Введение к работе
Актуальность проблемы. На протяжении всей истории человечества инфекционная патология является одной из самых распространенных причин болезней с летальным исходом. По официальным данным ВОЗ с нею связано 25% смертности в мире. Доля инфекций в структуре смертности населения планеты существенно увеличивается и достигает 35%, если принимать во внимание результаты научных исследований последних лет, которые свидетельствуют об участии одного или нескольких инфекционных агентов в хронических заболеваниях легких (включая астму), развитии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний, а также болезней дыхательной, нервной и пищеварительной систем организма человека.
Большой проблемой в инфекционной патологии является снижение эффективности использования традиционных методов лечения и профилактики бактериальных инфекций. Это связано с тем, что в результате генетической изменчивости бактерий появляются штаммы, устойчивые к действию лекарственных препаратов, или штаммы с измененным антигенным составом, например, так называемые госпитальные штаммы, которые формируются во время внутрибольничных инфекций. Антропогенная трансформация среды обитания человека, которая привела к выходу на эпидемическую «орбиту» более 30 патогенов, возбудителей так называемых "новых" инфекционных болезней, также значительно усложняет ситуацию.
Одним из широко распространенных проявлений заболеваний, ассоциированных с инфекциями различной этиологии, являются бактериемия и септический шок. Острота заболеваний и количество летальных исходов при бактериальном сепсисе значительно увеличиваются (до 45%), если в качестве возбудителя инфекции выступают грамотрицательные бактерии (ГОБ)* из-за присущей им повышенной устойчивости к антибиотикам.
Септический шок возникает в результате накопления в крови человека эндотоксинов, уникальных компонентов наружной мембраны ГОБ, что приводит к неконтролируемой активации иммунной системы, синтезу эффекторны-ми клетками организма хозяина большого количества эндогенных цитокинов и, в конечном итоге, к серьезным нарушениям в организме, таким как гипотония и полиорганная дисфункция.
Используемые сокращения: АсОН - уксусная кислота; ГОБ - грамотрицательные бактерии; GlcN - глюкозамин; ДПС - деградированный полисахарид; ДФГ - дифосфатидилглицерин; ДЭФЭ -диметиловый эфир фосфатидилэтаноламина; ЖК - жирные кислоты; Kdo - 3-дезокси-0-манно-окт-2-улозоновая кислота; КПС - капсульный полисахарид; ЛА - липид А; ЛПС - липополисахарид; ЛФЭ -лизофосфатидилэтаноламин; ЛФ - логарифмическая фаза роста; ЛХ - липид X; МС - масс-спектро-метрия; НЛ - нейтральные липиды; МЭФЭ - монометиловый эфир фосфатидилэтаноламина; О-ПС -О-полисахарид; ПА - питательный агар; ПБ - питательный бульон; ПСФ - поздняя стационарная фаза; РСФ - ранняя стационарная фаза; СА - степень ацилирования; СП - степень полимеризации; СФ - стационарная фаза; ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа; ФГ - фосфатидилглицерин; ФЛ -фосфолипиды; ФЛР - фаза линейного роста; ФЭ - фосфатидилэтаноламин; ХС — химический сдвиг.
Высокая частота тяжелого течения грамотрицательного сепсиса делает жизненно необходимой разработку новых нестандартных подходов для его предотвращения и/или лечения. Научные проблемы, связанные с развитием таких подходов, среди прочих включают изучение экологии патогенов, эволюции эпидемического процесса грамотрицательных инфекций и факторов патогенное микроорганизмов.
Особое место среди возбудителей грамотрицательных инфекций занимают факультативные патогены, обладающие двойственной (паразитической и сапрофитной) природой. Изучение экологии таких бактерий, позволяющее получать сведения о возможности обитания некоторых из них в окружающей среде, накоплении их в ее объектах, из которых происходит заражение людей, рассматривается сегодня как необходимое звено для понимания механизмов запуска и развития инфекционных заболеваний.
Типичным примером таких бактерий является Yersinia pseudotuberculosis (сем. Enterobacteriaceae), внутриклеточный паразит, способный к эффективному размножению как в организме теплокровных, так и в объектах окружающей среды. Эта умеренно патогенная бактерия довольно интенсивно исследуется во всем мире, во многом потому, что в филогенетическом плане она является близким родственником и прародителем другой бактерии рода Yersinia, У. pestis, возбудителя бубонной, легочной и септической чумы.
Устойчивость к факторам внешней среды и способность расти при низких температурах являются наиболее важными в эпидемиологическом отношении свойствами бактерий псевдотуберкулеза, которые приводят к возрастанию вирулентности популяции. Высокая приспособляемость факультативных паразитов, необходимая для выживания в столь различных внешних условиях, достигается, по-видимому, за счет наличия у них комплексных адаптивных реакций, отличных от таковых у облигатных патогенных бактерий. Отражением адаптационных процессов, в частности, является вариабельность химического состава бактериальной клетки.
Важную роль в экологической пластичности бактерий играют липиды -основные компоненты мембран, обеспечивающие структурно-функциональное соответствие клетки изменяющимся условиям среды обитания. Однако детальные исследования влияния экзогенных и эндогенных факторов на ли-пидный состав псевдотуберкулезного микроба не проводились. Мало известно и о химической природе факторов патогенности бактерий псевдотуберкулеза, связанных с их психрофильными свойствами. Среди прочих это могут быть ЛПС, известные как О-антигены и эндотоксины ГОБ, и ФЛ, наряду с ЛПС формирующие барьер проницаемости бактериальных клеток для различных химических веществ, в том числе антибиотиков.
Несмотря на значительный прогресс в антимикробной химиотерапии, количество летальных исходов при эндотоксикозе остается неприемлемо высоким. Решение этой важной проблемы инфекционной патологии должно предусматривать разработку и внедрение в практику новых антибактериальных препаратов. Основой для создания препаратов, эффективных при лечении
грамотрицательного сепсиса, является понимание того, что медиатором септических заболеваний, вызванных ГОБ, являются эндотоксины, в норме проявляющие себя активаторами клеточных и гуморальных компонентов защитной системы хозяина, а при неконтролируемой стимуляции иммунных реакций приводящие к эндотоксикозу.
В связи с этим весьма актуальным становится использование антагонистов эндотоксинов, ограничивающих выделение или иммунологическую реактивность последних. Потенциальным кандидатом на роль антагонистов эндотоксинов являются сами эндотоксины. В химическом плане они представляют собой ЛПС, включающие наряду О-ПС и олигосахаридом кора липидный домен, называемый ЛА, который считается эндотоксическим центром ЛПС.
Наиболее распространенным структурным вариантом ЛА, проявляющим ярко выраженные эндотоксические свойства («золотой стандарт» эндотоксинов), является дифосфорилированный дисахарид GlcN, имеющий шесть остатков ЖК. С другой стороны, производные ЛА с низкими степенями фосфо-рилирования и ацилирования проявляют слабую эндотоксическую активность (или не проявляют вовсе), что делает возможным их использование в качестве антагонистов эндотоксинов.
Особенности строения ЛА во многом определяются условиями роста ГОБ. В этом плане большой интерес представляют морские бактерии, которые в силу особых условий обитания (повышенное содержание солей, низкая температура, высокое гидростатическое давление, неравномерное поступление питательных веществ) могут синтезировать ЛА с низким эндотоксическим потенциалом. До начала нынешнего века химии «морских» ЛА, как научного направления, практически не существовало. Единичные работы по изучению ЛА морских бактерий, датированные 2-ой половиной 20-го века, касались, в основном, характеристики состава их ЖК. Мало кто подозревал тогда, какое структурное разнообразие характерно для «морских» ЛА и какие широкие возможности открываются для структурно-функциональных исследований в этой области.
Цель и задачи исследования. Цель работы — установление корреляции между условиями культивирования бактерий псевдотуберкулеза, их ли-пидным составом и патогенными свойствами и поиск потенциальных антагонистов эндотоксинов среди ЛА морских ГОБ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Исследовать влияние температуры, источника углерода, способа культивирования и фазы роста на липидный состав (ФЛ, ЖК, ЛПС, ЛА) бактерий псевдотуберкулеза.
Выяснить роль плазмидных ДНК в адаптационной изменчивости основных липидных компонентов У. pseudotuberculosis.
Изучить характеристики патогенного потенциала псевдотуберкулезного микроба в зависимости от условий его культивирования и изменений липидного
состава.
Изучить химический состав и структуру ЛА морских бактерий различной видовой принадлежности.
Определить эндотоксические свойства (острая токсичность, способность индуцировать синтез ФНО-а в клетках цельной крови человека) ЛА и ЛПС некоторых морских ГОБ.
Изучить способность нетоксичных форм ЛА и ЛПС морских ГОБ ингибировать индуцированный эндотоксинами синтез ФНО-а.
Научная новизна работы. Впервые проведено изучение роли липидных компонентов в адаптации и патогенности психротрофной бактерии У. pseudotuberculosis. Показано, что липиды бактерий псевдотуберкулеза представляют собой динамичную систему, способную изменяться в широких пределах под воздействием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Установлено, что патогенный потенциал У. pseudotuberculosis коррелирует с изменением липид-ного состава клеток и в большой степени зависит от условий культивирования.
Проведено первое систематическое исследование состава и структуры ЛА морских ГОБ различных родов и семейств, которое расширило представление о структурном разнообразии этих соединений. Установлены структуры некоторых из них. В составе молекул ЛА бактерий рода Marinomonas обнаружена необычная ацилоксиалкановая кислота, состоящая из двух остатков 3-гидроксидекановой кислоты. Впервые описан ЛА (ЛА Marinomonas mediter-ranea), не содержащий нормальных ЖК. Впервые из клеток природных штаммов Chryseobacterium indoltheticum и С. scophthalmum выделен ЛА моносаха-ридной структуры. Показано, что бактерии рода Chryseobacterium имеют необычный состав полярных липидов и, по-видимому, не содержат ЛПС. Установлено, что ЛПС и ЛА ряда морских бактерий имеют низкую токсичность, являются слабыми индукторами ФНО-а и представляют теоретический и практический интерес как потенциальные антагонисты эндотоксинов универсального типа действия.
Практическая ценность работы. Новые данные о характере изменений в составе ФЛ, ЛПС и ЛА факультативных паразитов под воздействием различных экологических факторов, полученные в ходе настоящего исследования, вносят вклад в понимание механизмов запуска и развития инфекционных заболеваний, что можно использовать для получения микроорганизмов с заданным липидным составом (например, при культивировании штаммов-продуцентов О-антигенов).
Изучение ЛА морских ГОБ продемонстрировало возможность использования бактерий морского происхождения в качестве источника нетоксичных форм ЛА - потенциальных антагонистов эндотоксинов, и перспективность их комплексного исследования с целью разработки препаратов для терапии гра-мотрицательного сепсиса и эндотоксикоза.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены лично автором в виде устных сообщений на: VI Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Ростов-на Дону, 1977); Всесоюзном симпозиуме «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980); XII Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Баку, 1981); 2nd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Moscow, 2002); 3rd German-Polish-Russian Meeting on Bacterial Carbohydrates (Wroclaw, Poland, 2004); IV-th European Conference on Natural Products (Paris, France, 2005), Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (Rostock, Germany, 2006).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 28 статей в ведущих отечественных и международных журналах, 19 тезисов докладов в сборниках трудов Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференций, получено 2 авторских свидетельства.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 499 источников. Диссертация изложена на 239стр. машинописного текста, содержит 24 таблицы и 62 рисунка.
Автор выражает глубокую признательность д.х.н. Т.Ф. Соловьевой, академику В.А. Стонику и академику Ю.С. Оводову за всестороннюю поддержку на всех этапах работы. Автор благодарит к.х.н. В.В. Исакова и к.х.н. А.С. Дмитренка за проведение ЯМР-экспериментов, к.х.н. П.С. Дмитренка за проведение масс-спектрометрических исследований, д.б.н. А.Л. Дроздова и д.б.н. А.В. Реунова за консультации при проведении электронно-микроскопических исследований, д.б.н. О.И. Недашковскую за наращивание микробной массы, к.х.н. В.А. Хоменко за полезные советы при проведении ДСН-ПААГ-электрофореза, д.х.н. П.А. Лукьянова и к.х.н. И.В. Чикаловец за консультации при проведении экспериментов по индукции ФНО-а, а также проф. C.R.H. Raetz (Department of Biochemistry, Duke University Medical Center, Durham, USA) за обсуждение работ по ЛА бактерий рода Chryseobacterium. Автор выражает искреннюю благодарность своим коллегам по работе к.б.н. СИ. Бахолдиной, к.х.н. Е.В. Воробьевой, Н.В. Капустиной, асп. А.С. Волк, сотрудникам лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ к.х.н. В.И. Горбачу, д.х.н. И.М. Ермак, д.х.н. О.Д. Новиковой, а также сотрудникам лаборатории химии углеводов за предоставление образцов ЛА из некоторых морских бактерий.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 02-04-49466, № 05-04-48504), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология" и ДВО РАН (гранты № ОЗ-З-А-05-081, № 05-3-А-05-061).
