Содержание к диссертации
Введение
1. Химическое изучение растений семейства зонтичных (Unfcellifегае) 3
1.1. Краткая ботанико-географическая характеристика семейства зонтичных 5
1.2. Народно-хозяйственное значение растений семейства зонтичных 6
1.3. О химическом составе растений семейства зонтичных 8
1.3.1.Кумарины рода Phlojodicarpud 18
1.4. Спектральные методы исследования кумаринов 22
1.4.1. ИК-спектроскопия 22
1.4.2. УФ- спектроскопия 23
1.4.3. Спектроскопия ПМР 25
1.4.4. Спектроскопия ЯМР13С 27
1.4.5. Масс-спектрометрия 32
2. Кумариновые соединения из растений рода phlojodicabpus 37
2.1. Экстракция и выделение кумариновых соединений 37
2.2. Кумарины Phlojodicarpus turczaninovii 38
2.2.1. Химическая структура флоидикарпина и изофлоидикарпина 40
2.2.2. А -^-Глюкопиранозид пеуцеданола и другие кумарины 43
2.3. Кумарины Phlojodicarpus villosus 46
2.3.1. Декурсинол и его эфиры 46
2.3.2. й~іьАпиозил~(І—» 6)-j6~ D-глюкопиранозид умбеллиферона 49
2.4. Кумарины Phlojodicarpus sibiricus 51
2.4.1. Вздутоплодник сибирский из окрестностей Улан-Батора 52
2.4.2. Кумарины даурской популяции Ptusibiricus 54
2.4.3. Кумарины якутской популяции Ph,sibiricus .59
2.5. О биосинтезе кумаринов в растениях рода Phlogodicarpus 60
3. Экспериментальная часть 64
3.1. Экстракция и фракционирование экстракта 64
3.2. Выделение и идентификация кумариновых соединений 65
3.2.1. Колоночная хроматография 65
3.2.2. Тонкослойная хроматография 65
3.2.3. Хроматография на бумаге 66
3.3. Химическое исследование кумаринов 66
3.4. Физико-химические характеристики соединений, выделенных из растений рода РШоз о di carpus 70
Выводы 75
- Народно-хозяйственное значение растений семейства зонтичных
- Спектральные методы исследования кумаринов
- Кумарины Phlojodicarpus turczaninovii
- О биосинтезе кумаринов в растениях рода Phlogodicarpus
Введение к работе
Систематическое изучение природных растительных ресурсов, ставящее своей целью поиск новых биологически активных веществ в перспективных в медицинском отношении растениях, является одной из важных задач химии природных соединений. Природные соединения, молекулы которых образованы сочленением бензольного и -пироново-го колец, известны как кумарины. Изучение химии кумаринов, начатое еще в прошлом столетии, продолжает интенсивно развиваться в настоящее время. Стимулами к ее развитию служат с одной стороны неску-деющее разнообразие природных кумариновых соединений, с другой стороны — практическая ценность многих из них как биологически активных веществ, обладающих спазмолитическими, противоопухолевыми, антимикробными, антикоагулянтными, фотоактивными и другими свойствами /1-4/.
Биогенез кумаринов в растительных таксонах имеет всеобщее распространение, но особенно характерны они для семейства зонтичных. К этому семейству принадлежит большое число пищевых, лекарственных, кормовых и технически важных растений. Некоторые из них выращиваются как овощные и технические культуры, например, морковь,.укроп, фенхель и другие /5-9/. Всего в семействе зонтичных насчитывается до 3000 видов, и большинство из них дикорастущие /10-12/. Далеко не все виды зонтичных изучены химически. Даже те из них, которые привлекали внимание ученых, зачастую нуждаются в дополнительной химической характеристике.
Зонтичные, произрастающие на территории МНР /13,14/, исследованы особенно слабо. Поэтому задача, поставленная в настоящей работе, состояла в том, чтобы оценить химический состав избранных представителей этого семейства растений, выявить его особенности, оценить пригодность отдельных видов как сырья для получения био
логически активных веществ. Тема работы входит в план сотрудничества АН GGGP и АН МНР на І98І-І985 гг. ЮЛ (2) "Эндемичные растения МНР, содержащие противоопухолевые и другие биологически активные вещества".
В литературном обзоре диссертации рассмотрены вопросы краткой ботанико-географической характеристики растений семейства зонтичных, их народнохозяйственное значение, химический состав, растений семейства зонтичных, в том числе новых кумариновых соединений, выделенных в последние годы и не вошедших в обзоры /1-3/, основные методы установления структуры кумаринов.
В результате химического исследования состава надземной части растений рода Phlojodicarpus (вздутоплодники) было выделено 19 кумариновых соединений, а также флавоновый гликозид — диосме-тин — 7-0-fi-.D -глюкопиранозид и 7-оксибензо- У-пирон. Из этих веществ 7 являются новыми или впервые обнаружены в растениях, 20 соединений ранее не были известны для растений рода Phlojodicar pus.
Кумарины вздутоплодников относятся к простым кумаринам, пи-рано- и фурокумаринам, пренилированным и гликозилированным производным и состоят в биогенетическом родстве. Установление их строения и идентификация проводились с помощью химических и физико-химических методов (УФ, ИК, ЯМР-спектроскопия, масс-спектромет-рия).
В ходе исследований было установлено, что состав растений, собранных в различных регионах МНР, отличается от состава ранее изученных родов Phlooodicarpus /15-18/ и зависит от места их произрастания и климатических условий. Анализ вздутоплодников сибирского и мохнатого с целью оценки пригодности их для выделения ви-снадина и дигидросамидина, используемых в СССР в качестве препарата димидина, показал, что растения не содержат этих соединений.
Во вздутоплоднике сибирском, произрастающем в районе Улан-Батора, обнаружены сложные эфиры, отличные от виснадина и дигидросамиди-на, а также другие производные кумарина, ранее не описанные в литературе. Исходя из этого осуществлено сравнительное исследование вздутоплодника сибирского, произрастающего в различных климатических зонах (МНР, Читинская область, Якутская АССР). В результате изучения установлено, что состав кумаринов вздутоплодника сибирского нестабилен и зависит от места его произрастания.
В МНР произрастают три вида Phlojodicarpus . Все они исследованы в представленной работе. Растения при этом были взяты из южных и западных регионов республики, вблизи границ ареала. Условия вегетации в этих областях можно отнести к экстремальным. Тот факт, что ни один из обнаруженных кумаринов не был ранее найден в этих же видах, но обитающих в более „благоприятных условиях, может свидетельствовать о приспособительном значении биосинтеза . кумаринов.
Обнаруженная нестабильность кумаринового состава рода Phlojo-dicarpus сигнализирует также о необходимости соблюдать осторожность при оценках запасов сырьевых источников для выделения биологически активных соединений. Когда речь идет о различных географических и климатических зонах, совпадение ботанических признаков растений не обязательно предполагает идентичность химического состава.
Изучение химического состава растений рода PJaloaodicarpus произрастающих в МНР, вносит определенный вклад в решение пробле-: мы рационального и эффективного их использования для получения новых биологически активных веществ, а также в хемотаксономичес-ком отношении.
Народно-хозяйственное значение растений семейства зонтичных
К семейству зонтичных принадлежит большое число лекарственных, пищевых, главным образом овощных культур, кормовых и технически важных растений. Комплексные исследования, проводимые химиками, фармакологами, ботаниками, а также многовековой опыт применения растений в народной медицине позволили выявить ценные лекарственные растения и использовать их в медицинской практике как в форме галеновых препаратов, так и в виде индивидуальных соединений. Среди препаратов, обладающих спазмолитическим действием, используются в практической медицине анетин, получаемый из Foencu- lum, пастицин из pastinica sativa, фурокумарин келлин, выделяемый из Ammi visnaga,даукарин, представляющий собой сумму флавоноидов из корнеплодовDaucus sativus. Для лечения лейкодермии используется препарат аммифурин, состоящий из фурокумаринов бергаптена и изопимпинелина, содержащихся в Ammi majus L. /4,8,19-22/. Флаво-ноидный препарат буплерин, получаемый из растений рода Bupleurum, используется в качестве Р-витаминного средства /19,20,22,23/. На основе кумаринов виснадина и дигидросамидина, вьщеленных из Phloj-odicarpus villosus и Pk.sibiricus создан препарат димидин, обладающий сосудорасширяющим действием /4-8,19,20/. В качестве диуретических, противовоспалительных средств применяются трава петрушки (Petroselinum sativum), плоды тмина (Carum carvi),фенхеля (Fo-eniculum vulgare), корни бедренеца камнеломкового (Pimpinella sa-lixfraga) /8,9,19-22/. Отвары и настои укропа, тмина употребляют в медицине для улучшения аппетита и как успокаивающее средство. Многие виды зонтичных культивируют в качестве овощных и пряных культур. Петрушка (Petroselium cripsum), сельдерей (Apium graveolens), укроп (Anethum graveolens), кориандр (coriandrum sativum), анис (Anisum vulgare), фенхель (Foenfculum vulgare) относятся к числу основных эфирномасличных растений и служат сырьем для получения различныхІэфирных масел /8,9,20/. Количественное содержание эфирного масла в плодах зависит от видовой принадлежности растений и условий их произрастания. Высоким содержанием характеризуются гигрофиты -- Sium latifolium — 2.70%, Ostericum palustre — 1,97%, Peucedanum salinum— 2,15%. Среди ксеромезофитов отмечены виды как с высоким содержанием масел — Carum carvi — 6%, Carum "buriaticum — 2,21-2,70%, так и с низким — Peucedanum vaginatum — 0,26%.
Среди мезофитов есть виды с довольно высоким выходом эфирных масел из плодов Archange-lica decurrens— 2,47%, Heracleum dissectum 1,17%. Эфирные масла видов Carum carvi, Libanotis condensata, Archangelica decurrens, Phloооdicarpus villosus находят широкое применение в пищевой, парфюмерной промышленности и в медицине /24-25/. В эфирном масле большинства видов зонтичных содержатся тимол, цимол, карвон, тимен, о(-пинен, jg-бисаболен, мирцен и другие терпены и сесквитерпены /10,20/. Фенхелевое масло находит применение при производстве мыла и для получения анетола. Эфирное масло Coriandrum sativum благодаря содержанию линалоола имеет большое значение в парфюмерии как исходное сырье для синтеза различных душистых веществ. Тимол широко применяется для приготовления зубных паст и элексиров /20/. Изучению эфирных масел растений семейства зонтичных посвящен ряд работ /26-28/. В эфирном масле обнаружены акоренон, бисаболол, о(-пинен, камфен, -пинен, мирцен, лимонен, п-цимол, карвон, анетол (20% от суммы), октилацетат. Среди растений семейства зонтичных известны ядовитые виды. Болиголов пятнистый (Conium macu-latum) используется в народной медицине в качестве болеутоляющего и противоопухолевого средства, а трава веха ядовитого (Cicuta virosa) применяется для лечения ревматизма, язв, хронических сыпей /19-22/. Различные виды борщевиков (Heracleum) культивируются в качестве кормовых и декоративных растений. Для борщевиков характерно высокое содержание протеина (18-26,8%). По количеству аминокислот выделяется Heracleum dissertum.Особенно богаты аминокислотами листья; для них характерно также высокое содержание витамина "С", особенно у растений, произрастающих в горах.В качестве силосных растений используются также Archangelica decurrens, Angelica sylvestris,Pheurospernmm игаlense и др. /29/. Столь разнообразное применение растений семейства зонтичных связано с многочисленностью видов, а также разнообразием их химического состава, определяющим вкусовые, фармакологические свойства. 1%3. 0 химическом составе растений семейства зонтичных Химический состав растений, принадлежащих к разным видам DJft-belliferae, изучается многие годы. Из общего рассмотрения многочисленных работ, относящихся к обсуждаемой теме, можно заключить, что наиболее характерным химическим ингредиентом семейства служат кумарины, хотя и они присутствуют далеко не во всех видах. Много внимания было уделено также флавоноидным соединениям зонтичных. По данным /30/ флавоноиды найдены в 148 родах из 280 родов Umbelliferae. Для зонтичных характерно присутствие главным образом флавонов (лютеолин) и флавонолов (кемпферол, кверцетин) и отсутствие протоантоцианидинов, эллаговой и галловой кислот /31-32/. А.Г.Валуцкая и др. /33/изучили методом хроматографии на бумаге флавоноиды цветков, листьев и стеблей 38 сибирских видов семейства зонтичных. Результаты свидетельствуют о том, что в 84% видов флавоноиды представлены флавонолами (кверцетин и кемпферол) в 16% — флавонами (лютеолин). Эти данные совпадают с работами Хёрхаммера (ФРГ) и Салеха (АРЕ) /34/, а также /35-39/. Ряд авторов /40-43/ систематически изучали состав жирных кислот ряда растений семейства зонтичных методом газожидкостной хроматографии.
Они охарактеризовали их физические и химические показатели, жир-нокислотный глицеридный состав. Установили, что во всех маслах присутствует в наибольшем количестве петроселиновая кислота (30-40%), которую можно рассматривать как хемотаксонономический классификационный признак зонтичных. Что касается кумаринов, то сведения практически о всех работах, выполненных до 1980 года, вошли в монографии и обзоры /1-3/. Особенно полные данные о структуре природных кумаринов собраны в последней сводке /I/. Она содержит сведения более чем о восьми сотнях веществ, исследованных до 1980 года. После выхода в свет этого обзора появилось достаточное число новых исследований, особенно по кумариновим соединениям родов Seseli, Angelica и Ferula. В развитие химии кумаринов при этом особенно большой вклад внесли советские исследователи. Простейшие кумарины — умбеллиферон I и скополетин П — присутствуют во многих видах зонтичных и других растений. Они служат биогенетическими предшественниками большинства кумариновых соединений. Для дальнейших этапов биосинтеза характерно энзиматическое пренилирование молекулы I, т.е. введение изопентильного остатка с помощью изопентилпирофосфата. Более редко наблюдается алкилиро-вание моно- и сесквитерпеноидными фрагментами. Пренилирование может протекать как по кислороду с образованием О-пренилпроизводных, таких как Ш, или по любому из незамещенных положений бензольного кольца I. Образующиеся при этом С-пренилированные кумарины, подобные пеуцеданолу ІУ, на дальнейших этапах биосинтеза могут претерпевать циклодегидратацию, образуя несколько типов фуро- и пи-ранокумаринов. Примерами этих веществ могут служить У и УІ. В связи с наличием указанных выше обобщающих работ подробное изложение химии природных кумаринов в данном обзоре нецелесооб- разно. Мы ограничились лишь приведением основных сведений о новых веществах, выделенных из растений семейства Umbelliferae в 1981-1984 гг. Эти сведения приведены в таблице I. При рассмотрении этой таблицы обращает на себя внимание все расширяющееся разнообразие моно- и сесквитерпеновых производных кумаринов. Особенно интересно нахождение в растениях рода Ferula сесквитерпеновых производных умбеллиферона. В этих соединениях I алкилирован по гидроксильной группе терпеноидными радикалами фар-незанового, циклофарнезанового и бициклофарнезанового типов. Вместе с не вошедшими в таблицу I аналогами, изученными ранее 1981 года, они составляют довольно обширную и своеобразную группу веществ, характерную для некоторых родов семейства Umbelliferae.
Спектральные методы исследования кумаринов
В последнее время при доказательстве строения и стереохимии кумаринов, как и других природных соединений, все шире применяются спектральные методы исследования, которые достаточно полно освещены в ряде обзорных работ /1-3/. 1,4.1. ИК-спектроскопия ИК-спектроскопия играет важную роль в структурных исследованиях природных кумаринов. Для целей структурного анализа природных кумаринов наибольший интерес-представляет изучение тех областей спектра, где проявляются полосы валентных колебаний ОН, СН, С=0 и С=С связей. Полосы поглощения С=0 группы ос -пирона в спектрах производных кумарина лежат в интервале 1685-1760 см /3/. Электроно-акцепторные заместители в положениях 5 и 3 сдвигают эту полосу в область высоких частот на 20-25 см , а в положениях 4 и б — оказывают значительно меньшее влияние. Электронодонорные заместители в положении 4, напротив, сдвигают С=0 полосу в область меньших частот. Так же действует образование внутримолекулярных водородных связей; межмолекулярные водородные связи влияют несущественно. В области поглощения группы С=0 А -пиронового цикла расположены полосы целого ряда карбонилсодержащих соединений: насыщенных кетонов при ненапряженном цикле, сложных эфиров, . о( J3-ненасыщенных виниловых сложных эфиров, o(,j3-ненасыщенных пятичлен-ных кетонов и лактонов, шестичленных насыщенных лактонов. Для однозначной идентификации производных -пирона было использовано измерение интегральной интенсивности полос С=0 группы /3/. Полосы поглощения гидроксильных групп в спектрах гидроксику- маринов (особенно 4 и 7 гидроксикумаринов) смещены в низкочастотную область вследствие образования межмолекулярных и внутримолекулярных водородных связей и расположены в области 2560-3600 см" . В ИК-спектрах гликозидов при 1010-1100 см имеются несколько интенсивных полос, которые обусловлены С-0 колебаниями углеводной части. Наличие в спектре полосы при 890 см является надежным признаком fi -конфигурации гликозидной связи. Она наблюдается во всех j3 -гликозидах и отсутствует в Х-гликозидах. /-Конфигурация гликозидной связи может быть определена по полосе при 840 + 10 см" , при одновременном отсутствии полосы 890 см /71/. Колебания С=С ароматического ядра лежат в области 1620-1580 Т Т и 1550-1470 см . Кроме того, при 3000-3120 см проявляются полосы валентных колебаний ароматических и этиленовых С-Н связей.
Кумарины, содержащие метоксильные группы, дают две полосы в об ласти 2993-2971 и 2851-2836 см , обусловленные асимметричными и симметричными колебаниями метильной группы в ОСНо /72/. Для фуранового кольца характерными считаются две полосы в области 1274-1253 и II09-1088 см , имеющиеся в спектрах большинства фурокумаринов. В спектрах 0-ацильных и 0,0-диацильных производных дигидро-фуро- и дигидропиранокумаринов, в состав которых входят остатки ненасыщенных кислот, часто в интервале 1650-1660 см имеются полоса или перегиб слабой и средней интенсивности, обусловленные валентными колебаниями связи С=С кислотного остатка /3/. 1.4.2. УФ-спектроскопия В электронных спектрах кумаринов наблюдаются характеристические частоты в УФ-области 210-270 и 290-350 нм. Такое поглощение обусловлено хромофором, включающим сопряжения о{-пиронового и бензольново кольца, и зависит от характера замещения в послед- нем. УФ-спектр незамещенного кумарина Ш характеризуется двумя максимумами поглощения при 274 и 311 нм. (1а, 4.03, 3.72). Восстановление двойной связи (к -пиронового кольца приводит к исчезновению длинноволнового максимума и снижению молярного коэффициента поглощения коротковолнового максимума /2,3/. Введение алкильных заместителей в молекулу простого кумарина мало влияет на его поглощение. Значительно большее влияние оказывает алкокси- и гидроксигруппы, что связано с участием в сопряжении неподеленной пары кислорода. Введение одного заместителя в лактонное кольцо незначительно сказывается на поглощении кумаринов, а в случае его дизамещен-ных производных наблюдается батохромный сдвиг коротковолновой полосы спектра. При этом характер заместителя в 3-положении не оказывает существенного влияния. Замещение в бензольном кольце приводит к более значительным изменениям спектра и в зависимости от положения заместителя наблюдается батохромное смещение обеих полос. Характер поглощения моно-замещенных 3-й 7-гидрокси- и 5-й 7-метоксикумаринов позволяет выяснить природу заместителя, так как для метилированных производных исчезает один максимум /2,3/. Наиболее многочисленной группой природных кумаринов являются производные 7-оксикумарина (умбеллиферона I). Они составляют свыше 95% всех известных кумаринов.
Спектры этой группы легко отличимы от других производных кумарина. Для спектров всех соединений характерно наличие интенсивного максимума или перегиба в области 215-225 нм ( а6 4), основного минимума в интервале 260-270 нм (& 3.6) и длинноволнового интенсивного максимума в области 319-325 нм ( Еа 4). Вклад дополнительных хромофоров, не сопряженных с кумарино- вым ядром, незначителен и не влияет на общий характер спектра /1-3,72/. Фурокумарини имеют более интенсивное поглощение при 250 нм ( г 4), чем длинноволновая полоса поглощения кумаринов. В спектрах линейных пиранокумаринов наблюдаются по 4-5 полос и перегибов. Для них характерно наличие интенсивной полосы при 265-269 нм (д, 4.2-4.5); длинноволновая полоса сдвинута в красную область до 350 нм /2,3,73/. Дополнительную информацию о структуре кумаринов и характере замещения можно получить из сравнения спектров исходных веществ и изменений в них под действием ионизирующих и комплексообразую-щих добавок. В качестве ионизирующих реагентов используют ацетат натрия, метилат или этилат натрия, щелочи (иаОН, КОН). Ацетат натрия ионизирует только наиболее кислые окси-группы. Наличие в исследуемом веществе 4-0Н группы обнаруживается гипер-хромным сдвигом, 5-ОН группы — батохромным сдвигом с уменьшением интенсивности , 7-ОН группы — батохромным сдвигом с увеличением интенсивности. При взаимодействии с этилатом натрия 6-оксикумарины распознаются по незначительному уменьшению ( 3.4) а 8-оксикумарины — по более значительному уменьшению интенсивности длинноволновой полосы спектра (fo& 3.1) /3/. 1,4.3. Спектроскопия IMP Спектроскопия ЯМР- Н дает ценную информацию о строении природных кумаринов. Известно, что величина химических сдвигов протонов в молекулах кумаринов зависит от многих факторов. Однако, наибольшее влияние на величину химических сдвигов кольцевых протонов оказывают 7Г -электронная плотность на атомах углерода и магнитная анизотропия циклов. В спектре кумарина УП при 6,44 и 7,76 м.д. имеются два дублета с константой спин-спинового взаимодействия 9,8 Гц, обуслов- ленные соответствующими цис-протонами в положениях 3 и 4. Между ними расположен сложный мультиплет, относящийся к протонам бензольного ядра, образующим четырехспиновую систему АВСД. Введение метоксигруппы в положение 7 кумарина приводит к диамагнитному сдвигу сигналов от Hg, Hg, Hg, Н иН /3, 74/.
Кумарины Phlojodicarpus turczaninovii
Вид Phiозоdiearpus turczaninovii изучался Н.В.Веселовской и соавторами. При этом в растительном материале, который был заготовлен на юге Читинской области, были найдены сложноэфирные производные фуро- и пиранокумаринов пеуценидин, либанорин и бух-тармин /17/. Сырье для данного экспериментального исследования заготовлено в стадии цветения в горах Гоби-Алтай, в районе озера Орог-нур на территории МНР. Стимулом для изучения этого растения послужи- ли сведения из народной медицины об использовании его для лечения опухолей. Поэтому выделение химических веществ из спиртового экстракта надземной части растения осуществляли под биологическим контролем. В качестве такого контроля служило определение цитото-ксической активности по отношению к культивируемым опухолевым клеткам. При этом установили, что биологическая активность локализуется в эфирной, вытяжке при распределении спиртового экстракта между водой и эфиром. Основными компонентами этой вытяжки являются кумарины. В дальнейшем выяснилось, что цитотоксическая активность была обусловлена минорными примесями и терялась по мере очистки. Для выделения индивидуальных соединений кристаллы, полученные после стандартной обработки эфирной вытяжки, кристаллизовали несколько раз из бензола, и полученные при этом разные фракции разделяли методом препаративной тонкослойной хроматографии на сили-кагеле в системе растворителей хлороформ-метанол (10:1). Таким способом выделены два соединения, названные флоидикарпином ХХІУ и изофлоидикарпином ХХУ. 2.2.1. Химическая структура флоидикарпина и изофлоидикарпина Флоидикарпин ХХІУ и изофлоидикарпин ХХУ являются структурными изомерами. Они имеют молекулярную массу 276 и элементный сос- Т тав 15 16 5 Сильное поглощение в ИК-спектре при 1610 и 1705см указывает на наличие кумаринового лактонного цикла. Оба соедине-ния содержат гидроксильную группу (3430 и 3410 см соответственно) и эпоксидное кольцо, которому можно приписать поглощение при 3000, 1246 и 947 см . В изофлоидикарпине ХХУ имеется еще одна эпоксидная полоса при 863 см" . Во флоидикарпине ХХІУ она перекрыта поглощением двух смежных ароматических СН связей при 835см . В электронных спектрах поглощения, которые практически одинаковы, имеются два максимума 260 и 328 нм, не сдвигающиеся при добавле- ний метилата натрия. Эти данные позволяют отнести вещества к 7-OR кумаринам, замещенным окисленной изопренильной боковой цепью. Их химическая структура ХХІУ и ХХУ доказана методами масс-спектроме-трии и ПМР-спектроскопии.
В масс-спектрах ХХІУ и ХХУ присутствовал достаточно интенсивный ион М-30, что свидетельствует о наличии метоксильной группы. Наиболее интенсивным фрагментам с т/% 204 и 205 была приписана структура ХХУІ и ХХУП, из чего следует, что один из кислородных атомов присоединен к бензильному углероду. Другие интенсивные ионы образованы потерей НСО и С О из ХХУІ и ХХУП. Масс-спектры ХХІУ и ХХУ почти идентичны. Однако, одиночну сигналы ионов фло-идикарпина ХХІУ заменены кластерами в спектре его изомера. ПМР-спектр ХХІУ имеет ряд особенностей. Все сигналы представляют собой мультиплеты более сложной структуры, чем можно предсказать из формулы ХХІУ. Мы объясняем это тем, что молекула фло-идикарпина может существовать в форме разных конформеров, стабилизированных внутримолекулярной водородной связью гидроксила с кислородными атомами эпоксидной, лактонной или метоксильной группы. Доказательством этого утверждения служит тот факт, что муль-типлетность линий изменяется при изменении температуры, а также при добавке трис(дипивалоилметаната)европия Su(dpm)На рис.5 приведены фрагменты ПМР-спектров ХХІУ с добавкой парамагнитного реагента при разных температурах. Видно, что при повышении температуры большинство сигналов упрощается, хотя и не во всех случаях принимает ожидаемый вид. При интерпретации данных ПМР химические сдвиги определялись из спектра, снятого при комнатной температуре без добавок. Мультиплет-ность сигналов и КССВ находим из того спектра, в котором данный сигнал был проще. Отнесение сигналов дано на рис.5. Метильные группы, не показанные на рис., дают три сигнала 1,34; 1,41 и 1,26 м.д. При добавлении іі(с//гп)3 они трансформируются в два уширенных, а при нагревании — в два четких синглета. Все эти усложняющие особенности отсутствуют в ПМР-спектре изофлоидикарпина ХХУ. Протоны Н-3 и Н-4 дают сигнал с КССВ 7=9,5Гц при 7,73 и 6,10 м.д. соответственно. Два дублета с расщеплением 8 Гц при 6,61 и 7,31 отнесены к остальным протонам ароматического кольца. Метильные группы ХХУ дают шестипротонный синглет с химическим сдвигом 1,31 м.д. Протоны эпоксидного цикла представлены двумя дублетньми сигналами, лежащими при 4,55 и 4,11 м.д. Константа спин-спинового взаимодействия в этих сигналах равна 5 Гц. Это свидетельствует о -конфигурации заместителей у оксйранового цикла. Сигнал метоксильной группы ХХУ расположен при 3,68 м.д. 2.2.2. ji ) -Глюкопиранозид пеуцеданола и другие кумарины Водный маточник, оставшийся после отделения ХХІУ и ХХУ, был экстрагирован н-бутиловым спиртом и подвергнут хроматографирова-нию на силикагеле. При этом были выделены пеуцеданол ІУ, умбел-лиферон I и новое вещество гликозидной природы. Этому соединению приписана структура 3 -(j3-# -глюкопиранозил)-пеуцеданола ХХУШ на основании следующих данных. Гидролиз ХХУШ разбавленной соляной кислотой дает глюкозу и три агликона. В смеси агликонов преобладает вещество, по спектральным данным идентифицированное как пеуцеданол ІУ. Методом тонкослойной хроматографии в присутствии заведомых образцов (система растворителей хлороформ-метанол, 10:1) установлено, что минорные компоненты гидролизата представляют собой декурсинол XXIX и мармезин УІ. Два последних вещества, скорее всего, являются артефактами, образовавшимися циклизацией ІУ под действием кислоты.
Количественный гидролиз показал, что молекула ХХУШ содержит один сахарный остаток. Его природа установлена на основании равенства R» с заведомым образцом глюкозы при хроматографии на бумаге в системе н-бутанол-пиридин-вода 6:4:3. Конфигурация аномерного центра и размер окисного цикла следовали из значений химического сдвига и КССВ аномерного протона в спектре ПМР: 4,47 м.д. и 6,3Гц соответственно /94/. Молекула глюкозы не может быть присоединена к фенольному ги-дроксилу. Это следует из факта батохромного сдвига длинноволновой полосы поглощения в УФ-спектре ХХУШ с 333 нм до 377 нм при добавлении метилата натрия. Следовательно, сахарид может быть связан только с одной из гидроксильных функциональных групп боковой цепи. Выбор между двумя возможными положениями осуществлен с помощью то данных спектроскопии ЯМР С. В таблице 4 приведены значения химических сдвигов сигналов ядер углерода в соединениях ХХУШ и ІУ. Отнесение сигналов осуществлено путем сравнения со спектрами родственных соединений, расчетов и методом INEP.T. Из таблицы видно, что после отщепления глюкозы наибольший сильнопольный сдвиг (д =7,5 м.д.) наблюдается для атома С-3 . Сигналы соседних атомов претерпевают незначительные смещения в область слабых полей. Таким образом глюкозильный остаток локализуется у третичного атома боковой цепи пеуцеданола ІУ. Глюкозид ХХУШ очищен кристаллизацией из этилового спирта. Его кристаллы включают молекулу кристаллизационного этанола, име- ют состав CpoHpgOrACpHcOH и т.пл.160-162. Пеуцеданол ранее был выделен из Peucedanura formasanum Hayata и Peucedanura japonicum /92-93/. 2.3. Кумарины Phi о з о di carpus villosus Химический состав корней Phiоjоdicarpus villosus изучался Г.К.Никоновым с соавторами /15/. В растении, заготовленном на Дальнем Востоке, найдены дигидросамидин и виснадин. В данной работе изучался кумариновый состав надземной части растения, произрастающего в горных районах Монгольского Алтая. 2.3.1. Декурсинол и его эфиры Для извлечения кумаринов высушенная надземная часть Phlojo-dicarpus villosus экстрагировалась этанолом. Экстракт упаривался до небольшого объема. При этом выпадал кристаллический осадок, который отфильтровывался. Маточный раствор разбавляли водой. Выпавшую при этом смолообразную массу растворяли в эфире, раствор промывали 0,5% КОН и водой.
О биосинтезе кумаринов в растениях рода Phlogodicarpus
Кумарины представляют собой типичные продукты обмена веществ высших растений. Лишь в немногих случаях их образование было обнаружено у микроорганизмов /108/. Кумариновая циклическая система образуется из соответствующим образом незамещенных или замещенных производных транс-коричной кислоты. Из последней при действии УФ-лучей образуется цискоричная кислота, которая спонтанно циклизуется с образованием кумарина и его производных. Простейшие кумарины умбеллиферон I и скополетин П являются биогенетическими предшественниками большинства более сложных соединений. УмбеллиферонIобнаружен нами во всех изученных видах и образцах вздутоплодника. Поэтому в высшей степени вероятно, что I служит биогенетическим предшественником всех кумаринов этого таксона. Полученные в настоящей работе данные на первый взгляд не согласуются с результатами других авторов, изучавших эти же виды. Однако, рассмотрение возможных биогенетических путей (рис.9) образования выделенных соединений сводит эти разногласия до минимума. Если принять во внимание высказанное выше соображение о роли умбеллиферона, то можно видеть ("Рис.9 ), что в роде Phlcgodic-arpus от I ведут три основные ветви биогенеза. Гликозилирование апиозилглюкозой имеет место в Ph. sibiricus, происходящих из МНР и Якутии но не Читинской обЛ/. Во всех изученных видах умбеллиферон пренилируется далее по положениям 8 и б. Правда, последний путь не характерен для Ph. sibiricus, он обнаружен только в Якутской популяции вида. Виснадин и дигидросамидин описывались другими авторами как наиболее важные компоненты в кумариновом комплексе Ph. sibiricus и Ph. turcaaninovii. В настоящей работе эти вещества не обнаружены ни в одном случае, хотя найдены их предшественники и изомеры, отличающиеся местом ацилирования гидроксильных групп келлактона. Обнаруженную вариабельность кумаринового состава в роде Phloj-odicarpus можно объяснить чувствительностью активности и специ- Надземную часть растений вздутоплодника собирали в горах Гоби-Алтай, в районе озера Орог-Нур (МНР), Хархира (Западная Монголия), Гоодой, в окрестностях Улан -Батора, в окрестностях г.Якутска и в Читинской области.в фазе цветения. Высушенное и измельченное сырье экстрагировали 96%-ным этиловым спиртом. Экстракцию проводили настаиванием в стеклянных бутылях при комнатной температуре с трехкратной сменой экстрагента.
Экстракт концентрировали на роторном испарителе при температуре 60 С. Освобожденный от этанола сконцентрированный экстракт обрабатывали по схеме (рис.4). Распределение соединений по фракциям представлено в таблице 9. Для выделения индивидуальных соединений применяли препаративную колоночную хроматографию. Контроль за ходом хроматографическо-го разделения и чистотой соединений осуществляли ТСХ. В качестве основного сорбента для разделения и очистки отдельных соединений применяли силикагель Л-І00-І60 мкм и окись алюминия (П-я степень активации по Брокману). Сорбент в колонку вносили в виде суспензии в малополярном растворителе, входящем в состав элюентной системы. Затем таким же образом вносили разделяемую смесь, предварительно нанесенную на сорбент и высушенную. Соотношение вещество-сорбент варьировали от 1:15 да 1:50 в зависимости от поставленной задачи (первичное разделение или рехроматографирование). Элюентными системами в случае силикагеля служили смеси бензол-этилацетат и хлороформ-метанол, в случае окиси алюминия — петролейный эфир-эфир. Долю полярного компонента в ходе хроматографии увеличивали от I до 20%. В работе использовали стеклянные колонки размером (диаметр х высота, см) 7 х 100; 3,5 х 80; 2,5 х 100; I х 30. 3.2.2. Тонкослойная хроматография Для ТСХ применяли готовые пластинки силуфола с люминисцент-ным индикатором (УФ 254-365 нм) и без него (ЧССР). Хроматографию развивали в следующих системах растворителей (соотношение объемов): I. Хлороформ-метанол а) 10:1; б) 8:2. 2.. Бензол-этилацетат а) 2:1; б) 1:2. 3. Петролейный эфир-эфир а) 1:1. 4. Этилацетат-метилэтилкетон-муравьиная кислота-вода, 5:3:1:1. Для препаративной ТСХ использовали силикагель Л-5-40мкм. После удаления растворителя полученный остаток (11,3 г) хромато-графировали на колонке с 450 г силикагеля L 100/160. Элюирование производили бензолом, содержащим возрастающие количества метилового спирта. ХХУШ десорбировали смесью бензол-метанол, 9:1. После двухкратной кристаллизации из этанола получили 0,5 г (0,02%) бесцветных кристаллов. Чистоту ХХУШ проверяли ТСХ на силуфоле в системе "16". Гидролиз ХХУШ. 0,1 г ХХУШ нагревали 1,5 часа на кипящей водяной бане с 2 мл 3% HGI. Полноту гидролиза проверяли ТСХ на силуфоле в системах "1а" и "2а". Выпавший при охлаждении агликон отфильтровывали. Фильтрат нейтрализовали анионитом AB-I7(0H ) , отделили от ионообменника и экстрагировали этилацетатом. В органическую вытяжку переходит дополнительное количество агликона (всего 0,06 г). После перекристаллизации из этилацетата получили вещество, идентичное пеуцеданолу (ІУ) по IMP спектру, масс-спектромет-рической фрагментации и другим характеристикам. В маточнике от кристаллизации ІУ содержались еще два кумарина. По подвижности на силуфоле в указанных выше системах растворителей они соответствуют заведомым образцам декурсинола XXIX и мармезина УІ. Выход агликона (пеуцеданол ІУ) для ХХУШ составил 65,3%. Углевод анализировали БХ в системе "1а" с заведомыми образцами глюкозы.
Выделение Р-апиозил-(1—-6)- -D -глюкозидаумбеллиферона ХХХШ. 2,5 кг воздушно-сухой надземной части Hi. villosus (собран во время цветения в Хархире, западная Монголия) трижды экстрагировали 10-литровыми порциями этанола. Экстракт фильтровали, упаривали в вакууме до объема 1 ли разбавляли водой. Раствор экстрагировали петролейным эфиром и эфиром. После удаления в эфир растворимых веществ водно-спиртовый раствор упаривали в вакууме до сухого остатка. После этого полученный остаток (75,0 г) хроматографировали на колонке с I кг силикагеля L 100/160. Элюирование производили хлороформом, содержащим возрастающее количество метилового спирта. ХХХШ десорбировался смесью хлороформ-метанол 9:1. После двухкратной кристаллизации из метанола получили 2,3 г (0,09%) кристаллического вещества. Чистоту ХХХШ проверяли ТСХ на силуфоле в системах "16" и "4а". Гидролиз ХХХШ. 0,02 г ХХХШ нагревали 2 часа на кипящей водяной бане с 4 мл 3% HCI. Полноту гидролиза проверяли ТСХ на силуфоле в системах растворителей "1а" и "2а". Выпавший при охлаждении агликон отфильтровали. Фильтрат нейтрализовали анионитом AB-I7 (0Н ), отделили от ионообменника и экстрагировали этилацета-том. Полученное вещество с т.пл.224-226, М+164, на основании физико-химических констант, УФ-, ИК-, и ПМР-спектров идентифицировали с умбеллифероном (I). При гидролизе образовались два углевода. Методом БХ в системе "1а" один из них идентифицирован как глюкоза, а другой имел одинаковую подвижность с рамнозой (цвет пятна отличался от рамно-зы после проявления хроматограммы анилинфталатом). Второй углевод то идентифицирован с апиозой на основании IMP и ЯМР- С спектра (таблица 5). Выделение транс-4 -0-метилкеллактона (XL) и цис-4 -0-метил-келлактона (XXXIX). 2,6 кг воздушносухой надземной части РЬ.. si-"biricus (собран во время цветения в Читинской области) трижды экстрагировали 10-литровыми порциями 96%-ного этанола. Полученный экстракт фильтровали, упаривали в вакууме до объема 1 л. При стоянии сконцентрированного экстракта выделилась кристаллическая смесь сложных эфиров ХХХУП и ХХХУШ. Маточник после отделения этих кристаллов упаривали и разбавляли водой (1:1 по объему). Водную вытяжку экстрагировали последовательно петролейным эфиром и диэ- дистиллированной водой. После высушивания сульфатом натрия и упаривания эфира получили 30,2 г экстракта. 20 г экстракта хроматографировали на колонке с силикагелем (1:25), применяя для элюирования смесь петролейного эфира с эфиром. При составе смеси 9:1 десорбировались вещества ХХХУП и ХХХУШ, при 6:4 — соединения XXXIX и XL (0,009 и 0,012%). Оба вещества хорошо кристаллизовались из эфира. Чистоту вещества проверяли ТСХ на силуфоле в системах "2а" и "За". Выделение 7-0-J -D -глюкопиранозида 8-(2,,3)-дигидрокси-3 -метилбутил)кумарина ХІД. После удаления в эфир растворимых веществ водно-спиртовый раствор (рис.4, фракция 4) упаривали в вакууме досуха.
