Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы . 12
1.1 Биологические особенности возбудителя сибирской язвы 12
1.2 Сибиреязвенные бактериофаги и их биологические свойства . 13
1.3 Практическое применение сибиреязвенных бактериофагов . 19
1.3.1 Возможность использования бактериофагов для дезинфекции почвенных очагов и лечения сибирской язвы . 19
1.3.2 Использование бактериофагов в тестах индикации Bacillus an-thracis 20
1.3.3 Идентификационные тесты с применением сибиреязвенных бактериофагов 22
1.4 Способы производства препаратов бактериофага 25
1.5 Механизмы фагочувствительности и фагорезистентности штаммов Bacillus anthracis 29
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Материалы и методы 34
2.1 Материалы 34
2.1.1 Бактериофаги 34
2.1.2 Штаммы возбудителя сибирской язвы и близкородственных представителей рода Bacillus 34
2.1.3 Питательные среды 38
2.1.4 Химические реактивы 38
2.1.5 Аппаратура 39
2.2 Методы исследования 39
2.2.1 Методы изучения фенотипических свойств сибирской язвы 39
2.2.1.1 Тест на обнаружение капсулы in vitro 39
2.2.1.2 Метод выращивания спор B. anthracis на среде Гладстона-Филдса . 40
2.2.1.3 Приготовление взвесей B. anthracis . 40
2.2.1.4 Определение концентрации жизнеспособных спор сибиреязвенного микроба . 41
2.2.2 Методы размножения и изучения свойств сибиреязвенных бактериофагов 41
2.2.2.1 Метод получения (размножения) бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 42
2.2.2.2 Метод определения концентрации фаговых частиц 42
2.2.2.3 Определение чувствительности культур к специфическим бактериофагам 43
2.2.2.4 Методы оценки специфической активности бактериофагов 44
2.2.2.5 Метод определения нарастания титра бактериофага (РНФ) . 45
2.2.3 Методы статистической обработки результатов 46
ГЛАВА 3. Разработка биотехнологии производства препарата бактериофага диагностического сибиреязвенного гамма а-26 жидкого 47
3.1 Подбор штамма B. anthracis для размножения сибиреязвенного бактериофага 48
3.2 Разработка оптимальных параметров репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 54
3.3 Сравнительная характеристика экспериментально-производственных серий бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого 64
ГЛАВА 4. Сравнительная характеристика биологических свойств сибиреязвенных бактериофагов 68
4.1 Сравнительная оценка свойств сибиреязвенных бактериофагов, определяющих их пригодность для промышленного производства 68
4.2 Определение спектра специфической литической активности сибиреязвенных бактериофагов 75
4.3 Изучение специфичности диагностических бактериофагов Bacillus anthracis 86
ГЛАВА 5. Оптимизация использования различных сибиреязвенных бактериофагов для совершенствования лабораторной диагностики сибирской язвы . 91
5.1 Изучение возможности использования видоспецифического сибиреязвенного бактериофага R/D-Ph-6 для индикации возбудителя B. anthracis в РНФ . 91
5.1.1 Изучение динамики изменения концентрации B. anthracis и сибиреязвенного бактериофага R/D-Ph-6 при культивировании в бульонной культуре 92
5.1.2 Подбор оптимальных условий для получения высоких концентраций бактериофага R/D-Ph-6 при размножении на чистых культурах B. anthracis 95
5.1.3 Испытание специфической активности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ на различных штаммах сибиреязвенного микроба . 97
5.1.4 Изучение специфичности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ на различных штаммах сапрофитных представителей рода Bacillus 99
5.1.5 Изучение специфической активности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ в смешанных культурах 100
5.1.6 Изучение специфической активности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ на пробах из объектов окружающей среды 102
5.2 Изучение возможности повышения эффективности фагодиа-
гностики сибирской язвы при комплексном использовании бактериофагов с различным литическим спектром 103
5.2.1 Выделение фагорезистентных сибиреязвенных культур и определение их чувствительности к различным бактериофагам 103
5.2.2 Разработка оптимальной схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности для идентификации и фаготипирования штаммов B. anthracis . 108 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 115
Список сокращений и условных обозначений 129
Список литературы . 130
- Возможность использования бактериофагов для дезинфекции почвенных очагов и лечения сибирской язвы
- Штаммы возбудителя сибирской язвы и близкородственных представителей рода Bacillus
- Разработка оптимальных параметров репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26
- Определение спектра специфической литической активности сибиреязвенных бактериофагов
Возможность использования бактериофагов для дезинфекции почвенных очагов и лечения сибирской язвы
Бактериофаги – относящиеся к различным таксономическим группам вирусы, являются внутриклеточными паразитами бактерий, проявляющими значи 14 тельную видоспецифичность к бактериям-репродуцентам, что и лежит в основе практического интереса к ним со стороны медицинской микробиологии.
При исследовании более 160 штаммов В. anthracis из окружающей среды и от больных животных со всего мира более 20 % штаммов оказались устойчиво инфицированными множеством различных индуцибельных профагов [Buck С.А. et al, 1963; Vera Т. еt al, 1968; Inal J.H., Karunakaran K.V., 1996; Redmond С еt al, 1996].
Свободные фаги, способные заражать В. anthracis, также обнаруживали во многих видах окружающей среды, включая сточные воды, шерсть животных, почву и воду вокруг сибиреязвенных трупов или неподалеку от них, а также -почву из неэндемичных районов [Колесов С.Г., 1976; Ипатенко Н.Г. с соавт., 1987; Маринин Л.И. с соавт., 2009; Buck С.А. et al, 1963; Vera Т. еt al, 1968; Nagy E. et al, 1976; Odendaal M. еt al., 1991; Inal J.H., Karunakaran K.V., 1996; Redmond С еt al, 1996; Walter M.N., Baker D.D., 2003]. Сибиреязвенные бактериофаги изучались многими исследователями. E.W. McCloy [1951] выделила фаг WP из штамма В. cereus W (АТСС 11950) и установила, что он довольно специфичен для В. anthracis, хотя и инфицирует несколько штаммов В. cereus.
Фаг Гамма (у) был выделен E.R.Brown и W.B. Cherry [1955] как вариант фага W, образовавшийся после повторного инфицирования штамма В. cereus W ли-затом фага W. Он обладал уникальной способностью лизировать как капсульные, так и бескапсульные штаммы, а также лизогенные по фагу W штаммы В. anthracis, но не лизировал культуры В. cereus.
Другой фаг В. anthracis, названный фагом Cherry использовался для идентификации сибиреязвенного микроба, хотя и реже, однако его родство с фагом Гамма оставалось неизвестным. Определение нуклеотидных последовательностей этих фагов позволило установить их общее происхождение. Геномы фагов оказались идентичными, за исключением трех вариабельных локусов, которые были гетерогенными у фагов Cherry, W, Fah, а так же у индивидуальных препаратов фагов [Fouts D.E. et al, 2006]. В 1961 году Е.В. Груз выделила из почвы г. Кишинева высокоспецифичный бактериофаг ВА-9. Сравнительные испытания сибиреязвенных бактериофагов Е, L7, W и ВА-9 в отношении 52 штаммов возбудителя сибирской язвы и 43 близкородственных спорообразующих сапрофитов, показали их полную идентичность, что позволило автору рекомендовать их для лабораторной диагностики сибирской язвы.
В 1962 году А.Я. Мещеряковым был выделен сибиреязвенный фаг К ВИЭВ [Маринин Л.И. с соавт., 2009].
Н.Г. Ипатенко с соавт. [1989] исследовали литическую активность сибиреязвенных бактериофагов К ВИЭВ и Гамма МВА на 244 штаммах B. anthracis и 23 штаммах спорообразующих сапрофитов. Специфическая активность бактериофагов составила 95 %, специфичность – 100 %. Исследования показали, что сибиреязвенные бактериофаги К ВИЭВ и Гамма МВА являются высокоспецифичными препаратами.
В.С. Ларина и Л.С. Петрова в 1964 сообщили о выделении специфического фага «Саратов». Изучению биологических свойств бактериофага «Саратов» посвящено исследование И.Н. Земцовой [1965, 1965а].
Диапазон литического действия и специфичность сибиреязвенного бактериофага «Саратов» были проверены на 58 штаммах сибиреязвенного микроба и 94 штаммах почвенных аэробных спорообразующих сапрофитов. Бактериофаг вызывал лизис всех испытанных сибиреязвенных культур, а из 94 штаммов са-профитов оказался чувствительным к фагу только один штамм B. cereus, лизис которого проявлялся слабо и непостоянно. При анализе клеточного состава популяции данного штамма выявлено, что отдельные клетки его обладали резистентностью к действию фага. Препарат сибиреязвенного бактериофага «Саратов» был выпущен только в экспериментальных сериях.
В 1967 г. при изучении музейных сибиреязвенных культур, на Туркменской противочумной станции, был изолирован сибиреязвенный бактериофаг, обозначенный 186, что соответствовало порядковому номеру культуры. Штамм 186, выделенный Марыйским противочумным отделением из пыли на шерстомойной фабрике в 1963 г., обладал свойствами антракоида. Диагностические характеристики этого бактериофага были изучены недостаточно полно. В результате опытов установлено, что фаг оказывал литическое действие на преобладающее большинство (91,5 %) испытанных 46 музейных штаммов возбудителя сибирской язвы и вакцинный штамм В. anthracis СТИ. Антракоиды не лизировал [Жеглова Д.В., 1972].
Наиболее детально сибиреязвенные фаги исследовали Е.Н. Левина и В.Р. Архипова [1967]. С целью испытания литических свойств бактериофагов ВА-9, Саратов, у, осС, р и L7 были использованы 50 сибиреязвенных штаммов различной вирулентности, выделенных из разных источников, а также 83 штамма спорооб-разующих аэробов. Наиболее широким спектром литического действия обладали фаги у и ВА-9. Остальные бактериофаги не лизировали от 14 до 22 % сибиреязвенных штаммов. Вместе с тем эти фаги не обусловливали неспецифического лизиса штаммов из группы спорообразующих аэробов, в то время как под влиянием фагов у и ВА-9 наблюдалось неспецифических реакций 5 % и 3-8 % соответственно.
По результатам изучения специфической активности шести сибиреязвенных бактериофагов (у, осС, ВА-9, L7, Саратов, К ВИЭВ) И.И. Павлова [1971] пришла к выводу о наиболее широком спектре литической активности бактериофага К ВИЭВ.
Более широкое применение для идентификации штаммов В. anthracis нашли сибиреязвенные бактериофаги К ВИЭВ, Гамма МВА, ВА-9, Fah-ВНИИВВиМ, ВА-104, 3-БК2, Саратов, W и другие [Земцова И.Н., 1965; Преснов И.Н., 1966; Коротич А., Погребняк Л.И., 1976; Brown E.R., Cherry W.B., 1955].
В 1996 г. был выделен новый бактериофаг из культуры В. thuringiensis var. Kurstaki (ВТ Н3). Предварительные исследования показали, что он лизирует вирулентные и вакцинные штаммы В. anthracis, а также штаммы большинства сероти-пов В. thuringiensis [Исангалин Ф.Ш. с соавт., 2000]. Вследствие того, что данный бактериофаг лизирует штаммы близкородственных сапрофитов, он является непригодным для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы.
Предложенный бактериофаг Fah-ВНИИВВиМ, разработанный во Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии, по данным авторов, лизировал не менее 98 % исследованных сибиреязвенных штаммов и не взаимодействовал с другими видами бацилл [Бакулов И.Ф. с соавт., 2001]. В настоящее время, бактериофаг Fah-ВНИИВВиМ производится во ГНУ «Всероссийский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Российской академии сельскохозяйственных наук для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.
Специфичный для сибиреязвенного микроба бактериофаг AP50 был выделен из почвы с использованием штамма репродуцента В. anthracis Sterne [Nagy Е., 1974; Nagy Е, Pragai В., Ivanovics G., 1976; Ackermann H.-W. еt al, 1978].
Изучение литических свойств бактериофага AP50с выявило, что из 115 штаммов сибиреязвенного микроба бактериофаг АР50с лизировал 111штаммов В .anthracis (97 %) и ни одного из 100 штаммов В. cereus. Сравнительное исследование литических свойств бактериофагов АР50с и у показало, что только 4 из 115 были устойчивы к AP50с, когда 10 из 115 устойчивы к у. Девять из 10 штаммов резистентных к инфекции фагом у, были чувствительны к лизирующему действию бактериофага АР50с, а три из 4 штаммов устойчивые к AP50с, были чувствительны куи только один штамм оказался устойчив к обоим фагам [Priest F.G.et al, 2004].
Штаммы возбудителя сибирской язвы и близкородственных представителей рода Bacillus
Результат воздействия на бактериальные клетки специфических бактериофагов может проявляться в виде феномена фагочувствительности или фагоре-зистентности в зависимости от сочетания индивидуальных особенностей взаимодействующих бактерий и бактериофагов. Неодинаковая чувствительность отдельных штаммов бактерий одного вида к специфическим бактериофагам представляет интерес не только с точки зрения надежности теста фаголизабельности в схеме идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выделения вариантов с разной чувствительностью к действию бактериофагов, которые могут быть использованы для детального изучения механизмов фагорезистентности.
Фаги, как правило, проявляют специфичность в отношении хозяина. По специфичности взаимодействия с клетками различают следующие бактериофаги: поливалентные, взаимодействующие с родственными видами бактерий; моновалентные, взаимодействующие с бактериями одного вида; типовые, взаимодействующие с отдельными вариантами одного вида [Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. www.biofile.ru/bio/761.html]. Строгая специфичность позволяет использовать моновалентные бактериофаги для дифференцирования видов; типовые – для фаготипирования. Метод фаготипирования бактерий позволяет не только определить видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Фаготипирование имеет большое эпидемиологическое значение т.к. позволяет установить источник и пути распространения инфекции [Медицинская микробиология…, 1994]. Поливалентные бактериофаги не применяют для индикации и дифференциации бактерий ввиду их низкой специфичности. Бактериальные клетки обладают целым рядом функциональных механизмов, направленных на обеспечение защиты от действия бактериофагов. По данным A. Coffey аnd R.P. Ross [2002] можно выделить четыре группы механизмов антифаговой защиты: 1 – ингибирование адсорбции бактериофагов; 2 – блокирование проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку; 3 – системы рестрикции/модификации, обеспечивающие при помощи сайт-специфической эндо-нуклеазы и метилазы разрушение геномов фагов; 4 – механизмы абортирования фаговой инфекции, которые влияют на репликацию фагового генома, транскрипцию, трансляцию, упаковку фаговой частицы. Системы антифаговой защиты бактерий могут эффективно действовать против нескольких групп фагов [Moineay S., 1999].
Некоторые авторы связывают чувствительность культур к бактериофагам с определенными биологическими свойствами этих штаммов.
Механизм резистентности к действию бактериофагов может быть различным. Бактерии обычно развивают устойчивость к определенным фагам, теряя при мутации фаговые рецепторы или изменяя их. Однако потеря некоторых рецепторов не дает защиты от множества других фагов, которые используют иные поверхностные молекулы. Более того, в большинстве случаев фаг может приобретать компенсаторную адаптацию через мутацию в генах белков адсорбции, которая изменяет хвостовые фибриллы так, что они могут узнавать измененные поверхностные клеточные белки или связываться с другим рецептором. Этот путь в целом менее эффективен, чем приобретение устойчивости бактериями, так как при адаптации фагов к новым рецепторам нужно создание нового функционального взаимодействия, тогда как для выработки устойчивости хозяина требуется лишь потеря функции [Lenski R.E., 1984].
Отсутствие S-слоя вегетативной клетки, который служит местом фиксации бактериофагов, и инфицирование бактерий умеренным фагом – все это делает клетку неспособной к адсорбции фага [Буланцев А.Л. с соавт., 1992; Fouet A., 1998]. Умеренные бактериофаги после проникновения в бактерию не разрушают её, так как ДНК фага встраивается в хромосому бактерий и передается по наслед 31 ству. Такое существование бактерии и умеренного бактериофага называется лизо-генией. Лизогенизация бактерий лежит в основе феномена лизогенной или фаговой конверсии, который заключается в приобретении лизогенными бактериями дополнительных свойств. Под действием ультрафиолетового и ионизирующего излучения, химических и других факторов, профаг может превращаться в вирулентную форму, что сопровождается репликацией бактериофагов и лизисом бактерий.
А.Л. Буланцев с соавт. [1992] получали фагорезистентные клоны трех штаммов B. anthracis, путем селекции жизнеспособных бактериальных клеток на плотных питательных средах или в бульонных культурах после обработки бактериофагами К ВИЭВ и БФ. Из всех трех штаммов в результате обработки фагом К ВИЭВ получены фагорезистентные к нему клоны, которые сохраняли чувствительность к фагу БФ. После обработки фагом БФ клоны, приобретшие резистентность к нему, оставались чувствительными к фагу К ВИЭВ. Лишь один клон оказался резистентным к обоим фагам.
С появлением и совершенствованием новых биохимических и молекулярно-генетических методов исследования стало доступно изучение тонких механизмов чувствительности и резистентности бактерий к литическому действию бактериофагов на бактериальные клетки.
В настоящее время идентифицирован лизин сибиреязвенного бактериофага Гамма, обладающий ферментативной активностью и специфичностью [Watanabe T. et al., 1975; Schuch R. et al., 2002].
По данным V.А. Fischetti [1971] очищенный с применением двустадийной хроматографии Гамма-лизин в течение трех секунд вызывал резкое (в 5000 раз) уменьшение количества жизнеспособных клеток B. anthracis в жидкой питательной среде и фосфатном буфере. Как отмечает автор, бактерицидная активность по отношению к клеткам B. anthracis, находившимся в крови человека, была значительно ниже. К сожалению, из текста не понятно, была ли вегетативная культура культивирована в крови и могла быть в капсульной форме, или акапсульная вегетативная культура с обычных питательных сред была суспендирована в крови пе 32 ред постановкой эксперимента. Гамма-лизин был активен по отношению к десяти типичным и пяти моноплазмидным штаммам сибиреязвенного микроба из различных географических регионов.
Автором была предпринята попытка изучить литическое действие Гамма-лизина in vivo, для чего мышей интраперитонеально заражали чувствительным к действию бактериофага Гамма штаммом B. cereus летальным для этих животных. Мыши, которым через 15 минут после инфицирования вводили 100 мг Гамма-лизина, выжили в 72 %, в отличие от 10 % в контрольной группе. К сожалению, результаты этого исследования нельзя экстраполировать на воздействие Гамма-лизина на типичные диплазмидные штаммы B. anthracis, которые in vivo, в отличие от B. cereus, образуют капсулу.
Исследования S. Davison et al. [2005] посвящены изучению структуре рецепторов и их функциональной роли в адсорбции бактериофага Гамма на поверхности клеток сибиреязвенных бацилл. Рецепторную функцию, по данным авторов, выполняет белок, названный ими GamR. Штамм B. anthracis с мутацией структурного гена, детерминирующего синтез рецепторного белка, был резистентен к литическому действию бактериофага Гамма. Важную роль в функционировании указанных фагорецепторных структур играет сортаза А, обеспечивающая прикрепление белковых рецепторов к поверхности бактериальной клетки. Мутации, возникающие в генетических детерминантах сортазы А, значительно снижают чувствительность клеток сибиреязвенного микроба к бактериофагу Гамма.
Спонтанные мутанты B. anthracis, устойчивые к инфицированию фагом AP50c (AP50R), проявляли фенотип слизистых колоний [Bishop-Lilly K.A. et al., 2012]. Использовали полногеномное секвенирование (ПГС) с целью определить кандидатные мутации, придающие устойчивость к фагу AP50c, с последующим исследованием генетических делеций и их комплементацией для подтверждения данных ПГС и демонстрации необходимости вовлеченных генов для инфицирования AP50c.
Разработка оптимальных параметров репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26
Количественная оценка концентрации живых спор B. anthracis во взвесях. В качестве разводящей жидкости использовали стерильный 0,05 % раствор Твина-80 [Буравцева Н. П., Чернявская Е.Г., 1986]. Испытуемую взвесь спор титровали с десятикратным шагом до разведения 10-7 с обязательной сменой пипеток. После тщательного перемешивания путем пипетирования из разведений 10-5, 10-6 и 10-7, производили контрольные высевы строго по 0,1 мл каждой полученной взвеси на поверхность агара Хоттингера в чашках Петри (не менее 3 чашек на одно разведение). Путем плавного вращения чашек распределяли жидкость по поверхности питательной среды. После полного впитывания жидкости чашки переворачивали и помещали при температуре 37 0С. Через 20-24 ч подсчитывали число колоний на 3 чашках с высевом из одного разведения, где формировались изолированные типичные по морфологии колонии B. anthracis и вычисляли их среднее число. Концентрацию жизнеспособных спор рассчитывали с применением следующей формулы (1) К=ах 10n, где К – концентрация спор в исследуемой взвеси,
Питательную среду засевали спорами вакцинного штамма B. anthracis 228/8 из расчета 3109 спор на 100 мл питательной среды. Инкубировали в термостате при температуре (36±1) 0С в течение (4±1) ч на орбитальном шейкере (65±5) об/мин. Затем добавляли в колбу маточную культуру бактериофага Гамма А-26 в количестве 10 мл. Колбу с засеянным бактериофагом вновь ставили на орбитальный шейкер и инкубировали в термостате при температуре (36±1) 0С в течение (14±2) ч. Фаголизат переносили в приемный стакан системы для фильтрации «Мillipor» и проводили фильтрацию. Использовали мембранные фильтры «Мillipor» с размером пор 0,45мкм. Перепад давления – не более 70 мПа. По окончании фильтрации фаголизат переносили в стерильных условиях из колбы «Мillipore» в стерильную мерную колбу и добавляли консервант – химически чистый хлороформ в количестве 0,5 % от объема фаголизата. Содержимое колбы осторожно перемешивали и выдерживали с хлороформом при температуре (20±2) 0С в течение 30 мин, затем переносили в холодильник при температуре (4±2) 0С на 24-72 ч. По окончании инкубации с хлороформом препарат контролировали на специфическую стерильность и отсутствие контаминации посторонней микрофлорой.
Изменение параметров процесса при подборе условий размножения бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов и186 описаны в соответствующих разделах. Метод определения концентрации фаговых частиц Концентрацию фаговых частиц определяли методом агаровых слоев, предложенным A. Gratia в 1936 г., который является наиболее простым и точным для количественной характеристики испытуемого бактериофага. Сущность метода и техника работы заключается в следующем: готовили взвесь спор B. anthracis СТИ согласно стандарту мутности (ОСО 42-28-85, 10 единиц) и засевали 0,1 мл взвеси в 3 мл бульона Хоттингера. Инкубировали 5 ч при температуре (36±1) 0С . Препараты бактериофага титровали с десятикратным шагом до разведения 10-10 с обязательной сменой пипеток. Предварительно разлитый в пробирки 0,7 % агар Хоттингера в количестве 3 мл расплавляли и остужали до 47 0С и заражали 0,1 мл 5-часовой бульонной культурой штамма B. anhracis СТИ. Затем добавляли точно по 0,5 мл одного из разведений препарата бактериофага, делая не менее трех высевов из каждого разведения. Смесь быстро перемешивали, вращая пробирку, и выливали на поверхность агара Хоттингера. После того, как верхний слой застывал, чашки переворачивали и помещали в термостат на 24 ч при (36±1) 0С . Бактерии размножались внутри верхнего слоя агара в виде негативных колоний (прозрачные пятна) на фоне роста B. anthracis.
Расчет концентрации бактериофага проводили исходя из количества его негативных колоний на фоне сплошного роста индикаторной культуры и степени наибольшего разведения, в котором еще наблюдались такие колонии. Концентрацию рассчитывали по формуле (2) К = 2а10n, где: К – количество корпускул исследуемого бактериофага в мл препарата, 2 – постоянный коэффициент, позволяющий корректировать показатель на 1 мл препарата (по методике вносят 0,5 мл), а – количество негативных колоний на чашке с учитываемым разведением бактериофага, n – порядковый номер разведения препарата, по которому проводится расчет. 2.2.2.3 Определение чувствительности культур к специфическим бактериофагам Чувствительность культур к специфическим бактериофагам определяли чашечным методом. Свежеприготовленные чашки с агаром Хоттингера перед по 44 становкой пробы подсушивали в термостате. Расчерчивали дно чашки снаружи на сектора. В 4,5 мл бульона Хоттингера засевали бактериологической петлей 18-часовую вегетативную культуру исследуемого штамма и культивировали в течение 5 ч, после чего в объеме 0,5 мл наносили на подсушенную поверхность агара Хоттингера. После полного впитывания жидкости, в центр каждого сектора наносили автоматической пипеткой каплю (6,5 мкм) цельного препарата одного из бактериофагов, после полного впитывания бактериофагов чашки переворачивали и инкубировали при (36±1) 0С в течение 20 ч. Результат оценивали визуально. Посевы просматривали невооруженным глазом. Лизис оценивали по четырехкресто-вой системе. Полный лизис культуры на месте нанесения бактериофага оценивали на (++++); наличие единичных колоний культуры на фоне зоны её лизиса в месте нанесения - на (+++), резкое ослабление роста – на (++), наличие единичных негативных колоний бактериофага на фоне сплошного роста культуры – на (+), отсутствие лизиса – (-). Положительной считали пробу при оценке не менее чем на (+++).
Методы оценки специфической активности бактериофагов
Активность бактериофага выражают степенью его разведения, при котором происходит полный лизис чувствительной тестовой культуры. Так, например, титр 10-6 означает, что фаг проявляет свое литическое действие при разведении в 1 000 000 раз.
Титр бактериофага определяли на плотных питательных средах: 1) число активных единиц бактериофага, содержащихся в 1 мл фаголизата; 2) по Грациа – количество негативных колоний, образовавшихся из определенного объема (обычно 1 мл) взвеси бактериофага (исследуемого материала) при ее культивировании совместно с чувствительными бактериями на плотной питательной среде. Диагностический рабочий титр (ДРТ) – наибольшее разведение бактериофага, дающее сливной лизис культур индикаторных штаммов.
Кроме того, специфическую активность препаратов сибиреязвенных бактериофагов характеризует их способность лизировать штаммы B. anthracis с различными фенотипическими свойствами. Для этого определяли чувствительность к изучаемым бактериофагам 114 штаммов B. anthracis с различными характеристиками и выражали в виде % чувствительных от общего числа штаммов.
Метод определения нарастания титра бактериофага (РНФ)
Реакция нарастания титра фага (РНФ) основана на свойстве индикаторного бактериофага строго специфично размножаться только в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и повышением титра. В опыте был использован сибиреязвенный бактериофаг R/D-RH-6.
Готовили взвесь 20-часовой агаровой культуры испытуемого штамма B. anhracis по стандарту мутности (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) 10 единиц в физиологическом растворе с 0,1 % Твина-80 и ее десятикратное разведение до расчетной концентрации 1108 КОЕ/мл. Из последнего 5 мл взвеси вносили в колбу с 50 мл бульона Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта и хлорида кальция. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через 3 ч добавляли 1 мл препарата бактериофага R/D-RH-6 с концентрацией 1106 БОЕ/мл, после чего продолжали инкубацию в этих же условиях в течение 8 ч. При внесении 1 мл препарата бактериофага с концентрацией 1106 БОЕ/мл в 50 мл бульонной культуры B. anthracis его начальная концентрация в бульоне составляла 2104 БОЕ/мл. В качестве индикаторных штаммов для определения концентрации размноженного в данных условиях бактериофага использовали 31 штамм B. anthracis.
Определение спектра специфической литической активности сибиреязвенных бактериофагов
В СтавНИПЧИ в период 1998-2002 гг. О.И. Цыганковой и Б.В. Солодовни-ковым была разработана биотехнология производства препарата бактериофага Гамма А-26 сибиреязвенного диагностического жидкого (сухого) и получены 2 патента [Пат. РФ № 2133273 «Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма», опубл. 20.07.1999, Бюл. № 20; Пат. РФ № 2171842 «Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26», опубл. 10.08.2001, Бюл. № 22]. После выпуска экспериментальных серий в 2002 г. производство бактериофага было приостановлено. Все экспериментальные серии хранились в ампулах при температуре (4±2) 0С в лиофилизированном или жидком состоянии.
Для возобновления производства необходимо было восстановить жизнеспособность длительно хранившегося бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26, оценить его литические свойства, отобрать наиболее продуктивные производственные штаммы (бактериофаг, штамм размножения) и штаммы для контроля специфической активности.
Для характеристики свойств бактериофагов применяется ряд показателей, которые можно условно разделить на 2 группы: количественные показатели – это концентрация бактериофага или количество фаговых корпускул (БОЕ) в 1 мл препарата и диагностический рабочий титр (ДРТ – это максимальное разведение, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие); качественные показатели – это специфичность (специфичность бактериофага сводится к избирательному действию на отдельные виды и даже типы микробов) и специфическая активность, которая оценивается по спектру литической активности бактериофага в отношении штаммов определенных видов бактерий [Адамс М., 1961; Ляпустина Л.В., 2004].
Важным фактором, влияющим на воспроизводство бактериофагов, являются индивидуальные свойства штамма микроба, используемого для их репродукции. Для репродукции сибиреязвенного бактериофага необходим штамм B. anhracis, обеспечивающий высокие количественные показатели и стабильность качественных (специфичность, специфическая активность) показателей.
Необходимость соблюдения мер биологической безопасности технологического цикла заставляет отдавать предпочтение штаммам B. anthracis с низкой вирулентностью (желательно, авирулентных), если они обеспечивают получение препаратов, удовлетворяющих выше перечисленным требованиям. Для изучения возможности экспериментально-производственного получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, были использованы вакцинные штаммы B. anthracis, авирулентность которых обусловлена отсутствием плазмиды pХO2. В качестве штаммов размножения были апробированы 6 вакцинных штаммов B. anthracis: СТИ, СТИ-ПР, 55, 228/8, Sterne 34F2, Ichtiman.
Процесс культивирования бактериофагов предполагает создание, с помощью питательных сред, благоприятных условий для размножения фаговых частиц.
Поскольку наиболее простой является методика репродукции сибиреязвенных бактериофагов в жидких питательных средах, то дальнейший подбор производственной пары «штамм размножения – бактериофаг» проводили путем пассирования бактериофага Гамма А-26 в бульонных культурах вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба.
Питательную среду засевали 1,0 мл взвеси вегетативной культуры (1108 КОЕ/мл), с оптической плотностью 10 единиц стандарта ОСО ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в 50 мл бульона Хоттингера, содержащего дополнительно 0,2 г дрожжевого экстракта и 0,15 мл 10 % раствора СаCl2. После инкубации в течение 5 ч при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере (70 об/мин), вносили 2,0 мл бактериофага Гамма А-26 с концентрацией 4107 БОЕ/мл. После инкубации в течение 24 ч в термостате в прежних условиях, фаголизаты фильтровали. Фильтраты использовали в качестве препаратов бактериофагов.
В качестве доступного критерия оценки эффективности отобранных штаммов применялось определение ДРТ и концентрации конечного продукта производства – бактериофага (таблица 4). Концентрацию фаговых частиц определяли методом агаровых слоев по Грациа [Gratia A., 1936]. Индикаторной культурой служил вакцинный штамм B. anthracis СТИ.
Как видно из таблицы 4, бактериофаг Гамма А-26 успешно размножался на всех используемых вакцинных штаммах, наилучшие результаты были получены при использовании штамма B. anthracis 228/8.
