Введение к работе
I. Актуальность темы
Проблемы совершенствования и разработки новых методов индикации патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды и в настоящее время продолжают оставаться актуальными. Уже более 50 лет для этих целей успешно применяются иммунохнмические методы, в основе которых лежит образование высокоспецифического комплекса антиген - антитело. Однако на практике значительные потенциальные возможности современных методов не всегда реализуются. Во-первых, это связано с трудностями выделения культур микроорганизмов из различных объектов внешней среды, особенно при низких концентрациях обнаруживаемых в пробе бактерий. Во-вторых, высокий уровень контаминации исследуемых объектов посторонней микрофлорой, в том числе обладающей значительным уровнем антигенного родства.
Поскольку сибирская язва наряду с такими патогенами как клостридии, нерсинии, листерии, клебсиеллы и др. относится к почвенно-очаговым инфекциям, все указанные проблемы индикации присущи и этому микроорганизму, а применяемые в настоящее время утвержденные методы обнаружения B.anthracis характеризуются достаточно высокой трудоемкостью и низким процентом выделения (Бургасов П.Н. и др., 1970; Соркин Ю.И. и др., 1988).
Для повышения эффективности индикации патогенов из объектов окружающей среды был предложен метод, основанный на использовании магнитных сорбентов, представляющих собой полимерные микрогранулы с композитными феррочастицами, и иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами. Сорбенты позволяют осуществлять селективное концентрирование на своей поверхности целевых клеток и одновременно освобождаться от контаминирующей микрофлоры и примесей (Ефременко В.И., 1996).
В 2003 году Абгарян А.Г. с соавт. для индикации В. anthracis в пробах почвы были изготовлены магнитные частицы с сорбированными на них антиспоровыми иммуноглобулинами G. Однако сорбированные иммуноглобулины, выделенные из полиспецифических сывороток, обладали
высоким уровнем перекрестных реакций со спорами близкородственных
сапрофитов. что явилось препятствием для широкого внедрения метода в практику.
Наличие значительного числа сибиреязвенных захоронений и падёжных мест на территории РФ и существование постоянной угрозы возникновения инфекции обусловливают необходимость разработки эффективных и специфичных методов выявления возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось сравнительное изучение антигенного состава спор возбудителя сибирской язвы и близкородственных сапрофитов, получение видоспецифических противосибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов и конструирование на их основе магноиммуносорбентов, пригодных для селективного обнаружения спор В. anthracis в объектах внешней среды.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести комплексное изучение фенотипических, антигенных и дифференциальных свойств штаммов/изолятов группы В. cereus.
Изучить полипептидный спектр поверхностных споровых белков сибиреязвенного микроба и близкородственных сапрофитов и подобрать эффективный метод выделения специфических антигенов из спор В. anthracis.
3. Подобрать эффективную схему иммунизации животных для получения
иммунных сывороток с высокими титрами антиспоровых антител.
Изучить полипептидную специфичность антител антиспоровых сывороток и перекрестную реактивность поверхностных антигенов спор штаммов группы Bacillus cereus.
Из гипериммунных сывороток выделить и охарактеризовать видоспецифические противосибиреязвенные антиспоровые иммуноглобулины.
На основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам
сибиреязвенного микроба изготовить экспериментальные образцы
иммунореагентов для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного
анализов и оценить возможность их использования для детекции антигенов В.
anthracis.
7. Сконструировать магнонммуносорбент для обнаружения возбудителя сибирской язвы, изучить его селективные свойства, разработать методику применения и провести испытания в лабораторных и приближённых к реальным условиях..
Научная новизна работы
Определены методические приемы и их последовательность, дающие возможность конструировать магнонммуносорбент с иммобилизированными на его поверхности видоспецифичными сибиреязвенными антиспоровыми антителами.
Разработан способ селективного выделения спор возбудителя сибирской язвы из объектов внешней среды.
Установлено, что сэндвич - метод ТФ ИФА на основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба позволяет дифференцировать споры В. antlvacis от спор штаммов сапрофитов рода Bacillus независимо от степени их антигенного родства.
Практическая значимость результатов исследования
Предложена эффективная схема иммунизации лабораторных и сельскохозяйственных животных, позволяющая получать активные иммунные сыворотки на поверхностные антигенные детерминанты спор В. antlvacis и оптимизирован метод выделения видоспецифических сибиреязвенных антиспоровых иммуноглобулинов.
На основе видоспецифических иммуноглобулинов к спорам сибиреязвенного микроба изготовлены иммунореагенты для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализов и разработан высокоспецифичный сэндвич - метод ТФ ИФА для детекции антигенов В. anthracis.
3. Метод получения магноиммуносорбента, обладающего селективной
сорбцией спор сибиреязвенного микроба из пула спорообразующей
микрофлоры предлагается к использованию при разработке и
совершенствовании схем индикации возбудителя сибирской язвы в объектах
внешней среды.
Результаты экспериментальной работы использованы при разработке
следующих документов:
«Методические рекомендации по подготовке проб почвы к исследованию на контаминацию возбудителем сибирской язвы» (2008 г.);
- «Методические рекомендации по изготовлению и применению магноиммуносорбента на основе иммуноглобулинов к спорам B.anthracis» (2009 г.).
Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом, утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ РОСЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ и рассмотрены на секции Биотехнологии Отделения ветеринарии РАСХН.
Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту
Методические подходы к конструированию магноиммуносорбента с иммобилизованными на поверхности антиспоровыми сибиреязвенными антителами и использование его для обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.
Результаты экспериментальных исследований по разработке сэндвич -метода ТФ ИФА для дифференциации спор В. anlhracis от спор типичных и близкородственных в антигенном отношении представителей рода Bacillus.
Апробация и публикация результатов
Материалы диссертации доложены на международных научно-практических конференциях «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП (Щёлково, 2006, 2007), международных научно-практических конференциях «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2007, 2008, 2009); «Актуальные вопросы инвазионной и инфекционной патологии животных» (Улан-Удэ, 2008); «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», ВИЭВ (Москва, 2009) и на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (2005 - 2009).
По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Личный вклад автора в выполнении работы
Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.в.н. И.Ю. Егорова (освоение микробиологических методов), к.б.н., Е.Г. Анохина (освоение методов электрофоретического разделения белков и иммуноблоттинг), к.в.н. О.В. Капустина (освоение методов иммуноферментного анализа), к.б.н. И.В. Ногина (освоение методов мечения иммуноглобулинов ФИТЦ), д.б.н. В.Н. Пономарев (электронная микроскопия, получение магносорбентов).
Объем її структура диссертации
Диссертация изложена на 154 страницах, иллюстрирована 19 таблицами и 24 рисунками. Список литературы включает 194 источника, из которых 61 иностранных авторов.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
