Содержание к диссертации
Введение
1. Низко- и высокомолекулярные вещества растения амарант. Выделение, идентификация, биологическая активность 7
1.1. Амарант - перспективный источник практически полезных соединений и важнейшая культура XXI века 7
1.2. Беталаиновые пигменты и перспективы их практического использования 20
1.3. Физико-химические свойства и биологическая активность амарантина 24
1.4. Пектины: получение, структурная идентификация, химическая модификация, свойства и применение 27
2. Обсуждение результатов 55
2.1. Влияние метода экстракции на количественный и качественный состав выделяемых углеводных фракций Атагап- thiis cruentus L. 55
2.1.1. Структурное изучение углеводных фракций с помощью ИК спектроскопии 59
2.1.2. Структурное изучение олиго- и полисахаридов с помощью спектроскопии ЯМР 13С 67
2.2. Выделение и структурная идентификация высокомолеку лярных и низкомолекулярных соединений Amaranthus tri color сорта "Валентина" 70
2.2.1. Выделение амарантина 71
2.2.2. Исследование физико-химических характеристик амарантина 74
2.2.3. Исследование амарантина методами спектроскопии ЯМР 13С и ИКС 80
2.2.4. Выделение пектиновых полисахаридов 84
2.2.5. Исследование физико-химических свойств и структурных особенностей выделенных пектиновых полисахаридов 86
2.3. Химическая модификация пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования 92
2.3.1. Получение металлокомплексов пектинов на основе пектинов и катионов биогенных ^-металлов микроэлементов 92
2.3.2. Краткая справка. Биологическая активность металлоком-плексов пектинов с катионами биогенных ^-металлов-микроэлементов 103
2.3.3. Получение водорастворимых комплексов пектиновых биополимеров с двухвалентными и одновалентными s-металлами 107
2.3.4. Получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными дикарбоновыми кислотами 113
2.3.5. Краткая справка по биологическим свойствам комплексов пектинов с дикарбоновыми кислотами 128
2.3.6. Получение солей полисахаридов пектинового ряда с замещенными аминосоединениями 129
2.3.7. Фосфорилирование пектина 141
2.4. Оценка содержания нейтральных, кислотных компонентов и сквалена в маслах семян амаранта сортов "Кизлярец" и "Валентина" 145
Экспериментальная часть 148
- Беталаиновые пигменты и перспективы их практического использования
- Выделение и структурная идентификация высокомолеку лярных и низкомолекулярных соединений Amaranthus tri color сорта "Валентина"
- Химическая модификация пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования
- Получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными дикарбоновыми кислотами
Введение к работе
Актуальность исследований. Наряду с традиционными источниками химического сырья, такими как нефть, газ, уголь, все большее значение приобретает возобновляемое растительное сырье. Одной из перспективных культур для мало- и среднетоннажного химического производства является нетрадиционная культура амарант. Особенностью амаранта является большой прирост биомассы, что позволяет получать тонны зеленого растительного сырья на относительно небольших площадях. Пищевая ценность белка амаранта по данным аминограмм очень высока в сравнении с "идеальным белком ФАО", и по сумме незаменимых аминокислот составляет 75 %. Амарант - культура, способная обеспечить страну дополнительным количеством качественных кормов и полноценных продуктов питания, освободив ее тем самым от необходимости их закупки за рубежом. Помимо белка амарант содержит ценные высокомолекулярные соединения - пектиновые полисахариды и ряд важных низкомолекулярных веществ, в том числе флавоноид с Р-витаминной активностью — рутин, и пигмент амарантин. Семена амаранта содержат ценный компонент - сквален. Большая урожайность амаранта, наличие нескольких классов практически полезных веществ делают данную культуру перспективным воспроизводимым растительным сырьем. Для того, чтобы амарант стал конкурентоспособным источником сырья, необходимо дальнейшее углубленное изучение его химического состава и создание рентабельной технологии комплексной переработки фитомассы.
Перспективным направлением исследований является выделение полисахаридов из амаранта. Биополимеры полисахаридной структуры - важнейший класс природных соединений, находящих практическое использование в различных областях науки и техники. Особое место среди растительных полисахаридов занимают пектиновые полисахариды, которые входят в состав структурных элементов клеточной ткани высших растений и выполняют функции связывающих и упрочняющих компонентов клеточной стенки, а также регулируют водный обмен. Пектиновые полисахариды представляют собой уникальный биологически активный продукт с детоксицирующими, радиопротекторными и другими лечебно-профилактическими свойствами, что чрезвычайно актуально в условиях интенсив ного развития химической, нефтеперерабатывающей промышленности, автотранспорта и других отраслей. Социальная значимость данной проблемы связана с ухудшением экологии окружающей среды, что в свою очередь ведет к ухудшению здоровья.
В связи с известными полезными свойствами, пектиновые вещества находят широкое применение в пищевой промышленности. Основным потребителем пектина является кондитерская промышленность. Свойство пектина образовывать студни используют при производстве кондитерских изделий пастило-мармеладной группы (зефир, пастила, желейный мармелад) и конфет с желейными и фруктово-желейными корпусами. Широкий спектр направлений использования пектинов и невозможность адекватной замены пектинов другими веществами делают необходимым производство пектинов в отечественной промышленности.
Кислые пектиновые полисахариды, в отличие от хорошо известных целлюлозы и крахмала, мало изучены к настоящему времени в плане получения функциональных производных, и исследование их химической модификации является современной актуальной задачей.
Химическая модификация позволяет влиять на физико-химические характеристики пектиновых полисахаридов, а также на сорбционную емкость и селективность комплексообразования, так как при этом появляются дополнительные центры координации. Одним из наиболее важных направлений химической модификации пектиновых веществ является получение производных пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования с ионами одновалентных и двухвалентных металлов микроэлементов и функционально замещенными аминосоединениями, а также фосфорилирование и ацилирование пектиновых полисахаридов. Особенно актуально получение водорастворимых карбокси-производных пектинов, что принципиально важно для поиска биологически активных соединений. Большой интерес представляют растворимые в воде аммониевые соли полигалактуронанов.
Поскольку пектиновые вещества содержат в качестве элементарного звена сс-гидроксикислоту - галактуроновую кислоту, целесообразно было исследовать закономерности реакции солеобразования и свойства образующихся при этом продуктов на модельных соединениях - галактуроновых циклических кислотах.
Цель настоящего исследования - выделение высокомолекулярных и низкомолекулярных компонентов растения амарант в единой технологической цепочке, исследование их физико-химических характеристик, идентификация методами ИКС и спектроскопии ЯМР. Для достижения цели определены следующие задачи:
1. Разработка технологической схемы комплексной переработки фитомассы амаранта, позволяющей в рамках единого технологического процесса выделять наиболее ценные практически значимые компоненты из данной культуры (бета-цианиновые пигменты, пектиновые полисахариды, рутин, сквален) с применением максимально дешевых и экологически безопасных методов.
2. Исследование химического состава различных органов (соцветия, листья, семена) нескольких сортов амаранта (Валентина, Кизлярец, несортовой Атагапhiis cruentm) в сравнительном аспекте. Установление физико-химических характеристик выделяемых из амаранта соединений с привлечением современных методов: масс-спектрометрии, Н- и 13С-ЯМР и ИК- спектрометрии, ЭПР, высокоэффективной жидкостной колоночной и тонкослойной хроматографии и другими аналитическими методами.
3. Разработка способов химической модификации пектиновых полисахаридов: 1) комплексообразование и солеобразование с ионами одновалентных и двухвалентных металлов-микроэлементов и макроэлементов; 2) солеобразование с функционально-замещенными аминосоединениями; 3) ацилирование, фосфорилирование пектиновых полисахаридов; 4) получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами; 5) исследование реакции солеобразования на модельных соединениях - низкомолекулярных уроновых кислотах.
Новизна. Впервые разработана схема комплексной переработки амаранта сорта «Валентина», включающая в едином цикле выделение рутина и полифеноль-ных соединений, амарантина и пектиновых полисахаридов. Проведена оптимизация параметров экстракции. Впервые разработана принципиальная схема выделения сквалена из семян амаранта сортов «Кизлярец» и «Валентина». Впервые получены водорастворимые металлокомплексы с двухвалентными s- и /-металлами-микро- и макроэлементами, строение которых подтверждено методами ИК, 13С ЯМР спектроскопии и ЭПР. Показано, что полученные металлокомплексы являют ся малотоксичными и проявляют выраженное противоанемическое действие. Впервые получены молекулярные комплексы полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами. Впервые получены и охарактеризованы соли пектиновых и других полигалактуронанов с функционально замещенными аминосоединениями.
Практическая значимость работы заключается, прежде всего, в подтверждении перспективности амаранта как промышленного источника пектиновых полисахаридов и других практически значимых веществ, в разработке новых экологически чистых способов их выделения, а также в разработке подходов для химической модификации пектиновых полисахаридов, что является основой для получения новых биологически активных веществ.
Основные положения, выносимые на защиту: способы выделения пектиновых полисахаридов и других практически полезных соединений (амарантина, сквалена) из амаранта и их структурно-химическая идентификация; способы модификации пектиновых полисахаридов и их спектральное подтверждение; результаты комплексообразования и солеобразования с ионами одновалентных и двухвалентных металлов-микроэлементов и макроэлементов; получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами; солеобразование с функционально-замещенными аминосоединениями.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II Всероссийской конференции "Химия и технология растительных веществ" (Казань, 2002), V Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2003), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), II Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003), III Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Саратов, 2004), III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004), XI Международной конференции студентов и аспирантов "Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений" (Казань, 2005), XIV Международной конференции по химии фосфора (Казань, 2005). По результатам исследований опубликовано 16 работ в том числе положительное решение на изобретение РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 64 рисунков. Список цитируемой литературы включает 235 наименований. Работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов собственных исследований, экспериментальной части, выводов, списка используемой литературы и приложения.
Работа выполнена в соответствии с научным направлением Института по г/б теме «Разработка научных основ создания новых физиологически активных препаратов для медицины и сельского хозяйства из растительного сырья» (№ гос. per. 01.20.0005795). Работа поддержана совместным грантом Российского фонда фундаментальных исследований и Академии наук Татарстана (№ 03-03-96244).
Беталаиновые пигменты и перспективы их практического использования
По беталаиновым пигментам в литературе опубликовано крайне мало работ и обзоров. Возможно, это связано с тем, что несмотря на достаточно широкую распространенность беталаинов в природе, в них долгое время не находили практической заинтересованности. Немногочисленны сведения о биохимии и биосинтезе беталаинов; до сих пор однозначно не ясны их экологические и физиологические функции. Достоверно известно присутствие беталаинов в ряде шляпочных грибов базидиомицетов, а также цветковых двудольных растений порядка Centrospermae, точнее, в десяти семействах данного порядка. Остальные цветковые растения, в том числе два семейства порядка Centrospermae - Cariophyllaceae и Jiloceblaceae, содержат другой класс сходных по окраске пигментов - антоцианы. Антоцианы и беталаины никогда не встречаются в одном растении, как бы взаимоисключая друг друга, что дало основание систематикам усомниться в принадлежности вышеуказанных семейств. Способность к биосинтезу беталаинов и их накопление является ярко выраженным таксономическим признаком растений, принадлежащих к порядку Centrospermae [1]. Подобно антоцианам, беталаины находятся в клеточных вакуолях, и могут накапливаться в различных органах растений, придавая им яркую окраску (табл. 8). В настоящее время наиболее продуктивными источниками беталаинов являются столовая свекла {Beta vulgaris), сем. Chenopodiaceae [33-35], плоды кактусов из родов Opuntia, Hylocereus и Shlumbergera, сем. Cactaceae [36-40], американский лаконос {Phytolacca americana), сем. Phytolaccaceae [41]. Окраска ядовитого гриба мухомора {Amanita muscaria) определена содержанием фиолетового и нескольких желтых пигментов, идентифицированных как бета-лаины [1]. Беталаины по химической природе являются алкалоидами. Необычным свойством их является наличие окраски (поглощения в видимой области). Беталаины -единственная группа окрашенных алкалоидов. По данному признаку беталаины подразделяются на две подгруппы - бетаксантнны, имеющие желтую окраску, и пурпурные или фиолетовые бетацианины. Вторая нехарактерная для алкалоидов особенность беталаинов - кислотные свойства: данные пигменты содержат карбоксильные группы.
Подобно аминокислотам, беталаины склонны образовывать цвит-терионы. Простейшим беталаином является беталамовая кислота - производное пиперидина, содержащее две карбоксильные группы при цикле в положениях 2 и 5, и альдегидную группу в боковой цепи в w-положении к атому азота. Беталамовая кислота является предшественником всех прочих беталаинов. Предшественником самой беталамовой кислоты является L-ДОФА (-3,4-дигидроксифенилаланин), синтезируемый из /,-тирозина [1, 24]. Полагают, что биосинтетический путь начинает- ся с 4,5-экстрадиолыюго расщепления дигидроксибензольного кольца ДОФА, за которым следует рециклизация с образованием гетероциклического пиперидиново-го кольца. Одна из карбоксильных групп беталамовой кислоты достается ей в неизменном виде от тирозина [1]. Беталамовая кислота обнаружена в клеточном соке у представителей 174 из 274 видов 10 семейств порядка Centrospermae. Накапливается в цветах Cactaceae и Aizoaceae. Альдегидная группа беталамовой кислоты чрезвычайно склонна к образованию альдиминов с аминами и аминокислотами. Данная реакция протекает легко даже при отсутствии специфичного фермента [24], что в целом для биохимических процессов нехарактерно. Собственно, бетаксантины и являются продуктами конденсации беталамовой кислоты и аминов. Например, при конденсации беталамовой кислоты и дофамина образуется пигмент мираксантин V - один из бетаксантинов Amaranthaceae. Дофамин, равно как беталамовая кислота, синтезируется из тирозина, таким образом, на синтез одной молекулы пигмента уходит две молекулы данной аминокислоты. Конденсация пролина и беталамовой кислоты дает инди-каксантин. Бетаксантины - вещества ярко-желтого цвета (Киах /.-триптофанобетаксантина составляет 456 нм). Они, в частности, определяют окраску соцветий некоторых форм целозии серебристой (Celosia argentea) сем. Amaranthaceae [24]. Помимо дофамина, пролина и триптофана в их образовании могут принимать участие гидро-ксипролин, аспарагиновая кислота, глутамин, метионин, триптамин и 3-метокси-тирамин. Бетацианины являются гликозидами, агликонами в которых служат бетанидин и изобетанидин - эпимеры по С-15 альдимина беталамовой кислоты и 5,6-дигид-рокси-2-3-дигидроиндол-2-карбоновой кислоты. Стадии гликозилирования, по-видимому, происходят с участием НДФ-сахаров [40]. Простейшими бетацианинами являются бетанин и изобетанин - S-O-fi-D-глюкопиранозилбетанидин и 5-0-/?-)-глюкопиранозилизобетанидин, соответственно. Углеводной частью обоих гликозидов служит остаток /J-D-глюкозы. Впер- вые бетанин и изобетанин выделены в 1957 году из корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris, от родового названия свеклы - Beta - они получили свое название. Данные соединения стали первыми описанными беталаинами. Позднее были описаны бетацианины более сложной структуры. Амарантин и изоамарантин являются 5-0-/?-/)-глюкуронил-/?--глюкопиранозилбетанидином (изобетанидином); их углеводный фрагмент - дисахарид /?--глюкопиранозилуронил-1-2-/?--глюкопира-нозид, состоящий из остатков глюкозы и глюкуроновой кислоты. Таким образом, кислотные свойства амарантина и его эпимера выражены сильнее, чем у бетаиина, за счет карбоксильной группы глюкуроновой кислоты.
Ярко окрашенные спелые ягоды Phytolacca americana (сем. Phytolaccaceae) содержат бетацианины, этерифи-цированные гидроксикоричными кислотами, например бетанидин-5-(9-[(5"-0-.Е-ферулоил)-2 -(9-/?-0-апиофуранозил]-/?- D-глюкопиранозид, включающий в себя остаток феруловой кислоты и сахара апиозы [41]. Лепестки цветков и мякоть плодов кактусов (на примерах родов Opuntia, Hylocereus, Trichocereus, Phyllocactus, Shlumbergera; сем. Cactaceae) содержат производные бетанина и его эпимера, эте-рифицированные по остатку глюкозы в положении 6 малоновой (филлокактин, изофиллокактин) или З-гидрокси-3-метилглутаровой (гилоцеренин, изогилоцерс-нин) кислотами. 3-Гидрокси-З-метилглутаровой кислотой этерифицированы и бетацианины Iresine herbstii (сем. Amaranthaceae) ирезинин-І и изоирезинин-І [37]. Пигменты Amaranthaceae также могут содержать остатки гидроксикоричных кислот. Например, целозианин-1 представляет собой 2"-0--4-кумароиламарантин; целозианин-Н идентифицирован как 2"-0--ферулоиламарантин. Из Celosia аг-gentea var. cristata, желтой формы Beta vulgaris и представителя сем. Aizoaceae Carpobrotus acinaciformis L. выделены бетацианины, агликоном в которых служит О-декарбоксибетанидин, синтезируемый из 2-декарбоксициклоДОФА. Наряду с циклоДОФА он является предшественником 5,6-дигидрокси-2,3-дигидроиндоль-ного фрагмента агликона [24]. Бетацианины - пурпурные, реже фиолетовые пигменты (в видимой области Хтоах 535 им). Придают специфическую окраску корнеплодам свеклы, ягодам лаконоса, цветкам и мякоти плодов кактусов, соцветиям и листьям амаранта и мари красной (Chenopodium rubrum, сем. Chenopodiaceae), а также шляпкам мухомора. Более подробно ряд свойств бетацианинов будет рассмотрен на примере амараптина. 1.3. Физико-химические свойства и биологическая активность амараптина Лмарантин является главным красным пигментом у растений из родов Ата-ranthus и Celosia. Согласно [1], амарантин и изоамарантин сопутствуют друг другу, но второй пигмент образует минорную фракцию. Соотношение их у A. cnientus, составляет 82 % и 18 %, у A. caudatus, соответственно, 90 % и 10 %, а у A. gangeticiis обнаружен только основной эпимер. Одним из наиболее богатых источников ама-рантина является A. tricolor, вся надземная часть которого имеет насыщенный пурпурный цвет. Как уже описано выше, амарантин является гликозидом, агликон которого представляет собой бетанидин, а углеводный фрагмент - один остаток глюкозы и один остаток глюкуроновои кислоты.
Выделение и структурная идентификация высокомолеку лярных и низкомолекулярных соединений Amaranthus tri color сорта "Валентина"
В спектре (рис. 10) содержится один сигнал аномерного углерода С (101.26 м.д.), один сигнал СН2-группы, принадлежащей янтарной кислоте (61.45), а также четырех сигналов других атомов углерода, связанных с кислородом, в области 70-80 м.д. Зная моносахаридный состав (глюкоза) мы могли произвести соотнесение данных сигналов. Для решения вопроса о а- или Р-форме глюкозы были приняты во внимание величины КССВ ацетального углерода С1. В сс-аномере КССВ ./цс 169.0-172.0 Гц, тогда как в р-аномере - (160-164 Гц). Смещение в слабое поле сигнала С4 к 79.0 м.д. по сравнению с его положением в спектре незамещенного сахара указывает на а-эффект гликозилирования и подтверждает линейную структуру олигосахарида. Спектр ЯМР С образца, полученного с использованием комплек-сона аналогичен вышеописанному и здесь не приводится. В таблице 7 приведены данные спектра ЯМР 13С образца, полученного с комплексоном. Спектр ЯМР 13С образца, полученного с использованием 0.25 % раствора щавелевой кислоты, содержит 6 интенсивных сигналов (С1 101.26; С4 78.60; С3 74.79; С , С 73.03, 72.72; С 62.03 м.д.), положение которых соответствует положению соответствующих сигналов в спектрах а-1,4-0-глюканов. Наличие малоинтен-сивных сигналов в области (С 174.72 и ОСНз 54.22; С 69.14 м.д.) указывает на присутствие галактуроновой кислоты. Сигналы оставшихся ядер углерода галактуронової! кислоты в спектре не проявляются. Подобный факт отмечался и ранее для пектина из плодов томата и был интерпретирован как отражение низких значений спин-спинового взаимодействия для остатков галактуронової! кислоты, что приводит к уширению и уменьшению сигналов, и, кроме того, возможно, что эта часть макромолекулы слишком велика или прочно закреплена, чтобы давать детектируемые сигналы. Таким образом, структура олигосахаридных фракций однозначно установлена методом спектроскопии ЯМР 13С, которые представляют собой сс-1,4- -глюканы. Высокомолекулярная фракция, входящая в состав образца, полученного с использованием 0.25 % раствора щавелевой кислоты, представлена кислыми полисахаридами - пектинами. Основное количество карбоксильных групп галактуроно-вой кислоты этерифицировано.
В данной главе нами впервые проведены работы по оценке содержания практически важных низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ в амаранте сорта "Валентина", выведенного во Всероссийском Институте селекции и семеноводства овощных культур (ВНИИССОК). Нами в рамках комплексной переработки выделены рутин, обладающий активностью витамина Р, потенциальный пищевой краситель амарантин, пектиновые полисахариды, обладающие целым спектром физиологической активности, исследованы их физико-химические свойства и структурные особенности. Результатом исследования стала схема извлечения компонентов из сырья амаранта, позволяющая в рамках единого технологического процесса извлекать наиболее важные соединения (рис. 11). Схема включает три последовательные экстракции: 96 % этиловым спиртом, дистиллированной водой и разбавленным водным раствором слабой органической кислоты. 2.2.1. Выделение амарантнна При получении низкомолекулярных экстрактивных веществ нами апробированы последовательно спиртовая и водная экстракции. Объектом исследования были соцветия и листья амаранта сорта "Валентина". Методом тонкослойной хроматографии проведен качественный анализ эта-нолыюй экстракции. В качестве элюента использован бензол. В исследуемом экстракте обнаружены неполярные пигменты амаранта: на представленной на рис. 12 хроматограмме верхняя полоса соответствует хлорофиллам, нижняя - желтым ка-ротиноидам. Общее содержание сухих веществ в этанольном экстракте по отношению к исходному сырью составляет 8.4 %. Предварительная экстракция 96% этанолом позволяет очистить растительное сырье от малополярных примесей, что позволяет повысить степень чистоты конечных продуктов, а именно амарантина последующей водной экстракцией и пектиновых веществ гидролизом в кислой среде. Следует отметить, что используемый растворитель (этанол) подвергается регенерации, поэтому удорожание процесса будет незначительным. Последующая экстракция по предлагаемому в данной работе способу основана на суммарном извлечении низкомолекулярных экстрактивных веществ водой с последующим их фракционированием. Экстракцией растительного сырья (измельченных высушенных листьев и соцветий амаранта) дистиллированной водой в соотношении 1:15 при температуре водяной бани 50С извлекается из сырья около 90 % содержащихся в амаранте бетацианинов. Изучена зависимость содержания сухих веществ в экстракте от продолжительности процесса (рис. 13). Как видно из рис. 13, увеличение продолжительности экстракции более 1.5 ч не ведет к росту выхода продукта, поэтому оптимальное время экстракции составляет 1.5 ч. Далее экстракт отфильтровывают и замеряют характеристики: плотность экстракта равна 1.005, рН равна 6.3-6.4. Затем экстракт концентрируют, и обработкой первичного экстракта бутанолом извлекают рутин, для кристаллизации которого из последней фракции растворитель отгоняют досуха. Содержание рутина достигает 1 %. Общее содержание сухих веществ в водном экстракте к весу исходного сырья составляет в среднем 10 %. Установлено, что в состав водного экстракта входят и высокомолекулярные соединения, в том числе и водорастворимые пектиновые вещества. После отделения пектиновых веществ, бетацианины сушат на масляном насосе и определяют физико-химические характеристики. Изменение цветности каждой фракции измеряли на спектрофотометре СФ-46 при 538 нм, в качестве контроля использовали элюент.
По полученным результатам построены выходные кривые, представленные на рис. 14. В результате проведенных расчетов, установлено, что пурпурная фракция, отделенная от сопутствующих веществ, составляет 60 %. Предварительно выделенные пигменты идентифицировались методом ТСХ. В качестве систем для тонкослойной хроматографии амарантина были экспериментально подобраны следующие смеси: уксусная кислота - метанол - бензол - вода (2 : 2 : 1.5 : 0.3), изопропанол - вода (4 : 1), а также ацетонитрил - уксусная кислота - вода. На пластинках пигмент поднимается компактным пятном. В целях дальнейшей идентификации выделенного пигмента снимались электронные спектры поглощения колоночных фракций на приборе SPECORD UV VIS, представленные на рис. 15. Они продемонстрировали максимум поглощения в ультрафиолетовой области при X 280 нм и очень интенсивный максимум поглощения в видимой области спектра при X 538 нм. Значения соответствуют литературным данным для амарантина. Для идентификации выделяемого пигмента также был использован метод MALDI TOF масс-спектроскопии (Matrix-assisted laser desorption - ionisation), который позволяет не только обнаруживать амарантпн, но и устанавливать форму, в которой пигмент присутствует в экстракте. Нами установлено молекулярно-массовое распределение фракций, полученных с колонки. Полученные результаты представлены на рис. 16 и 17. Спектроскопия MALDI колоночных фракций водного экстракта (рис. 16) продемонстрировала наличие в нем компонентов массой 818.050 и 847.493 Да, соответствующих натриевым и калиевым солям амарантина; кроме того, в одной из фракций присутствует компонент массой 1514.033 Да, соответствующий димеру пигмента. Таким образом, полученный продукт - порошок амарантина помимо пигментов содержит и углеводы, и белок, и золу. Элементный анализ пигмента после анионита показал следующее соотношение С, Н, N: С - 28.29 %; Н - 5.16 %; N -6.75 %. Поскольку амарантин является потенциальным пищевым красителем, требовалось исследование его термостабилыюсти, так как приготовление пищи всегда сопряжено с ее термической обработкой. Для этого исследовано влияние температуры в интервале от 20 до 100С на спектрофотометрические характеристики пигментов (рис. 18). Как видно из рисунка 18, при повышении температуры выше 60С в видимой области наблюдается уменьшение интенсивности поглощения основного пика при К 538 нм. Сравнение устойчивости интенсивности окраски у очищенных препаратов амарантина после колонки и до колонки к действию повышенных температур выявило практически одинаковое снижение величины оптической плотности растворов при Л. 538 нм. Из этого следует, что выделенный амарантин термостабилен до 80С и пригоден в качестве пищевого красителя.
Химическая модификация пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования
Химическая модификация природных полимеров приводит к получению производных с новыми физико-химическими и биологическими свойствами, что особенно характерно для производных нейтральных полисахаридов - целлюлозы, крахмала, декстрана. На основе целлюлозы получают в настоящее время большое количество лекарственных и других полезных веществ. Кислые пектиновые полисахариды, в отличие от нейтральных полисахаридов, мало изучены к настоящему времени в плане получения функциональных производных с сохранением макроцепи, поэтому исследование их химической модификации с учетом перспективы пектинов как растительного химического сырья является современной актуальной задачей. Пектиновые полисахаридные биополимеры являются производными полига-лактуроновой (полиуроновой) кислоты и содержат свободные или этерифициро-ванные карбоксильные группы в каждом звене полимерной макроцепи. Из литературных данных известно, что основные физико-химические свойства пектинов связаны именно с состоянием их карбоксильных групп, что обуславливает научное значение поиска методов синтеза новых карбоксипроизводных в их ряду. Цель исследований - получение производных пектиновых полисахаридов на основе реакций комплексообразования и солеобразования с ионами одновалентных и двухвалентных металлов микро- макроэлементов и функционально замещенными амино-соединениями, и получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными и ненасыщенными дикарбоновыми кислотами. Исследования направлены на получение водорастворимых карбоксипроизводных пектинов, что принципиально важно для поиска биологически активных соединений. Пектиновые вещества являются кислыми полисахаридами, состояние карбоксильных групп которых определяет их свойства - способность к взаимодейст- вию с катионами, аминами и другими веществами как органической, так и неорганической природы [119,220]. Одним из наиболее характерных свойств пектинов является способность их к комплексообразованию с ионами s-, р- и /-металлов [83]. В комплексообразование вступают как пектиновые молекулы со свободными карбоксильными группами, так и их производные, в частности, соли щелочных металлов, образующие комплексы с катионами двухвалентных металлов по реакции обмена.
Образующиеся комплексы нерастворимы в воде и выделяются из растворов в виде гелей. Наибольшее внимание в литературе уделено комплексообразованию пекти- 9+- 9+ нов с -металлами - Са и Mg . Из -металлов наиболее изучено комплексообразование пектинов с катионами Си2+. Показано, что лигандный узел в медных комплексах имеет псевдооктаэдрическую конфигурацию, когда в экваториальной плоскости катион Си2+ координирован четырьмя атомами кислорода. За последнее десятилетие процессы комплексообразования различных соединений, в том числе биополимеров с металлами, привлекают внимание ученых не только с точки зрения получения новых теоретических знаний о синтезе и свойствах металлокомплексов, но и в связи с поиском путей создания новых эффективных лекарственных препаратов. Установлено, что комплексообразование повышает терапевтическую активность лигандов, снижает их токсичность, придает специфическое терапевтическое действие и иммунологическую активность [221]. Большое значение при этом имеет растворимость металлокомплексов в воде, способствующая повышению биоусвояемости препаратов и возможности их более широкого практического использования. Известные к настоящему времени металлокомплексы пектиновых полисахаридов, как отмечалось выше, нерастворимы в воде. Целью настоящего исследования являлось получение водорастворимых форм металлокомплексов пектиновых лигандов с катионами /-металлов. В качестве металлов были использованы биогенные металлы-микроэлементы Со2+, Cu2+, Fe2+, Mn2+, Zn2+, Ni2+, содержание которых в организме человека значительно влияет на состояние его здоровья [222-223]. Эти металлы играют важную роль в ферментативных процессах, происходящих в организме, являясь компонентами многих жизненно важных ферментов. Мы ожидали, что получение водорастворимых пектиновых комплексов с этими металлами позволит подойти к получению новых биологически активных веществ в ряду пектиновых полисахаридов, способных к включению в процессы метаболизма с участием природных металлокомплексов. В связи с этим, химические исследования в настоящей работе сопровождаются параллельными биологическими испытаниями по изучению влияния металлокомплексов на функцию кроветворения. Из литературных данных известно, что комплексообразующие свойства пектиновых веществ зависят от содержания карбоксильных групп, то есть степени этерификации поликарбоксильной полимерной цепи - основной цепи пектинов [222]. Степень этерификации определяет линейную плотность заряда макромолекулы и, следовательно, силу связи катионов с ней. При высокой степени этерификации свободные карбоксильные группы или карбоксианионы удалены друг от друга. При уменьшении степени этерификации они сближаются, происходит увеличение заряда макромолекулы и, соответственно, возрастание силы связывания пектинов с катионами.
На основе этих литературных данных следовало ожидать образования наиболее прочных комплексов для полностью деэтерифицированного пектина - пектовой кислоты, в связи с чем в качестве исходного вещества была выбрана ее натриевая соль - пектат натрия со степенью солеобразования 100 %. Данная соль получена обработкой пектина щелочью при контролируемых значениях рН при титриметрическом переходе рН из слабокислой в слабощелочную область. Наряду с контролем рН при разработке способа получения этой соли параллельно использовался контроль за состоянием карбоксильных групп методом ИК спектроскопии [155] в области валентных колебаний группы СОО"( 1660-1800 см-1) (табл. 10). Такой подход позволил нам получить натриевую соль пектовой кислоты с точно известным содержанием иона натрия в полимере и провести аналитические количественные расчеты для получения металлокомплексов пектовой кислоты с фиксированной степенью превращения полимерной молекулы при замене иона натрия на катион of-металла. Вторым фактором, который учитывался наряду с количественными расчетами при разработке путей получения целевых металлокомплексов d-металлов, была растворимость. Как уже отмечалось выше, известные металлокомплексы пектинов в воде не растворимы. Это связано с координацией металлов различными цепями, которая определяет образование двойных и даже тройных цепочечных структур, то есть со сшиванием параллельных макромолекул пектина металлом в трехмерном пространстве. Процесс координации (хелатирования) сопровождается изменением конформации полимерных цепей лиганда. Такой межмолекулярный механизм ком-плексообразования для полисахаридных полимеров за счет образования гидрофильной полости между мономерными звеньями соседних цепей постулируется для металлокомплексов всех известных анионных полисахаридов, в том числе и пектинов, при координации их с s-,p- и (/-металлами. В начале исследования мы предположили, что добиться образования растворимых в воде металлокомплексов пектовой кислоты можно за счет создания достаточно разреженной трехмерной структуры комплексов с относительно невысокой степенью замещения ионов натрия на (/-металл (в пределах 1-40 % двухвалентного металла относительно исходного содержания одновалентного натрия) при сохранении большей части ионов натрия в солевой форме в составе полимерного комплекса для обеспечения его водорастворимых свойств. Экспериментальные исследования по получению целевых водорастворимых биметаллокомплексов общей формулы I) показали, что их образование наряду с нерастворимыми комплексами наблюдается при использовании 1-25 %-ной концентрации (/-металла относительно концентрации ионов натрия. Использование более высоких концентраций (/-металлов приводит к образованию только нерастворимых форм комплексов и формированию гелей в маточных растворах.
Получение молекулярных комплексов полисахаридов с насыщенными дикарбоновыми кислотами
При разработке способов выделения пектина из амаранта нами было замечено, что некоторые гидролизующие реагенты, такие как янтарная кислота, способны образовывать комплексы с пектином. Янтарная кислота является мощным средством повышения устойчивости организма к неблагоприятным внешним воздействиям за счет нормализации работы системы энергообмена [231 - 235]. В цикле три-карбоновых кислот янтарная кислота образуется при декарбоксилировании а-кетоглутаровой кислоты [233]. Превращение этой кислоты в янтарную происходит в присутствии сложного комплекса катализаторов, одним из которых является кофермент А: а-кетоглутаровая кислота - СОг + кофермент А—+ сукцинил-кофермент А -» янтарная кислота + кофермент А. Дальнейшее превращение янтарной кислоты в лимоннокислом цикле дает фумаровую кислоту и катализируется ферментом сукцинатдегидрогеназой. В данном разделе мы исследовали процесс комплексооб-разования пектина с этой и другими кислотами. Пектиновые вещества при растворении в воде образуют комплексы с янтарной кислотой. Для того, чтобы определить количество янтарной кислоты, которое будет связываться с пектином, мы провели серию опытов с различным соотношением компонентов. Принципиальная схема получения комплекса пектин - янтарная кислота представлена на рис. 49. К пектину добавляется при перемешивании раствор янтарной кислоты определенной концентрации. Смесь нагревается при перемешивании до полного растворения пектина и охлаждается до комнатной температуры. Из охлажденного раствора комплекс осаждается спиртом - этанолом, высушивается, измельчается. Эта важная процедура указывает на то, что образуется именно комплекс. Структура этого комплекса подтверждена данными ЯМР 13С (см. глава II, рис. 9, 10). Нами изучена зависимость комплексообразования пектина с янтарной кислотой от температуры. Полученные данные представлены на рис. 50 и в таблице 12. Как можно видеть из графика, температура оказывает влияние на образование комплекса. С увеличением температуры, выход комплекса увеличивается, достигая максимума при 50-60С и далее не меняется. Таким образом, эта температура явля- ется оптимальной для процесса комплексообразования. Фильтрат концентрировали досуха под вакуумом (вакуум водоструйного насоса) и также определяли вес.
Далее произвели перерасчет полученных количеств сукцината натрия на свободную кислоту. И определяли, соответственно, количество кислоты, связанной с пектином в комплекс. Полученные нами данные представлены в табл. 13. Перерасчет производили по формуле где ть т2 - массы сукцината натрия и янтарной кислоты; Мь М2 - молекулярные массы сукцината натрия и янтарной кислоты соответственно. Как видно из табл. 13, в работе были использованы соотношения пектин : янтарная кислота от значения 15 : 2 до значения 9 : 5. Из таблицы также видно, что выход комплекса в каждом случае различный. Максимальное количество кислоты, связанной с пектином равно 0.49 г на 2.7 г пектина. Полученные данные демонстрируются графической зависимостью, представленной на рис. 52. Как видно из графика, количество янтарной кислоты, связываемой с пектином постепенно увеличивается, достигая максимума при 1.3 г, и далее не меняется независимо от увеличения количества кислоты. Таким образом, было определено максимальное количество янтарной кислоты, которое связывается с пектином в молекулярный комплекс за счет образования водородных связей. Для подтверждения факта комплексообразования пектина с янтарной кислотой, а не образование их механической смеси, было проведено сравнительное исследование структуры полученных комплексов и исходных веществ методом ИК спектроскопии и ЯМР 13С. Нами также проведено изучение зависимости молекулярного комплексообразования пектиновых биополимеров с гомологами насыщенных дикарбоновых кислот от длины углеродной цепи кислот. С этой целью были взяты дикарбоновые кислоты С2-С6: (НООС)2 (щавелевая), СН2(СООН)2 (малоновая), (СН2)2(СООН)2 (янтарная), (СН2)з(СООН)2 (глутаровая), (СН2)4(СООН)2 (адипиновая). Исследования проводили по значениям массы комплексов, образующихся в точке максимума, которые были получены на основании результатов взаимодействия пектинов с янтарной кислотой. В результате сравнительного изучения дикарбоновых кислот в реакциях молекулярного комплексообразования с пектинами получены следующие данные, представленные в табл. 14. чАнализ полученных данных позволяет сделать следующие заключения: 1. Щавелевая кислота, один из наиболее эффективных комплексонов в ряду природных соединений, проявляет в реакциях с пектинами в два раза менее выражен- ные комплексующие свойства, чем янтарная кислота (табл. 14). Анализ комплексов с щавелевой кислотой и их идентификация выполнены по методу аналитического контроля, разработанному для комплексов пектинов с янтарной кислотой. Достоверность данных проверена в сериях повторных опытов на примере щавелевой кислоты и всех других кислот, в том числе повторных опытах с янтарной кислотой. 2. Малоновая кислота (табл. 14) проявляет в два раза меньшие комплексообра-зующие свойства, чем щавелевая кислота и почти в четыре раза меньшие, чем янтарная кислота. 3. Гомологи янтарной кислоты - глутаровая и адиттовая кислоты - значительно уступают по комплексующим свойствам в реакциях с пектиновыми биополимерами (табл. 14).
Таким образом, наиболее выраженными комплексообразующими свойствами в реакциях молекулярного комплексообразования с пектиновыми биополимерами обладает янтарная кислота с длиной углеродной цепи четыре атома углерода. На втором месте находится щавелевая кислота с длиной цепи два атома углерода. Молекулярные комплексы пектиновых биополимеров с насыщенными дикарбоно-выми кислотами имеют слоистую структуру (экспериментальные наблюдения), что свидетельствует о сшивке цепей биополимера этими кислотами с образованием сетчатой структуры. Это может быть использовано для получения соединений "включения" на их основе, в том числе с физиологически активными соединениями и требует отдельного исследования в дальнейшем. Нами также изучено комплексообразование геометрическими изомерами {цис- и мря«с-)-1,2-этилендикарбоновой кислоты (малеиновой и фумаровой). Фумаровая кислота, как и янтарная, обладает физиологической активностью и перспективна для получения новых физиологически активных биополимерных веществ-композиций. В последнее время увеличилось применение фумаровой кислоты в качестве пищевых добавок. Для получения комплекса пектин - фумаровая кислота навеску измельченной фумаровой кислоты помещают в пробирку, предварительно высушенную до постоянной массы, пипеткой заливают 500 мл дистиллированной воды и растворяют при нагревании на водяной бане при температуре 50С. Навеску пектина помещают в колбу, в которую заливают растворенную фумаровую кислоту. Содержимое колбы нагревают до температуры 50-60С при тщательном перемешивании до полного растворения пектина в водном растворе фумаровой кислоты. Полученный комплекс осаждается добавлением к раствору 550 мл этилового спирта. Комплекс отделяется на центрифуге, высушивается в сушильном шкафу при температуре 40С. Проведена серия опытов с разным соотношением пектина и фумаровой кислоты. Принципиальная технологическая схема получения комплекса "пектин - фумаровая кислота" представлена на рис. 53. Для определения количества кислоты, вступившей в комплексообразование, навеску комплекса растворяют в воде при нагревании и разлагают раствором щелочи (рН 8). Далее освободившийся пектин осаждается добавлением к раствору этанола, отделяется центрифугированием, высушивается в сушильном шкафу. Упариванием фугата получается натриевая соль фумаровой кислоты. Далее определяют количество фумаровой кислоты, вступившей в комплекс, по формуле: 2 А/, где, mj - масса фумаровой кислоты, г; Mi - молекулярный вес фумаровой кислоты, г; Мг - молекулярный вес фумарата натрия, г; гпг - масса фумарата натрия, г. Методика анализа комплекса пектин - фумаровая кислота аналогична методике анализа комплекса «пектин - янтарная кислота».
