминия, пептона, ПГ, трисина, и кальция хлорида). Образовавшиеся восковидные тельца после в/б введения ирританта обеспечивают быстрое появление ПМФ длительностью в 100-120 дней. ПМФ, помещенные в камеру модифицированной чашки Петри в присутствии антигенов, антител, лекарственных средств, являются доступной моделью в иммунологических, фамакологических и токсикологих исследования.
Применение тризолона как стимулятора антителогинеза лабараторным животным за 2-4 часа перед интраназальным заражением РСВ позволяет получить высокотитражные антисыворотки.
Выявлена лечебная эффективность дикалсида (смесь диклоксацеллина, кальция хлорида, трисина и ДМСО) при интраназалоном введении в случая респираторных заболеваниях и видов герпес-вирусной инфекции.
Проведенная апробация повина-ВМ при инфекционных заболеваниях лабораторных животных показала высокую терапевтическую активность: однократное, парентеральное введение обеспечивает лечебный курс в связи с пролонгированной формой препарата. Повин-ВМ эффективен при вирусных и микробиальных заболеваниях разной локализации как иммуномодулятор клеточного и гуморального ответов. Показаны положительные результаты деконтаминации культуральных и питательных сред. Апробация препарата на свиньях с профилактической целью обеспечила сохранность поголовья, увеличение прироста массы тела, экономию вакцин, антисывороток и антибиотиков.
Иммунизирующий РСВ препарат на основе ВА/ВП-ДФХ при интраназальном введении стимулировал клеточный и гуморальный иммунитет.
Результаты проведенных исследований нашли отражение в нормативно-технических документах, а также, в многочисленных актах, отзывах, заключениях, актах об использовании предложения и внедрениях.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на межлабораторных заседаниях Государственного научного центра РФ Института иммунологии Федерального, медико-биологического агентства (ГНЦ «Институт иммунологии (1987-88), на конференциях молодых ученых (Саратов, 1987-88), на курсах информации и стажировки врачей-вирусологов по теме: «Современные методы диагностики ротавирусной инфекции» в Республиканской санэпидстанции Минздрава СССР, в институте вирусологии им. Ивановского, академии медицинских наук СССР, (Москва, 1988), на Каунасском предприятии по производству бактерийных препаратов, (1987), на Всесоюзной, научно-практической конференции, (1989), на заседании лаборатории инфекционной патологии при муниципальном госпитале г. Осло, (Норвегия) 1991), на свинокомплексе «Владимирский», Владимирской области, (1990), на племзаводе «Заволжское», Тверской области, (2004), на Международных научно-практических конференциях (2006-2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы в 31 работе, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ-6, 1 патент РФ, 10 авторских свидетельств, приоритет на изобретение, 10 - в сборниках научных конференций, 4- методических рекомендации.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, данных о практическом использовании научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы и 30 страниц приложений. Работа содержит 56 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 235 источников, из них 69 отечественных и 166 зарубежных авторов.
На защиту выносятся следующие положения и результаты:
-
Применение неспецифических стимуляторов роста микроорганизмов- пинексида и триптоксида позволяют получить максимальные бакмассу и урожай вирусов за короткий отрезок времени в увеличенном количестве.
-
ПС и ЭС способствуют быстрой очистке и получению обогащенных вирусных белков.
-
Использование диагностикумов на основе латекса или порошковой целлюлозы, сенсибилизированных антигенами или антителами, разведенных ФБР рН 7,2±0,1 и окрашенных азуром II, позволяют за 5-10 мин. поставить диагноз.
-
Модифицированная пластиковая чашка Петри создает оптимальные камеральные условия для постановки иммунологических ( РТММ(Л), РЕК)), вирусологических (ЦПД,БОЕ) и фармакологических исследований.
-
Тризолон (трипсин с преднизолоном, 9:1) в/м за 2-4 часа до заражения лабораторных животных обеспечивает максимальные титры антител в сыворотке крови.
-
Дикалсид (комплекс антибиотика диклоксацелина с ДМСО, трипсином и 10% кальция хлоридом) устраняет воспаление инфекционной этиологии при наружном применении за короткий отрезок времени.
-
Повин-ВМ (комплекс антибиотика тетрациклина с трипсином, полимерами и ЭДТА) оказался эффективным при лечении инфекционных заболеваниях лабораторных животных, свиней и при деконтаминации питательных и культуральных сред.
-
Вирусные вакцины, содержащие РСВ на основе ВА/ВП-ДФХ показали иммунологическую эффективность на лабораторных животных.
