Содержание к диссертации
Введение
1. Модифицированные протеиназы как катализаторы синтеза пептидов в органической среде 10
1.1. Механизм катализа пептидного синтеза протеиназами 10
1.1.1. Механизм катализа пептидного синтеза металлопротеиназами на примере термолизина 11
1.1.2. Механизм катализа пептидного синтеза сериновыми протеиназами 14
1.2. Влияние различных факторов на синтазную активность ферментов 15
1.3. Синтез пептидов, катализируемый модифицированными протеиназами 17
1.3.1. Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными протеиназами 17
1.3.1.1. Нековалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе пептидов 18
1.3.1.2. Ковалентно иммобилизованные протеиназы в синтезе пептидов 27
1.3.1.3. Протеиназы, модифицированные альтернативными способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде 36
1.3.2. Влияние содероісания воды вреащионной среде на эффективность проведения пептидного синтеза, катализируемого модифицированными протеиназами 42
1.3.3. Субстратная специфичность нативных и модифицированных протеиназ в пептидном синтезе в органической среде 45
1.3.3.1. Субстратная специфичность металлопротеиназ в реакциях пептидного синтеза на примере термолизина 46
1.3.3.2. Субстратная специфичность сериновых протеиназ в реакциях пептидного синтеза в органической среде 48
2. Обсуждение результатов 52
2.1. Получение и характеристика биокатализаторов на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта 52
2.1.1. Выбор протеиназ для иммобилизации 52
2.1.2. Получение носителей для иммобилизованных ферментов, базирующихся на криогелях поливинилового спирта 53
2.1.3. Иммобилизация протеиназ на криогеле поливинилового спирта 56
2.1.3.1. Иммобилизация трипсина на криогеле поливинилового спирта 57
2.1.3.2. Иммобилизация субтилизина, термолизина и химотрипсина на криогеле поливинилового спирта 64
2.2. Использование иммобилизованных ферментов в ферментативном пептидном синтезе 68
2.2.1. Использование иммобилизованного трипсина в ферментативном пептидном синтезе 69
2.2.2. Использование иммобилизованного субтилизина в ферментативном пептидном синтезе 71
2.2.3. Использование иммобилизованного термолизина в ферментативном пептидном синтезе 86
2.2.4. Синтез хромогенных и флуорогенных субстратов протеиназ под действием иммобилизованных ферментов 94
3. Экспериментальная часть 105
3.1. Иммобилизация протеиназ на криоПВСГ 107
3.1.1. Активация криогеля ПВС дшинилсульфоном 107
3.1.2. Активация криогеля ЛВС глутаровым альдегидом 107
3.1.3. Иммобилизация трипсина на активированном носителе 107
3.2. Изучение ферментативных свойств иммобилизованных ферментов в водных растворах 108
3.2.1. Определение гидролитической активности иммобилизованного трипсина 108
3.2.2. Изучение стабильности иммобилизованного трипсина в водном буфере 108
3.2.3. Определение активности иммобилизованного субтилизина 109
3.2.4. Изучение стабильности иммобилизованного субтилизина в водном буфере 109
3.2.5. Измерение ферментативной активности термолизина по гидролизу Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg 110
3.2.6. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в водном буфере 110
3.2.7. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в смесях органических растворителей 111
3.2.8. Определение активности иммобилизованного химотрипсина 111
3.3. Изучение иммобилизованных ферментов в синтезе пептидов 112
3.3.1. Синтезы, катализируемые иммобилизованным трипсином 112
3.3.1.1. Синтез Z-Phe-Arg-Leu-pNA 112
3.3.1.2. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 112
3.3.2. Синтезы, катализируемые иммобилизованным субтилизином 113
3.3.2.1. Зависимость скорости синтеза от концентрации субстратов 113
3.3.2.2. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA (модельнаяреакция) 113
3.3.2.3. Изучение зависимости синтеза Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA от содержания ДМФ. 114
3.3.2.4. Конденсация Z-Ala-Ala-Leu-OMe (Z-Ala-Ala-Leu-OH) и Phe-pNA 114
3.3.2.5. Синтез Z-Leu-Phe-pNA и Z-Ala-Leu-Phe-pNA 114
3.3.2.6. Синтез Boc-Leu-Phe-pNA 115
3.3.2.7. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA 115
3.3.2.8. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA 116
3.3.2.9. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Glu-pNA 116
3.3.2.10. Препаративный синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA 116
3.3.2.11. Синтез Z-Thr-Ala-Thr-Asp-pNA 117
3.3.3. Синтезы, катализируемые иммобилизованным термолизином 117
3.3.3.1. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA в смеси 25% ацетонитрил/75% ДМФ 117
3.3.3.2. Изучение влияния концентрации иммобилизованного термолизина на эффективность синтеза Z-Ala-Ala-Leu-pNA 118
3.3.3.3. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala- Leu-pNA от концентрации исходных компонентов 118
3.3.3.4. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala-Leu- pNA от содержания ДМФ 118
3.3.3.5. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala-Leu- pNA от содержания воды в реакционной смеси 119
3.3.3.6. Изучение зависимости эффективности синтеза Z-Ala-Ala-Leu- pNA от содержания ДМСО 119
3.3.3.7. Синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA, катализируемый одним образцом иммобилизованного термолизина, в смеси 70% ацетонитрил/20% ДМФ/10% вода 119
3.3.3.8. Конденсация Z-Ala-Ala-OH и Phe-pNA 119
3.3.3.9. Препаративный синтез Z-Ala-Ala-Leu-pNA 120
3.3.3.10. Конденсация Z-Asp-OH и Phe-OMe 121
3.3.4. Синтезы, катализируемые иммобилизованным химотрипсином 121
3.3.4.1. Синтез Glp-Phe-Ala-AMC 121
3.3.4.2. Изучение возмооїсности повторного использования иммобилизованного химотрипсина в синтезе Glp-Phe-Ala-AMC 122
3.3.4.3. Препаративный синтез Glp-Phe-Ala-AMC 122
Выводы 123
- Влияние различных факторов на синтазную активность ферментов
- Протеиназы, модифицированные альтернативными способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде
- Использование иммобилизованных ферментов в ферментативном пептидном синтезе
- Изучение ферментативных свойств иммобилизованных ферментов в водных растворах
Введение к работе
Синтез пептидов, катализируемый протеиназами, является одним из наиболее перспективных подходов к получению практически важных биологически активных веществ. Проведение ферментативного пептидного синтеза в органических средах с низким содержанием воды способствует повышению эффективности реакций пептидообразования. Это обусловлено тем, что в присутствии органических растворителей более полно, чем в воде, реализуется сдвиг равновесия в сторону образования продуктов синтеза, уменьшается риск протекания побочных реакций гидролиза и возрастает растворимость гидрофобных соединений. В то же время органическая среда оказывает ингибирующее воздействие на ферменты, лишая их необходимой для осуществления каталитических функций гидратной оболочки. Эффективным подходом для стабилизации протеиназ в органических средах является их ковалентная и нековалентная фиксация на нерастворимых подложках. Однако протеиназы, закрепленные на носителе за счет физической адсорбции, находят ограниченное применение в пептидном синтезе из-за опасности вымывания их в раствор и значительной инактивации. Ферменты, ковалентно фиксированные на инертной матрице, лишены этих недостатков. В этой связи актуальной представляется разработка эффективной биокаталитической системы, адаптированной к условиям синтеза пептидов в органической среде, на основе протеиназ, ковалентно иммобилизованных на подходящем макропористом носителе.
Мы предлагаем новые биокатализаторы на основе протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта. Целью работы являлось исследование протеиназ, иммобилизованных на криогеле поливинилового спирта, как катализаторов ферментативного синтеза пептидов в органической среде.
Влияние различных факторов на синтазную активность ферментов
В литературе имеется ограниченное число работ, касающихся возможности адаптации нативных протеиназ к условиям функционирования в неводных средах в качестве катализаторов синтеза пептидов. Показано, что каталитическую активность ферментов в органических растворителях можно регулировать введением различных добавок как в препараты протеиназ на стадии их приготовления, так и непосредственно в реакционную среду. Большое значение для стабильности ферментов имеет состав буферных систем, используемых для растворения ферментов. Для термолизина чаще всего использовались его растворы в Tris-HCl буфере в довольно широком диапазоне концентраций (до 100 мМ). В ряде случаев применялись другие буферные системы: Mes/NaOH [26], HEPES [20, 27], BES/NaOH [28], MOPS/NaOH [29, 30]. Фосфатные буферные растворы, по данным [11], ингибировали фермент. Для предотвращения автолиза и поддержания стабильности белковой молекулы в буферы добавляли хлорид или ацетат кальция (5-50 мМ). В отдельных работах в роли водной среды использован водный раствор ацетата кальция [20]. Влияние нейтральных солей на активацию/инактивацию термолизина в пептидном синтезе была изучена Иное с сотр. [31, 32]. Было показано, что присутствие нейтральных солей в высоких концентрациях (1-4 М) значительно (в 6-7 раз в присутствии 3.8 М NaCl) увеличивает скорость синтеза Z-Asp-Phe-OMe (система /ярш-бутанол - вода, 95:5), предшественника подсластителя аспартама, содержащего в Ррположении остаток L-аспарагиновой кислоты. Степень активации солями изменялась в ряду LiONaOKCl. К аналогичным результатам привело исследование синтеза пептидов Fua-Phe-Ala-NH2 и Fua-Leu-Ala-NH2, катализируемого термолизином, в работе [32]. В работе [4] описано влияние на стабильность субтилизина BPN в органических растворителях концентрации буфера, в присутствии которого была проведена лиофилизация фермента. При повышении концентрации фосфатного буфера, в присутствии которого был лиофилизован субтилизин BPN , от 0.1 мМ до 10 мМ стабильность фермента в 99% ДМФ значительно увеличивалась. Природа противоиона буферной соли тоже оказывала значительное влияние на стабильность фермента в органических растворителях. При концентрации ДМФ или этанола, в которых был суспендирован субтилизин, выше, чем 90%, фермент лиофилизованный в присутствии неорганического буфера, терял половину своей активности в течение нескольких часов, С другой стороны, время полужизни фермента, лиофилизованного из смешанных буферов, содержащих как органические, так и неорганические ионы, в органических растворителях составляло меньше минуты.
При снижении концентрации органического растворителя более эффективными стабилизаторами фермента, наоборот, оказывались смешанные буферы. По всей вероятности, смешанные буферы гораздо лучше растворимы в органическом слое, чем неорганические, и при увеличении концентрации органического растворителя фермент лишается солевой оболочки, так как она переходит в фазу растворителя. В то же время, неорганические противоионы могут координировать большее количество молекул воды по сравнению со смешанными, таким образом увеличивая гидратную оболочку фермента. Влияние на активность ферментов в органической среде таких факторов, как рН, температура, давление, термостабильность, было установлено на примере исследования ферментативного синтеза пептидов, катализируемого термолизином. В работе. [33] были изучены температурная зависимость активности термолизина, а также его термо- и рН-стабильность в водном буфере и в системе этилацетат/вода в соотношении 95:5. Активность фермента определяли по синтезу Z-Ala-Phe-OMe, предшественника горького дипептида. Было показано, что в обоих случаях термолизин обладает довольно высокой стабильностью при температуре 60С, а максимальная активность наблюдалась в области более высоких температур (60-80С). Кроме того, в обоих средах термолизин проявлял достаточно высокую и активность в диапазоне рН 5.5 - 11.5 с максимумом в области рН 7-Ю и был стабилен при хранении. Таким образом, повышение температуры реакции, катализируемой термолизином, до 60С благоприятно сказывается на эффективности ее протекания как в водной, так и в водно-органической среде. Таким образом, повышение эффективности синтеза, катализируемого протеиназами, может достигаться за счет оптимального подбора каждого из компонентов системы органическая среда - вода - фермент, а также за счет изменения температуры реакционной системы. Однако наиболее простым представляется способ, при котором регулируется состав водной фазы, в которой содержится фермент, путем введения неорганических солей или подбором основных компонентов буферной системы. Все эти возможности могут быть реализованы в системе, содержащей модифицированный фермент и органические растворители. 1.3. Синтез пептидов, катализируемый модифицированными протеиназами 1.3.1. Синтез пептидов, катализируемый иммобилизованными протеиназами Одним из способов повышения эффективности действия ферментов в среде органических растворителей является их иммобилизация. Под иммобилизованными понимают ферменты, ковалентно или нековалентно связанные с разнообразными носителями, с сохранением (частичным или полным) каталитической активности [34, 35]. В случае иммобилизации ферментов на нерастворимых носителях реализуется принцип механического закрепления конформации фермента. Для связывания ферментов с нерастворимыми носителями используют как нековалентную (физическую), так и ковалентную (химическую) иммобилизацию.
В качестве носителей для иммобилизации ферментов широко используют как органические (природные и синтетические) полимеры, так и неорганические материалы [35]. Наиболее часто используемыми реакциями при получении ковалентно иммобилизованных ферментов являются реакции ацилирования; алкилирования, азосочетания, образования иминов и, в меньшей степени, окислительно-восстановительные и радикальные реакции. Иногда используются и смешанные методы [36]. Иммобилизация белков и ферментов на нерастворимых подложках была предметом многочисленных исследований. В течение последних 10-15 лет было предложено множество различных методов получения и широкий диапазон применения иммобилизованных биокатализаторов. Поскольку белковые молекулы могут связываться с носителями, на поверхности которых имеются заряженные, гидрофобные и полярные группы, то число носителей, которые принципиально могли бы использоваться для нековалентной иммобилизации белков, велико. В литературе описана иммобилизация а-химотрипсина и субтилизина на полиакриламидах [37], микро- и мезопористых цеолитах [38], а-химотрипсина, папаина, термолизина и бромелаина на целите [29, 39], включение сериновых протеиназ а-химотрипсина, трипсина и субтилизина Карлсберг в золь-гелевую матрицу силикагеля [40], а также адсорбция сериновых протеиназ на сефарозе [41]. В ряде случаев иммобилизация такого типа была эффективна против денатурации и необратимой инактивации белков в системах, содержащих органические растворители [29, 37-39, 41-44]. Кроме того, иммобилизованные протеиназы характеризовались высокой стабильностью в системах с низким содержанием воды, в первую очередь из-за их высокой устойчивости к автолизу и агрегации. Так, адсорбция трипсина и сериновой протеиназы типа XIX из Aspergillus soaje на полиэлектролитном гидрогеле хитоксане (ChitoXan), образующемся в результате ионных и ван-дер-ваальсовых ваимодействий между хитином и ксантаном, приводила к значительному увеличению (до 7 раз) удельной активности биокатализаторов по сравнению с нативными ферментами как в водной, так и в органической среде (толуоле, изооктане и циклогексане) [42]. Активность иммобилизованной протеиназы XIX и трипсина через 7 дней хранения в водном фосфатном буфере оставалась практически неизменной, что свидетельствует о хорошем стабилизирующем эффекте матрицы хитоксана. Биокатализаторы, полученные путем иммобилизации субтилизина с помощью мезопористых материалов на основе силикагеля (марки FSM-16, МСМ-41 и SBA-15) исследовались в работе [43]. Было показано, что степень адсорбции ферментов на FSM-16, МСМ-41, модифицированных катионными ПАВ, гораздо выше по сравнению с SBA-15, который модифицировали неионогенными ПАВ.
Протеиназы, модифицированные альтернативными способами, как катализаторы пептидного синтеза в органической среде
Хотя, как было указано ранее, ферменты, иммобилизованные на нерастворимых носителях, отличаются высокой технологичностью, связанной, в основном, с легкостью отделения продукта реакции и регенерации катализатора, скорость реакции в таких гетерогенных системах часто контролируется диффузией субстрата к ферменту и иногда возникает необходимость получения растворимых стабилизированных препаратов [68]. Для получения такого рода биокатализаторов может быть использован метод ковалентной модификации низкомолекулярными и высокомолекулярными соединениями, а также комплексообразование с низкомолекулярными и высокомолекулярными соединениями. Одним из зарекомендовавших себя способов стабилизации ферментов к инактивации в водно-органических смесях является метод нековалентного комплексообразования, в частности с высокомолекулярными соединениями. В работах [69-71] Гладилин с сотрудниками исследовали фермент-полиэлектролитные комплексы на примере комплексов а-химотрипсина с полибреном и полиакрилатом. Были изучены зависимости максимальной скорости гидролиза специфического субстрата - Bzyr-pNA нативным и модифицированным ферментом в водно-органических смесях от концентрации органического растворителя для этанола и диметилформамида. Было показано, что наибольшая разница между модифицированным и нативным ферментом наблюдается при гидролизе в среде, содержащей 10-30% органического растворителя; активность увеличивается в несколько раз. Для комплекса а-химотрипсина с полиакриламидом были получены кинетические кривые синтеза N-Acyr-Lys-OH из этилового эфира N-ацетилтирозина и лизина при различных концентрациях диметилформамида в реакционной среде. Было показано, что наиболее оптимальными условиями пептидного синтеза будут 60% содержание ДМФ и 6% воды в ацетонитриле. Метод ковалентноп модификации позволяет вводить на поверхность белка большое количество различных фрагментов без существенного искажения конформации белка, поэтому этот метод благоприятен для регуляции растворимости и стабилизации ферментов к агрегации и инактивации в системах вода-органический растворитель. В ряде работ Мерфи и О Фагайн [72-74] был исследован трипсин, модифицированный различными химическими реагентами: N- гидроксисукцинимидацетатом и бис-сукцинат-Ы-гидроксисукцинимидным эфиром этиленгликоля. В результате реакции с этими реагентами были промодифицированы примерно 8 из 14 остатков лизина в трипсине, в результате чего был изменен заряд поверхности фермента.
Полученные биокатализаторы были более стабильны в водно-органических смесях и термоустойчивы по сравнению с нативным ферментом. Было показано, что нейтрализация положительных зарядов лизина улучшает связывание субстратов в активном центре; значение константы Михаэлиса снизилось как для амидных (Boc-Gly-Gly-Arg-AMC), так и для эфирных (Z-Lys-SBzl) субстратов, а значение каталитической константы kcat возросло. С помощью трипсина, модифицированного бис-сукцинат-N-гидроксисукцинимидпым эфиром, был синтезирован дипептид Bz-Arg-Leu-NH2 в ацетонитриле, содержащем 5% воды. По сравнению с нативным трипсином, синтез протекал эффективней (рис. 2). В конце 80-х годов было описано применение в синтезе комплекса термолизина с полиэтиленгликолем (ПЭГ) [75]. Комплекс был получен обработкой фермента активированным монометоксинолиэтиленгликолем. Было показано, что модификация фермента позволяет проводить синтезы пептидов Z-Phe-Xaa-NH2 (Хаа = Phe, Leu, Val) с довольно высокой эффективностью 60-100% за 17 ч (более подробно см. п. 1.3.3.1). Аналогичным способом был получен а-химотрипсин, модифицированный ПЭГ [76, 77]. С его помощью были получены с количественными выходами за 15 ч Bzyr-Xaa-NH2 (Хаа = Phe, Туг, Leu, Val, Met, D-Met), Ac-Phe-Phe-NH2, Acrp-Phe-NH2, Bz-Arg-Phe-NH2, Bz-Lys-Phe-NH2. Реакции проводили в бензоле с 2-5-кратными избытками аминокомпонентов и соотношением фермент-субстрат 1:1000. Поскольку такие биокатализаторы нельзя непосредственно отделить от реакционной среды, то реакцию останавливали добавлением 5М уксусной кислоты в бензоле. Высокая каталитическая активность биопластиков на основе химотрипсина для синтеза целого ряда амидов ди- и трипептидов была показана в работах [78-80]. Начальные скорости синтеза приведены в таблице 1. Из таблицы видно, что эффективность биокаталитических пластиков была намного выше, чем химотрипсина в виде гидрофобного ионного комплекса с АОТ (АОТ-ХТ). Например, в пептидном синтезе по реакции (1) в среде изооктан/тетрагидрофуран (ТГФ) 7/3, биокатализатор химотрипсин-пММА был в 20 раз более реакционноспособен, чем АОТ-ХТ (таблица 1). В полярных растворителях, таких как этилацетат, ТГФ, ацетонитрил иммобилизованный фермент был примерно в 100-1200 раз более активен, чем АОТ-ХТ. Значительная активация фермента происходила, вероятно, из-за поддержания нативной структуры фермента в полярных растворителях при введении в матрицу. Была определена эффективная диффузия субстрата в матрицу. В воде фактор диффузии Гц составил 0.1, в органических растворителях тц=0.9 для ХТ-пММА (нагрузка 1% вес.) и 0.4 для ХТ-пВАц (нагрузка 9.6% вес). Таким образом, влияние диффузионных ограничений невелико. Авторами отмечается высокая стабильность биокомпозитов в гексане и ТГФ - 3 недели в гексане без какой-либо заметной потери активности, и около 20% остаточной активности после 1.5 ч в ТГФ. Для сравнения, остаточная активность комплекса АОТ-ХТ составила около 3% за то же время инкубации.
Быстрое нелинейное падение активности АОТ-ХТ в ТГФ можно отнести к образованию множественных форм частично денатурированного Партридж с сотрудниками [81] для синтеза пептидной связи использовали суспендированные в полярных органических растворителях поперечно сшитые кристаллы субтилизииа (алкалазы Bacillus licheniformis). Препарат фермента проявлял сравнимую каталитическую активность при проведении реакции переэтерификации N-Ac-Phe-OEt 1-пропанолом в ряде смешивающихся с водой органических растворителей - спиртах, ацетоне, ТГФ, ДМФА, пиридине. Однако образование пептидной связи в синтезе Z-Phe-OBz + Leu-NH2 Z-Phe-Leu-NH2 наиболее эффективно проходило в ацетонитриле. В этилацетате, ТГФ реакция протекала более медленно, в 2-метил-2-пропаноле, 3-метил-З-пентаноле и пиридине наряду с синтезом дипептида в значительной степени проходил гидролиз ацильного донора, а в этаноле и изопропаполе основными продуктами реакции были Z-Phe-OEt и Z-Phe-OiPr соответственно. В ацетонитриле с использованием поперечно сшитых кристаллов субтилизина была синтезирована серия амидов N-защищенных ди- и трипептидов. В качестве нуклеофилов одинаково эффективными оказались как L так и D-изомеры амидов Leu и Phe, а с использованием трет-бутиловых эфиров аминокислот реакция протекала довольно медленно. Для получения трипсина, модифицированного полистиролом, Иманиши с сотр. сначала обрабатывали трипсин 4,4 -азо-бис(4-циано)валериановой кислотой и подвергали радикальной полимеризации со стиролом [82]. Каталитическую активность полученного биокатализатора измеряли, проводя в хлороформе синтезы Tos-Lys-OMe + L-Phe-NI I2 - Tos-Lys-L-Phe-NH2, Tos-Lys-OMe + L-Leu-NH2 - Tos-Lys-L-Leu-NH2, Tos-Lys-OMe + D-Phe-NH2 -+ Tos-Lys-D-Phe-NH2. Самая высокая скорость образования продукта наблюдалась для Tos-Lys-L-Phe-NH2 (8 мкмоль/ч «мг трипсина), а в случае синтеза дипептида с остатком D-фенилаланина она составила 0.7 мкмоль/ч «мг трипсина. Эти данные, по мнению ученых, хорошо согласовывались с имеющимися ранее в литературе сведениями о сохранении стереоселективности ферментами, суспендированными в органических растворителях [83], хотя чаше всего это зависит от природы самого фермента и органических растворителей. Таким образом, модифицированные полимерными реагентами ферменты могут являться эффективными катализаторами синтеза пептидов в среде органических растворителей. Существенным недостатком их, однако, является трудность отделения фермента от реакционной смеси и, в частности, от продукта синтеза. 1.3.2. Влияние содержания воды в реакционной среде на эффективность проведения пептидного синтеза, катализируемого модифшщрованнъши протеиназами Для работы фермента в органических средах требуются малые количества воды, которые, как правило, поставляются матрицей носителя.
Использование иммобилизованных ферментов в ферментативном пептидном синтезе
Как указывалось в литературном обзоре, ценные сведения о состоянии фермента в среде органических растворителей можно получить при изучении реакций этерификации и переэтерификации. В случае протеолитических ферментов следует рассматривать такую их важную функцию, как катализ реакций образования пептидных связей. С этой целью иммобилизованные биокатализаторы были исследованы в реакциях ферментативного синтеза пептидов в органической среде. Синтезы проводили в смесях различного состава, содержащих ДМФ или ДМСО и ацетонитрил. Выбор этих растворителей связан с тем, что ацетонитрил обладает наименьшим инактивирующим воздействием на гидролитические ферменты [88], а добавление ДМФ/ДМСО необходимо для растворения защищенных пептидных и аминокислотных производных, однако, как правило, снижают каталитическую активность препарата. 2.2.1. Использование иммобилизованного трипсина в ферментативном пептидном синтезе Уникальная субстратная специфичность трипсина, а именно способность гидролизовать в белках пептидные связи только после остатков аргинина или лизина, делает эту протеиназу привлекательной как для целей ферментативного гидролиза белковых препаратов, так и для пептидного синтеза. Это открывает возможность введения в пептидігую цепь остатков аргинина и лизина, минуя стадии защиты и деблокирования гуанидиногруппы аргинина и є-аминогруппьі лизина. Препараты иммобилизованного трипсина были апробированы в качестве биокатализаторов в реакциях пептидного синтеза в среде органических растворителей на примере реакции образования Z-Phe-Arg-Leu-pNA из Z-Phe-Arg-ОСНз и Leu-pNA. Реакцию проводили в ацетонитриле, содержащем 3 об.% ДМФ, при эквимолярном соотношении амино- и карбоксильного компонентов. Биокатализаторы предварительно промывали смесью органических растворителей, вносили в реакциошгую смесь, содержащую амино- и карбоксильные компоненты, и затем перемешивали при комнатной температуре в течение необходимого времени. Из реакционной смеси периодически отбирали пробы и анализировали методом ВЭЖХ.
Результаты проведенных синтезов суммированы в таблице 7. При использовании 100 мМ концентраций исходных компонентов и соотношении фермент-субстрат 1:580 через 48 ч выход продукта составил 50% для биокатализатора КГ-ДВС-И и 44% при введении 112 мг биокатализатора КГ-ГА-П, содержащего 12.7 мг фермента/г носителя (таком же соотношении фермент-субстрат). Увеличение концентрации исходных компонентов в 2 раза (200 мМ) приводило к ускорению реакции, и через 24 ч выход продукта составлял 65% и 50% для тех же биокатализаторов, соответственно. В конечной реакционной смеси обнаруживались только исходные компоненты и целевой продукт, т.е. побочные процессы не протекали. Влияние предварительной промывки биокатализатора смесью органических растворителей или водным буферным раствором было исследовано для препарата КГ-ДВС-Н. При 200 мМ концентрации исходных компонентов и одинаковом мольном отношении E:S = 1:3130 через 24 ч выход целевого продукта составил 9% при предварительной промывке биокатализатора органическим растворителем и 53% при предварительной промывке гранул буферным раствором. Одна из причин существенной зависимости синтазной активности иммобилизованного трипсина наличия предварительных промывок биокатализатора может быть связана с появлением заряда на гуанидиногруппе аргинина в водной среде и, как следствие этого, повышением селективности «узнавания» ферментом специфической группировки субстрата. При проведении реакции с катализатором, предварительно промытым буферным раствором, обнаружено, что помимо реакции аминолиза протекает реакция гидролиза карбоксильного компонента Z-Phe-Arg-OCH3 до Z-Phe-Arg-OH. Увеличение концентрации карбоксильного компонента в 2 раза не приводило к возрастанию выхода целевого продукта, а сопровождалось ростом содержания продукта гидролиза до 30%. В отдельных опытах было показано, что продукт гидролиза карбоксильного компонента Z-Phe-Arg-OH также способен взаимодействовать с аминокомпонентом по реакции Z-Phe-Arg-OH + Leu-pNA - Z-Phe-Arg-LpNA. Однако реакция протекает в этом случае значительно медленнее, а выход продукта через 24 ч составил только 12% при использовании биокатализатора КГ-ДВС-П и 36% - КГ-ГА-Н. Возможность эффективной работы иммобилизованного фермента в среде с повышенным до 40% содержанием ДМФ была продемонстрирована на примере синтеза л-нитроанилида защищенного тетрапептида Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA из Z-Ala-Ala-Arg-ОСНз и Phe-pNA. При 100 мМ концентрации исходных компонентов выход продукта реакции, катализируемой препаратом КГ-ДВС-П, за 24 ч составил 62% и 34% при катализе препаратом КГ-ГА-Н. Таким образом, полученные препараты иммобилизованного трипсина способны катализировать реакции пептидного синтеза в среде органических растворителей, причем без дополнительной защиты гуанидиногруппы аргинина.
На основании полученных экспериментальных данных можно выдвинуть предположение, что трипсин, иммобилизованный на криоПВСГ, сохраняет свою субстратную специфичность в среде органических растворителей. Для эффективной работы биокатализатора необходима промывка его водой. 2.2.2. Использование иммобилизованного субтилизина в ферментативном пептидном синтезе На примере модельной реакции катализируемой иммобилизованным на криоПВСГ субтилизином, была изучена синтазная активность этого биокатализатора (нумерация пептидов согласно табл. 8). Выбор этой реакции в качестве модельной обусловлен тем, что структура исходных компонентов хорошо соответствует специфичности субтилизина, кроме того, реакция была подробно изучена ранее для субтилизина 72, иммобилизованного на криоПВСГ, в водно-органических и безводных средах [114]. Общая схема реакции представлена ниже. В реакцию вводили эквимолярные количества амино- и карбоксильного компонентов. За ходом реакции следили с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ. Зависимость эффективности синтеза от состава смеси органических растворителей была изучена на примере получения модельного тетрапептида 5 в смесях ДМФ/ацетонитрил с концентрацией ДМФ от 60 до 95%. Наибольшая скорость реакции образования Z-AIa-Ala-Leu-Phe-pNA наблюдалась в системе, содержащей 60% ДМФ (рис. 13). Уже через 1 час выход целевого продукта составил 96%. Увеличение концентрации ДМФ приводило к снижению скорости накопления продукта, однако даже в 95% ДМФ синтез продукта не прекращался и через трое суток выход Z-Ala-Ala-Leu-Phe-pNA составил 70%». Эти результаты коррелируют с данными по синтазной активности иммобилизованного субтилизина 72 в аналогичных средах [115, 116] и свидетельствуют о том, что ковалентная иммобилизация фермента на гидрофильной макропористой матрице криоПВСГ способствует значительной стабилизации субтилизина Карлсберг по отношению к денатурирующему воздействию ДМФ. В связи с этим в данной работе все синтезы, катализируемые иммобилизованным субтилизином, проводили при соотношении ДМФ/MeCN равном 60:40 об.%, как наиболее оптимальном и для активности биокатализатора, и для растворимости исходных соединений. Реакции проводили при эквимолярном соотношении амино- и карбоксильного компонентов (в дальнейшем под концентрацией исходных компонентов будет иметься в виду парциальная концентрация амино- и карбоксильного компонентов), а соотношение фермент-субстрат варьировалось от 1:3400 до 1:31000 (здесь, и далее моль/моль).
Изучение ферментативных свойств иммобилизованных ферментов в водных растворах
К 2.4 мл 0.05 М Tris-HCl буфера (рН 8.2) прибавляли 0.45 мл Н20 и 0.125 мл раствора Bz-D,L-Arg-pNA в ДМФ (концентрация 8.7 мг/мл). Смесь выдерживали 5- 10 мин при 37С, добавляли 17-20 мг препарата иммобилизованного трипсина и инкубировали при 37С, пока поглощение при 410 нм не достигало 0.1-0.3 оптических единиц. Реакцию останавливали прибавлением 0.5 мл 50%-ной уксусной кислоты. В контрольной пробе порядок добавления иммобилизованного фермента и уксусной кислоты был обратным. Удельную активность рассчитывали по формуле (2). Определение ферментативной активности нативного трипсина по гидролизу Bz-D,L-Arg-pNA проводили по стандартной методике [129]. Удельная активность использованных коммерческих препаратов трипсина составляла 3.7 ед/мг (I), 1.3 т$ ед/мг (И), 0.26 ед/мг (III). 3.2.2. Изучение стабильности иммобилизованного трипсина в водном буфере Препараты иммобилизованного трипсина хранили в 0.05 М HEPES/NaOH буфере, содержащем 0.02 М СаС12 (рН 7.5), при +4С и периодически отбирали пробы (по 50 мкл раствора трипсина с концентрацией 0.25 мг/мл или навески по 17-20 мг препарата иммобилизованного трипсина) и измеряли активность. За 100% принимали активность свежеполученного биокатализатора. 20-30 мг препарата иммобилизованного субтилизина (содержание белка -0.08 мг) помещали в кварцевую кювету, суспендировали в 2 мл 0.05 М Трис-НС1 буфера (рН 8.2), содержащего 2 мМ СаС12, и добавляли 50 мкл раствора Glp-Ala-Ala-Leu-pNA в ДМФ (5 мг/мл). Полученную смесь инкубировали при перемешивании при комнатной температуре в течение 10 мин. После оседания гранул биокатализатора измеряли А410. Удельную активность вычисляли по формуле: (А4Ю-А ) V ... Уд. активность = t 8.9 где А4ю- поглощение смеси при 410 нм, АК4ю - поглощение контрольного раствора, V0- общий объем пробы, мл, t - время реакции, мин, пг - масса иммобилизованного субтилизина, мг, 8.9 - молярный коэффициент экстинкции и-нитроанилина, мМ см \ 3.2.4. Изучение стабильности иммобилизованного субтилизина в водном буфере Препараты иммобилизованного субтилизина хранили в 0.05 М Трис-НС1 буфере, содержащем 1.5 мМ СаС12, рН 8.2 при +4С. Периодически отбирали навески иммобилизованного субтилизина (20-30 мг) и измеряли активность по методике 3.2.1. За 100% принимали активность препарата биокатализатора, измеренную сразу после иммобилизации. Приготовление раствора Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg.
Для приготовления раствора субстрата с концентрацией 0.5 мг/мл точную навеску растворяли при перемешивании в течение 2 часов в соответствующем объёме 0.05 М Tris-HCI буфера, рН 7.2, содержащем 50 мМ СаСЬ, нерастворившийся осадок отделяли фильтрованием на бумажном фильтре и использовали фильтрат для измерения активности. Приготовление колонки для измерения активности. В пластмассовые наконечники помещали 3 мл суспензии SP Сефадекса С-25 в воде, дожидались стекания избытка жидкости, промывали 2 мл 0.1 н. уксусной кислоты (2x1 мл), затем наносили анализируемую смесь. Измерение активности иммобилизованного термолизина. К 10-15 мг препарата иммобилизованного фермента добавляли 1 мл раствора субстрата Dnp-Gly-Gly-Ile-Arg (0.5 мг/мл) в 0.05 М Tris-HCI буфере, рН 7.2, содержащем 50 мМ СаС12, одновременно включая секундомер. Через 30-40 мин в отдельную пробирку отбирали 900 мкл раствора, добавляли 400 мкл 50% уксусной кислоты, перемешивали, наносили полученную смесь на колонки с SP-25 Сефадексом, элюировали 2 мл 0.1 н. уксусной кислоты и измеряли А3бо элюата. Удельную активность рассчитывали по формуле: ,/л (ЛбО-і 36о) У общ / ч Уд. активность = (2), t m V„po6bl где А3бо - поглощение раствора при 360 нм; Акзбо - поглощение контрольного раствора при 360 нм; V06m. - общий объём элюата, мл; є - коэффициент экстинкции Dnp-группы, 15 мМ см"; t - время реакции, мин; ш-масса навески иммобилизованного фермента, мг; Vnp. - объем пробы, наносимый на колонку, мл; Препарат иммобилизованного термолизина хранили в 0.05 М Трис-НС1 буфере (рН 7.2), содержащем 50 мМ СаС12, при температуре +4С. Периодически отбирали навески иммобилизованного термолизина (15-20 мг) и измеряли активность по методике 3.2.5. За 100% принимали активность препарата биокатализатора сразу после иммобилизации. 3.2.7. Изучение стабильности иммобилизованного термолизина в смесях органических растворителей Навеску иммобилизованного биокатализатора промывали ацетонитрилом (3x1.5 мл), смесью ацетонитрил/ДМФ соответствующего состава (3x2 мл), приливали смесь ацетонитрил/ДМФ соответствующего состава и инкубировали при комнатной температуре. Растворитель сливали, препарат промывали Трис-НС1 буфером, рН 7.2, содержащим 50 мМ СаС12, (3x1.5 мл), сушили на стеклянном фильтре и измеряли активность биокатализатора по методике 3.2.5. 3.2.8. Определение активности иммобилизованного химотрипсина Навеску 21-30 мг иммобилизованного фермента инкубировали в течение 21 мин в 2 мл 0.05 М Tris-HCl буфере, содержащем 0.05 М СаС12 (рН 8.0).
Затем добавляли 30 мкл раствора Glp-Phe-pNA (10 мг/мл в ДМФ). Через 30-40 мин отбирали аликвоту 1 мл. Реакцию останавливали прибавлением 1 мл 0.5 М уксусной кислоты и измеряли D4io- В контрольных пробах порядок добавления фермента и уксусной кислоты был обратным. Удельную активность рассчитывали по формуле: A=(DAW-Dkm)xVo6lll. (3) где extxmxVmura DK4io - поглощение контрольного раствора при 410 нм; D410 - поглощение пробы при 410 нм; V06m. - общий объём измеряемой пробы, мл; є - коэффициент экстинкции pNA-группы, 8,9 мМ"1 см 1; t - время реакции, мин; m - масса навески иммобилизованного фермента, мг; VMHKB. - объем отбираемой аликвоты. 3.3. Изучение иммобилизованных ферментов в синтезе пептидов 3.3.1. Синтезы, катализируемые иммобилизованным трипсином 3.3.1.1. Синтез Z-Phe-Arg-Leu-pNA. К 80 мг препарата иммобилизованного трипсина (содержание фермента -0.56 мг), предварительно промытого (2 х 0.5мл х 10 мин) буфером или ацетонитрилом, добавляли 180 мкл 400 мМ раствора Z-Phe-Arg-OMexHCl (80 мкмоль) в смеси ДМФ/ацетонитрил (6/94, об.%) и 180 мкл 400 мМ раствора Leu-pNA (80 мкмоль) в ацетонитриле. Реакционную смесь перемешивали при 20С и периодически отбирали пробы по 5 мкл для анализа ВЭЖХ. Время удерживания Z-Phe-Arg-Leu-pNA в градиенте (А): - 29.1 мин. Выход за 24 ч составил 60-70%. Аналогично проводился синтез при 33 мМ и 100 мМ концентрациях раствора исходных компонентов. При использовании Z-Phe-Arg-OHxHCl в качестве ацилдонора синтез проводили аналогично, добавляя 180 мкл 180 мМ раствора Z-Phe-Arg-OHxHCl (32.4 мкмоль) в смеси ДМФ/этиловый спирт/ацетонитрил (6/12/82, об. %), 180 мкл 180 мМ раствора Leu-pNA (32.4 мкмоль) в ацетонитриле. 3.3.1.2. Синтез Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA К 80 мг иммобилизованного трипсина (содержание фермента - 0.56 мг) предварительно промытому (2 х 0.4 мл х 10 мин) ацетонитрилом, добавляли 180 мкл 200 мМ раствора Z-Ala-Ala-Arg-OMe (36 мкмоль) в смеси ДМФ/ацетонитрил (60/40, об.%) и 180 мкл 200 мМ раствора Phe-pNA (36 мкмоль) в том же растворителе, перемешивали при 20С и периодически отбирали 5 мкл пробы для анализа ВЭЖХ. Время удерживания Z-Ala-Ala-Arg-Phe-pNA в градиенте (В): - 18 мин. Выход продукта за 24 ч составил 62%. 3.3.2. Синтезы, катализируемые иммобилизованным субтилизином 3.3.2.1. Зависимость скорости синтеза от концентрации субстратов 75 мг (0.16 ммоль) Z-Ala-Ala-Leu-OMe и 46 мг (0.16 ммоль) Phe-pNA растворяли в 400 мкл смеси 40 % ацетонитрил/60 % ДМФ. Из полученного раствора последовательным разбавлением смесью 40% ацетонитрил/60% ДМФ готовили растворы исходных компонентов с концентрацией 0.5-200 мМ. К препарату иммобилизованного субтилизина (8 мг, содержание белка - 0.04 мг), предварительно промытому ацетонитрилом (1x1 мл) и смесью ацетонитрил/ДМФ 40:60 (об. %) (2x1 мл), добавляли 250 мкл раствора Z-Ala-Ala-Leu-ОСНз и Phe-pNA соответствующей концентрации. Реакционную смесь встряхивали на орбитальном шейкере при 20-22С, периодически отбирали 5-Ю мкл пробы для анализа с помощью ВЭЖХ.
