Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Фитохимия тысячелистника обыкновенного - Achillea millefolium L. s. 1. и тысячелистника щетинистого Achillea setacea Waldst. et Kit. семейства Астровые (Asteraceae)
1.1. Литературные данные о химическом составе исследованных видов тысячелистников 10
1.2. Фотохимическое исследование Achillea millefolium L. s. 1. Волжско-Камского бассейна 35
1.3. Фотохимическое исследование Achillea setacea Waldst. et Kit.
Воджско-Камского бассейна 84
1.4. Химическое сравнение и различия этих двух видов 101
1.5. Определение и содержание хамазулена в тысячелистниках 103
ГЛАВА 2 Ферментативная модификация химического состава тысячелистников
2.1. Ферменты пекарских дрожжей ("B.Y." реагента) в органическом синтезе 106
2.2. Ферментативная модификация каранона 110
2.3. Ферментативное восстановление растительного сырья тетраплоидного тысячелистника обыкновенного 113
2.4. Ферментативное восстановление растительного сырья гексаплоидного тысячелистника обыкновенного и тысячелистника щетинистого 116
ГЛАВА 3 Синтез сульфидов азуленового ряда реакциями хамазулена с сульфенилхлоридами
3.1. Хамазулен в реакциях сульфенилхлорирования (обсуждение результатов) 124
ГЛАВА 4 Экспериментальная часть
Материал исследования (места сбора, подготовка, сушка) 138
Получение эфирных масел 138
Хроматография эфирных масел 139
Приготовление ферментной системы пекарских дрожжей : .140
Ферментативная модификация каранона 141
Ферментативная модификация тысячелистника обыкновенного 141
Разработка эфирного экстракта травы тысячелистника обыкновенного 145
Получение сульфенилхлоридов 148
Получение сульфидов 1,4-диметил-7-этил азулена 148
Таблицы 149
Выводы 162
Литература
- Фотохимическое исследование Achillea millefolium L. s. 1. Волжско-Камского бассейна
- Ферментативная модификация каранона
- Ферментативное восстановление растительного сырья гексаплоидного тысячелистника обыкновенного и тысячелистника щетинистого
- Ферментативная модификация каранона
Введение к работе
Актуальность. Химические исследования лекарственных растений относятся к интенсивно развивающейся области органической химии. Выделение и исследование новых биологически активных субстанций растительного происхождения, определение их строения, взаимосвязи, изучение стереохимии углеродного скелета, химическая модификация и синтез производных, а также поиски путей применения их в медицине представляют одну из важных задач современной органической химии. Интересными объектами в этом отношении являются растения семейства Астровых (Asteracaea), а именно Тысячелистники (Achillea L.).
Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium L.) - самый распространенный вид рода Тысячелистников (Achillea L.), широко применяется в официальной и народной медицине при различных патологиях. Растение характеризуется ярко выраженным полиморфизмом, многокомпонентностью и непостоянством химического состава, в том числе эфирного масла, что. разумеется, сказывается на лечебных свойствах. В то же время имеются данные о наличии в составе эфирного масла указанного растения вещества с антифлогистическими свойствами -хамазулена(1,4-диметил-7-этилазулена). При этом содержание последнего в различных образцах далеко неодинаковое и зависит от количественного соотношения в нативном растении непрохамазуленовых и прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов (его предшественников), биосинтез которых зависит от набора хромосом и условий произрастания. Это создает необходимость изучения т. обыкновенного, произрастающего в конкретном регионе, разработке методов увеличения содержания биологически активного компонента - хамазулена, выделения его в индивидуальном виде для определения констант и разработки методики стандартизации сырья по его содержанию, а также синтеза производных на его основе - новых потенциальных биологически активных веществ. Химический состав Achillea millefolium L. Волжско-Камского региона в литературе неописан, а данные по компонентному составу его эфирного масла, модификации последнего и синтезу производных хамазулена отсутствуют.
Цель исследования.
1. Изучение химического состава эфирного масла Achillea millefolium L., произрастающего в Волжско-Камском регионе:
-
Выделение хамазулена (1,4-диметил-7-этилазулена) в индивидуальном виде, определение его констант и разработка на основе этих данных методики стандартизации лекарственного растительного сырья (л.р.с.) т. обыкновенного;
-
Разработка метода увеличения содержания в эфирном масле хамазулена ферментативной модификацией химического состава Achillea millefolium L.
-
Химическая модификация хамазулена - разработка нового эффективного синтеза сульфидов азуленового ряда реакцией природного хамазулена с сульфенилхлоридами.
Научная новизна.
Впервые проведено исследование химического состава эфирного масла т. обыкновенного и морфологически схожего тысячелистника щетинистого высокочувствительными методами ГЖХ-МС-спектроскопии, ИК-спектроскопии и ядерно-магнитного резонанса.
Впервые проведена и показана перспективность ферментативной модификации растительного сырья тысячелистника обыкновенного с целью увеличения содержания в эфирном масле биологически активного компонента - хамазулена.
Разработан высокоэффективный метод синтеза сульфидов 1,4-диметил-7-этилазулена -'- потенциальных биологически активных соединений.
Установлены физико-химические константы хамазулена и на их основе разработана методика стандартизации лекарственного растительного сырья тысячелистников по его содержанию.
Практическая значимость. Расширены знания о химическом составе эфирных масел т. обыкновенного и щетинистого. Определены физико-химические константы хамазулена и ^разработаны методики стандартизации и ферментативной модификации л.р.с. тысячелистников. Синтезированы сульфиды хамазулена -: потенциальные биологически активные вещества, которые могут быть использованы также и как синтоны в синтезе новых производных хамазулена с практически полезными свойствами.
Апробация работы. Основные результаты работы обсуждались и докладывались на III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" ( г. Москва, 16-20 апреля 1996 г.). Научно-практической
конференции молодых учёных КГМУ (г. Казань, 19 июня 1997 г.) и на VI Международной конференции "Антибиооксидант" (г. Москва, 18-20 ноября 1998 г.)
Публикации. По материалам работы опубликованы 2 статьи и тезисы 3 докладов.
Структура работы. Диссертация изложена на 172 страницах, включает 58 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, четырех глав, трех выводов и списка литературных ссылок из 136 наименований. В первой главе рассмотрен литературный материал по общей характеристике рода Тысячелистник, фармакологических свойствах и применении, химическом составе растений и эфирных масел. Дано обсуждение результатов, полученных по компонентному составу эфирного масла т. обыкновенного и щетинистого, приведены их сравнительные характеристики и методы стандартизации л.р.с. по определению главной биоактивной компоненты - хамазулену. Вторая глава посвящена вопросу ферментативной модификации химического состава тысячелистников с целью увеличения содержания в них прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов и, как следствие, хамазулена в эфирном масле. В третьей главе описана химическая модификация хамазулена: высокоэффективный синтез потенциальных биологически активных соединений - сульфидов азуленового ряда. Экспериментальная часть представлена в четвертой главе. Строение выделенных и полученных соединений доказывалось с применением методов хромато-масс спектроскопии, спектроскопии ЯМР на ядрах К и 13С, ИК, УФ, элементного и рентгеноструктурного анализа.
Фотохимическое исследование Achillea millefolium L. s. 1. Волжско-Камского бассейна
Содержание эфирного масла в надземной части тысячелистника обыкновенного зависит от фазы развития, части или органа растения, а также места сбора (различия в питании и освещенности). Наибольшее содержание его установлено в корзинках, но оно колеблется от 0.1 до 1.6% в зависимости от места сбора, фазы развития растений и других факторов (питание и освещенность). В листьях количество его меняется от 0.076 до 0.41%; в стеблях - от следов до 0.18%. Максимальное содержание эфирного масла во всех органах отмечено, по данным [85-87], в фазу цветения, а по данным [88-90] - в фазу бутонизации. Максимальное содержание эфирного масла отмечено во всех органах растения в фазы бутонизации и цветения.
Было также проведено сравнительное количественное определение числа компонентов эфирного масла методом газо-жидкостной хроматографии. По разным источникам установлено наличие от 23 до 42 пиков на ГЖ-хроматограмме. На сегодняшний день, по литературным данным, идентифицированы следующие соединения: (+)-а-пинен, (-)-(З-пйнен, камфен, лимонен, 1,8-цинеол, п-цимол, сантен, камфен, цис-оцимен, транс-оцимен, аллооцимен, копаен, пинокамфон, миртенилацетат, лимонен, борнеол, камфора, терпинеол, терпинолєн, изовалериановая кислота, изобутилацетат, фурфуриловый спирт, трициклен, сабинен, мирцен, а-терпинен, у-терпинен, терпинолєн, борнилацетат, кариофиллен, гумулен, кадинен, фарнезен, эвгенол, куминовый альдегид, изоартемизиакетон, туйон, цитраль, ментон, ментол, карвон, гераниол, гвайазулен, хамазулен, хамазуленкарбоновая кислота. Оставивши компонентами эфирного масла Achillea millefolium L. ( содержание более 5% в эфирном масле) отмечены - (+)-а-пинен, сабинен, камфора, изоартемизиакетон, 1,8-цинеол, (-)-Р-пинен, кариофиллен, хамазулен, камфен. В результате исследований методом ГЖХ эфирного масла тысячелистника обыкновенного, выращенного в США, в его составе обнаружено 23 соединения (всего отмечено 42 пика на хроматограмме)[91]. В составе эфирного масла тысячелистника обыкновенного, произрастающего в Венгрии, - 27 веществ [92], а собранного на территории бывшего СССР, в Средней Азии, - 36 компонентов [93]. Составы масел представлены главным образом моно- и сесквитерпеноидами.
Важным фактом является то, что химический состав эфирного масла сильно меняется в зависимости от места произрастания. Меняется не только компонентный состав эфирного масла, но и содержание мажорных веществ в достаточно широком интервале. Так, азулены не обнаружены в американском тысячелиснике обыкновенном, однако в нем преобладают сабинен (до 12%), камфора (до 18%) и камфен (до 6%). В эфирном масле тысячелистника обыкновенного, произрастающего в Венгрии, методом ГЖХ из обнаруженных 27 веществ идентифицировано 10, из них 8 были уже описаны, а два -хамазулен и туйон - ранее не были найдены, при этом содержание хамазулена составляло 25.4%. В эфирном масле из надземной части гексаплоидных форм тысячелистника обыкновенного, выращенных в штате Иллинойс США, было зо установлено наличие 23 соединений, из которых у 13 была определена структура [91].
В эфирном масле Achillea millefolium L. из Средней Азии тем же методом обнаружено 36 компонентов, среди которых преобладали борнилацетат (до 23%), 1,8-цинеол (до 18%), гвайазулен (до 6,5%), а-терпинеол (до 6%). Гвайазулен был найден в эфирном масле тысячелистника обыкновенного впервые [93].
Таким образом, у тысячелистников (Achillea L.) происходит накопление эфирного масла и биосинтез сесквитерпеновых лактонов. Причем местом накопления последних по данным [94-96] являются околоцветник и трубчатые цветки. Эфирное же масло накапливается в эфирно-масличных железках и представлено, главным образом, "классическими" терпенами и терпеноидами, и, скорее всего, не содержит в чистом виде сесквитерпеновые лактоны. Местом же их локализации являются секреторные ходы, которые нередко видны при микроскопии с маслянистым или зернистым содержимым [32].
Как известно, сесквитерпеновые лактоны относятся к нестойким соединениям и легко разрушаются с образованием близких по строению терпеноидов [97,98]. Наличие в лекарственном растительном сырье тысячелистников сесквитерпеновых лактонов, способных к деструкции с образованием летучих соединений, предопределяет некоторые различия в химическом составе эфирного масла и экстрактов. Например, большинство моно- и сесквитерпенов, таких как: пинены, 1,8-цинеол, камфора, борнеол и им подобные, переходят из сырья в эфирное масло в неизменном виде. Другие же образуются из лактонов при обработке растительного сырья кислотами и щелочами или же в процессе получения эфирного масла отгонкой с водяным паром. Так, хамазулен как таковой в растении не обнаружен, но входит в состав эфирного масла, получаемого указанным выше методом.
Хамазулен (45) - 1,4-диметил-7-этил-азулен - является особым компонентом эфирного масла тысячелистников. Это вещество обладает сильным противовоспалительным, антиаллергическим и обезболевающим действием и считается основной биологически активной компонентой тысячелистника обыкновенного [36,37]. Хамазулен (45)
Установление ценных фармакологических свойств хамазулена обусловило необходимость изучения тысячелистников, а именно тысячелистника обыкновенного и его популяций, на содержание этого вещества в их эфирных маслах. В результате различных зарубежных исследований было установлено, что содержание хамазулена в эфирном масле Achillea millefolium L., произрастающего в Венгрии, Чехии, Словакии, Румынии и Югославии, колеблется от 0 до 25% или в пересчете на воздушно-сухое сырьё от 0 до 300 мг% [86,89,99-102].
В нашей стране также было проведено сравнительное количественное определение хамазулена в эфирном масле из соцветий Achillea millefolium L., собранных в 33 пунктах европейской части бывшего СССР. Исследовались морфологически идентичные образцы. При этом было установлено, что содержание хамазулена в эфирном масле колебалось почти в таком же интервале: от практического отсутствия до 20-25% или от 0 до 170 мг% в пересчете на воздушно-сухое сырье. Интересен также результат максимального содержания хамазулена в фазу бутонизации у соцветий, и в фазу цветения у листьев [12].
Хамазулен (45) - летучее вещество и вместе с другими летучими компонентами отгоняется с паром, поэтому он входит в состав эфирного масла. Присутствие хамазулена в эфирном масле обнаруживается по окраске эфирного масла. Он придает маслу синий цвет даже в очень малых концентрациях. 1,4-диметил-7-этил-азулен (45) (хамазулен) образуется из некоторых сесквитерпеновых лактонов. В настоящее время из тысячелистника обыкновенного выделено 20 сесквитерпеновых лактонов, 9 из которых имеют азуленовый скелет. Однако при обработке растительного сырья паром, кислотами и щелочами хамазулен образуют лишь те, которые легко подвергаются дегидратации, дезацилированию, декарбоксилированию. Например, ахиллицин (26), 8-ангелоксиартабсин (28), миллефин (24).
Ферментативная модификация каранона
Нами предлагается использование классического прибора для отгонки летучих с водяным паром веществ в сочетании с вводом низкокипящего органического растворителя - гексана (т.кип.68С) или пентана (т.кип.36С). Прибор (рис.6) состоит из паровика 1, рабочей двугорлой обогреваемой колбы 2, насадки Вюрца 3 с пробкой 4, низходящего алонжированного холодильника 5 и приемника-делительной воронки 6. Низкокипящий органический растворитель помещается в приемник-делительную воронку перед отгонкой эфирного масла. Таким образом осуществляется защита от излишнего испарения терпеноидов из дистиллята. К концу отгонки эфирного масла пробка 4 с насадки Вюрца 3 заменяется капельной воронкой 7, в которую также помещается низкокипящий растворитель. Прикапывание осуществляется в рабочую колбу, поэтому пары гексана (или пентана) полностью омывают систему при конденсации, сводя потери эфирного масла практически к нулю.
С целью обнаружения и установления как можно большего числа компонентов эфирного масла и определения минорных компонентов было решено использовать значительные количество исходного материала. Для этого сырье, собранное в период массового цветения на различных участках, объединили и отгоняли эфирное масло из описанного выше прибора. Объем рабочей колбы -10 л, паровика - 2 л, скорость отгона дистиллята - 3-4 капли в
Прибор для определения содержания эфирного масла в тысячелистнике обыкновенном по ГФ СССР XI изд. том 1, стр. 291. а - круглодонная колба; б - паропроводная изогнутая трубка; в - холодильник; г -градуированная трубка приемника; д - спускной кран; е - сливная трубка; ж -расширение; з - боковая трубка; и - резиновая трубка; к - воронка Рис.6. Прибор, предлагаемый для отгонки и определения содержания эфирного масла из растительного сырья тысячелистников и других эфироносов. 1 - паровик; 2 - рабочая колба, 3 - насадка Вюрда; 4 - пробка; 5 - алонжированный холодильник; 6 - приёмник-делительная воронка; 7 - капельная воронка. секунду, время отгона - 12 часов, степень измельчения сырья - 5 мм.
Полученный дистиллят экстрагировали гексаном 5x100 мл. Гексановые вытяжки объединили и сушили безводным сульфатом магния в течение 1 суток. Раствор эфирного масла в гексане имел интенсивно синюю окраску. Затем отгоняли растворитель и концентрировали в вакууме при остаточном давлении 30-40 мм рт. ст. и температуре не выше 20С. Остаток - эфирное масло представляло собой маслянистую жидкость темно-синего цвета с резким запахом. Средний выход эфирного масла составил 0.25% в пересчете на воздушно-сухое сырьё" тысячелистника обыкновенного. Полученное масло массой 30 г подвергли хроматографированию на колонке с нейтральной окисью алюминия активности П по Брокману. Элюировали гексаном, смесями гексана и диэтилового эфира с возрастающим содержанием диэтилового эфира и чистым диэтиловым эфиром. Полученные после колоночной хроматографии индивидуальные вещества и фракции анализировали хромато-масс спектроскопически (ГЖХ-МС) на масс-спектрографе Incos-50B в сочетании с газовым хроматографом Varian-3400. Капиллярная колонка - фаза SE-30, длина - 30 м, 0 0.25 мм. Энергия ионизирующих электронов - 70эВ. Температура инжектора - 250С, ионного источника - 150С. Полученные спектры соединений сравнивали компьютерным анализом со спектрами уже известных веществ, либо проводили анализ фрагментации. Строение индивидуальных веществ и компонентов "узких" фракций паралельно подтверждали методами протонно-магнитного (ПМР) и ядерно-магнитного (13С-ЯМР и 13С-ЯМР-ОЕРТ) резонанса, инфракрасной спектроскопии. Компонентный состав эфирного масла тысячелистника обыкновенного Achillea millefolium L., произрастающего на территории Волжско-Камского бассейна, представлен следующими группами соединений: ? линейные насыщенные углеводороды; ? терпены и терпеноиды;
В результате колоночной хроматографии на нейтральной окиси алюминия активности П по Брокману выделены следующие фракции:
Фракция 1 - парафиновая, элюент - гексан. Представляет собой густую бесцветную зернистую массу, без запаха, при нагревании до 50С плавится, давая прозрачный бесцветный раствор. Хорошо растворима в гексане и горячем диэтиловом эфире, плохо в холодном диэтиловом эфире., Фракция 1 по данным ГЖХ-МС (рис.7) является смесью алканов как с нечетным, так и четным количеством углеродных атомов, причем все они обнаружены в эфирном масле Achillea millefolium L. впервые. В ПМР спектре фракции (рис.8) имеются сигналы метильных протонов - слабый триплет при 0.88 м.д., и метиленовых протонов - сильный сигнал в области 1.26 м.д. С-ЯМР спектры также подтверждают парафиновую природу фракции (рис.9).
Обращает на себя внимание фактор чётность-нечётность по содержанию парафинов: парафины с нечётным количеством углеродных атомов доминируют, что может служить указанием на их происхождение. Так как они являются продуктами поликетидного пути биосинтеза, ведущего к н-цепочкам с чётным количеством углеродов, то можно предположить, что они образуются из соответствующих насыщенных жирных кислот реакцией декарбоксилирования: -СО2, Enzyme CH3-CO-S-C0A - СН3-(СН2)п-СООН -» СНз-(СН2)п-гСНз, где п чётное. Этот биосинтетический путь является основным. Минорное присутствие углеводородов с четным количеством углеродных атомов указывает на то, что реакция ферментативного восстановления поликетидов также имеет место, хотя и в меньшей степени, что очевидно связано с большими энергетическими затратами на последнюю:
Ферментативное восстановление растительного сырья гексаплоидного тысячелистника обыкновенного и тысячелистника щетинистого
Высокая морфологическая схожесть тысячелистника обыкновенного и тысячелистника щетинистого побудили провести аналогичные исследования эфирного масла последнего.
Нами проведено исследование химического состава эфирного масла тысячелистника щетинистого Achillea setacea Waldst. et Kit., получаемого методом гидродистилляции, и сравнение его компонентного набора с составом эфирного масла лекарственного растения - тысячелистника обыкновенного.
Эфирное масло получали методом перегонки с водяным паром, используя прибор описанный выше. Средний выход эфирного масла составил 0.35%. Разрабатывали полученное эфирное масло массой 10 г, хроматографировали и анализировали выделенные фракции и индивидуальные вещества в полной аналогии с эфирным маслом тысячелистника обыкновенного. В результате колоночной хроматографии выделены следующие фракции:
Фракция 1 - парафиновая, элюент - гексан. Представляет собой густую бесцветную зернистую массу, без запаха, при нагревании до 50С плавится, давая прозрачный бесцветный раствор. Хорошо растворима в гексане и горячем диэтиловом эфире, плохо в холодном диэтиловом эфире. Спектры ПМР и ЬС-ЯМР фракции идентичны таковым парафиновой фракции тысячелистника обыкновенного, т.е. фракция представлена линейными насыщенными углеводородами.
Фракция 2 - терпеновая, элюент - гексан, бесцветная, с сильным ароматным запахом. Терпеновый состав эфирного масла характеризуется наличием монотерпенов и сесквитерпенов (рис.33). Доминирующими компонентами являются м-цимол (92) и у-терпинен (93). а- и Р- Пинены в составе фракции терпенов у тысячелистника щетинистого не обнаружены. Сесквитерпены же отличаются большим разнообразием структур. Из них найдены лонгифолен (95), элемен (96), (3-бурбонен (97), копаен (98), у-мууролен (99), 8-кадинен (100). Интересно обнаружение 4-карена (94) и 3-карена (56). Последний найден в тысячелистнике обыкновенном. iOQ.O. 382
Фракция 3 - азуленовая, элюент - гексан. Незначительна и предсталена следовыми количествами хамазулена (45). Такие результаты по содержанию хамазулена в эфирном масле тысячелистника щетинистого говорят о практическом отсутствии в нативном растении прохамазуленовых сесквитерпеновых лактонов.
Фракция 4 - терпеноидная, элюент - смеси гексана и диэтилового эфира с возрастающей полярностью и чистый диэтиловый эфир. Эта фракция представлена значительно большим числом соединений (по результатам тонкослойной хроматографии), поэтому была подвергнута повторной хроматографии на колонках как с нейтральной окисью алюминия активности П по Брокману, так и на колонках с силикагелем Silicagel L 60/100 чешского производства. Выделенные смеси и индивидуальные вещества анализировали
В результате повторной хроматографии, также как и в случае с эфирным маслом тысячелистника обыкновенного, удалось выделить в индивидуальном виде монотерпеноид - 1,8-цинеол (63), и подтвердить его строение спектрами ПМР. В спектре ПМР наблюдались сигналы протонов метила - синглет при 1.0 м.д., геминальных метальных групп - синглет при 1.20 м.д., метилового протона - мультиплет при 2.0 м.д., протонов метиленовых групп - 1.25-1.8 м.д. В спектре С-ЯМР наблюдались характерные сигналы четвертичных углеродов С1 при 69.1 м.д. и С8 при 73.0 м.д., исчезающие в DEPT-спектре.
Другие фракции (4а-4г) являются многокомпонентными смесями и представлены гидроксил- и карбонил-содержащими производными (рис.34,36,39,42). Необходимо отметить, что кетоны существенно преобладают в количественном выражении и характеризуются большим разнообразием структур, в том числе неустановленного строения с m/z = 222 состава С15Н2бО, которые содержатся во всех названных фракциях (4а,4б,4в,4г). Анализ масс-спектров последних дает основание утверждать, что это сесквитерпеновые спирты кадинанового ряда вследствие наличия осколочных ионов с массой 204 (М - Н20), 161 (метилнафталин), например, рисунок 35. Кроме того, в спектрах 13С-ЯМР этих фракций имеются сигналы четвертичных атомов углерода, исчезающие в DEPT-спектре в области 70-77 м.д., что указывает на наличие в их структурах третичных гидроксильных групп. Таким образом, это сесквитерпеновые спирты кадинанового ряда и их изомеры.
Во фракции 4а доминирующим компонентом является артемизиакетон (101). Это видно как и по данным ГЖХ-МС анализа (рис.34), так и по ПМР спектру фракции. В ПМР спектре (рис.33) отчетливо наблюдаются сигналы винильных протонов - дублет дублетов в области 5.86 м.д.(Ш) и 5.07 м.д.(2Н) J]=17 Гц J2=13.5 Гц , олефинового протона Н3 - уширенный синглет при 6.16 м.д., гем-диметильных протонов - синглет при 1.06 м.д., протонов метальных
Ферментативная модификация каранона
Структура продуктов была также подтверждена данными рентгеноструктурного анализа кристаллов соединения (113) (рис.57, табл.7). В последних обращает на себя внимание общая непланарность молекулы - угол между азуленовой и тетразолиновой плоскостями почти прямой, угол между тетразолиновой и фенильной плоскостями около 45. Ортогональность тетразолинового и азуленового фрагментов скорее всего обязана взаимодействию их я-систем с п-уровнем сульфидной серы - при этом, взаимодействие НЭП атома серы с азотистым гетероциклом является стабилизирующим (система атомов практически планарна) очевидно по причине высокой тс-акцепторности тетразолинового цикла, тогда как взаимодействие этой же НЭП серы с азуленовым бициклом является дестабилизирующим (диэдральный угол Сь S1 С3 С2(10) равен 89 (96)) очевидно по причине существенной электронодонорности тг-системы азулена и, следовательно, энергетической близости верхних занятых уровней этих двух фрагментов. Последнее предположение подтверждается величинами первых ионизационных потенциалов сульфидов (ПИі=8.0-8.5 эВ [128] и азулена (ПИг=7.42 эВ [125]).
Наличие заместителей в положениях 3 и 4 азуленовой системы приводит к короткому невалентному контакту между метильной группой и атомом серы, равному 3.1 А при сумме ван-дер-ваальсовых радиусов углерода и серы 3.5 А. При этом увеличение валентных углов при sp2 атомах углерода С3, С4, С10 до 129-133 свидетельствует о значительной напряженности структуры и о сильном стерическом взаимодействии между метильной группой и атомом серы, которое частично компенсируется слабым аттрактивным взаимодействием между одним из атомов водорода метильной группы и атомом серы с параметрами l(H...S)-2.7 А, 1(С-Н)=1.02(3) A, ZC,2H123S1=105.7.
В кристалле молекулы упакованы в димеры с плоскопараллельной ориентацией азуленовых фрагментов расположенных на расстоянии 3.6 А (рис.58), таким образом, что пяти-членный цикл находится над семи-членным, что обеспечивает аттрактивное взаимодействие их согласно распределению зарядов в азуленовом бицикле - взаимодействие по типу комплекса с переносом заряда.
Таким образом, из проведенного нами исследования видно, что хамазулен является перспективным реагентом для синтеза азуленов с сульфидной группой при С3 и разнообразными радикалами при атоме серы с целью получения потенциальных биологически активных соединений. Кроме того, полученные соединения могут быть использованы как синтоньї в последующих исследованиях.
Соцветия тысячелистника обыкновенного заготавливали в июне -сентябре 1994-1996 гг. в фазе начала цветения и цветения. Места сбора: Республика Марий Эл - лесная опушка и садово-огородный участок близ поселка Илеть; Республика Татарстан - пойма реки Казанки близ деревни Кульсеигово, Высокогорского района, пойма реки Волги близ поселка Матюшино, луга близ деревни Семиозерки, Высокогорского района; Приволжский район г.Казани (удаленность от промышленных предприятий более 20 км).
Соцветия тысячелистника щетинистого заготавливали в июле 1995 года в период массового цветения на территории Приволжского района г. Казани близ деревни Куюки. Всё сырье сушили и хранили в соответствии с "Правилами сбора и сушки лекарственных растений"(1985) [108]. Получение эфирного масла Эфирное масло из собранных образцов сырья тысячелистников, а также из образцов сырья после ферментативного восстановления, получали перегонкой с водяным паром или гидродистилляцией, используя разработанный нами прибор, описанный на странице 36 (рис.6) настоящей работы.
Для определения хамазулена в тысячелистниках: В рабочую колбу прибора для отгонки эфирного масла тысячелистников (рис.6) помещали 20 г цветочных корзинок тысячелистника обыкновенного, проходящих сквозь сито 0 5 мм, заливали 100 мл дистиллированной воды, подсоединяли паровик, заливали в приемник-делительную воронку 10 мл гексана и отгоняли эфирное масло в течение 3-х часов с момента появления 139 первых капель дистиллята. Скорость отгона дистиллята - 2 капли в секунду. По окончании отгонки в рабочую колбу с помощью капельной воронки вводили 20 мл гексана и пар пропускали до полного перехода органического растворителя в приемник-делительную воронку. Затем полученный дистиллят экстрагировали в этой же делительной воронке гексаном 3x10 мл и доводили объем раствора до 50 мл в мерной колбе тем же растворителем. Содержание хамазулена (1,4 диметил-7-этилазулена (45)) определяли спектрофотометрически. Для получения хамазулена в препаративных количествах:
В рабочую колбу прибора объемом 10 л помещали 2 кг растительного сырья (степень измельчения сырья - 5 мм) тетраплоидного тысячелистника обыкновенного - Achillea millefolium 1. s. 1. , заливали 8 литрами горячей воды, подсоединяли паровик объемом 2 л и отгоняли эфирное масло. Скорость отгона дистиллята - 3-4 капли в секунду, время отгона - 12 - 15 часов, объем собранного дистиллята - не менее 7 литров. Полученный дистиллят экстрагировали гексаном 5x100 мл. Гексановые вытяжки объединяли и сушили безводным сульфатом магния в течение 1 суток. Раствор эфирного масла в гексане имеет интенсивно синюю окраску. Затем отгоняли растворитель и концентрировали в вакууме при остаточном давлении 30-40 мм рт. ст. и температуре не выше 20С. Остаток - эфирное масло представляло собой маслянистую жидкость темно-синего цвета с резким запахом. Средний выход эфирного масла составил 0.25 - 0.35 % в пересчете на воздушно-сухое сырьё тысячелистника обыкновенного.
