Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Растения рода дурнишник, их химический состав и применеие 13
1.1 Ботаническая характеристика и распространение растений рода дурнишник 13
1.2 Химический состав растений рода Дурнишник 15
1.3 Применение растений рода Дурнишник в народной медицине и фармакологические исследования 28
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования 42
2.1 Характеристика объектов исследования 42
2.2 Методы фитохимического исследования 42
2.2.1 Приготовление водных экстрактов для проведения качественных реакций 42
2.2.2 Углеводные производные 43
2.2.3 Азотсодержащие соединения 43
2.2.4 Дубильные вещества 45
2.2.5 Органические кислоты 46
2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями 47
2.2.7 Кумарины 47
2.2.8 Фенолкарбоновые кислоты 48
2.2.9 Флавоноиды 48
2.2.10 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 49
2.2.11 Тритерпеновые соединения 50
2.2.12 Приготовление гексановых экстрактов 52
2.2.13 Эфирноемасло
2.2.14 Обнаружение и идентификация сесквитерпеновых лактонотов 53
2.2.15 Минеральный состав растений 54
2.3 Методы изучения углеводов 54
2.3.1 Кислотный гидролиз \м „ 54
2.3.2 Хроматографический анализ 55
2.3.3 Количественное определение моносахаридного состава полисахаридных комплексов 55
2.3.4 Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ 2.4 Определение числовых показателей сырья 59
2.5 Морфолого-анатомические исследования 59
2.6 Методы токсико-фармакологических исследований
2.6.1 Изучение острой токсичности 60
2.6.2 Изучение анальгезирующего действия 60
2.6.3 Изучение диуретической активности 61
2.6.4 Изучение жаропонижающего действия 61
2.6.5 Изучение антимикробной активности 62
2.7 Статистическая обработка результатов эксперимента 63
ГЛАВА 3 Изучение биологически активных веществ травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного 64
3.1 Углеводные производные 64
3.1.1 Свободные сахара 64
3.1.2 Связанные сахара 64
3.2 Азотсодержащие соединения 65
3.2.1 Качественное обнаружение 66
3.2.2 Количественное определение 66
3.3 Дубильные вещества 61
3.3.1 Качественное обнаружение 67
3.3.2 Количественное определение 61
3.4 Органические кислоты 67
3.4.1 Качественное обнаружение 67
3.4.2 Количественное определение свободных органических кислот 68
3.4.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты 3.5 Кумарины 68
3.6 Фенолкарбоновые кислоты 69
3.7 Флавоноиды 69
3.8 Изучение фенольных соединений травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного методом ВЭЖХ 70
3.9 Тритерпеновые соединения
3.9.1 Качественное обнаружение 74
3.9.2 Количественное определение тритерпеновых соединений 75
3.10 Каротиноиды 75
3.10.1 Качественное обнаружение 75
3.10.2 Количественное определение каротиноидов 76
3.11 Эфирное масло 76
3.11.1 Выделение и исследование эфирного масла 76
3.11.2 Количественное определение эфирного масла 81
3.11.3 Обнаружение сесквитерпеновых лактонов 82
3.12 Минеральный состав растений 83
3.13 Изучение углеводов 85
3.13.1 Выделение водорастворимых полисахаридных комплексов 85 ЗЛ3.2 Выделение пектиновых веществ 87
ЗЛЗ.З Выделение гемицеллюлозы А и Б 88
3.14 Исследование углеводных производных 88
ГЛАВА 4 Исследование подлинности, показателей качества травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного 97
4.1 Разработка характеристик подлинности 97
4.1.1 Изучение морфологических признаков 97
4.1.2 характеристика микродиагностических признаков сырья 99
4.2 Числовые показатели 126
4.2.1. Определение влажности 126
4.2.2 Определение золы 127
4.2.3 Определение экстрактивных веществ 127
4.3 Разработка методик количественного определения
действующих веществ растений рода Дурнишник 128
4.3.1 количественного определения суммы полисахаридов 129
4.3.2 Количественное определение суммы флавоноидов 134
ГЛАВА 5 Изучение фармакологической активности травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного 145
5.1 Изучение острой токсичности 145
5.2 Изучение анальгезирующего действия
5.2.1 Изучение анальгезирующего действия на модели «горячая пластинка» 147
5.2.2 Изучение анальгезирующего действия на модели «корчи»
5.3 Изучение диуретической активности 149
5.4 Изучение жаропонижающего действия 150
5.5 Изучение антимикробной активности травы дурнишника
беловатого и дурнишника обыкновенного 152
Выводы 155
Литература
- Применение растений рода Дурнишник в народной медицине и фармакологические исследования
- Обнаружение и идентификация сесквитерпеновых лактонотов
- Количественное определение
- Определение экстрактивных веществ
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время растения являются важным источником лекарственных средств. Растительные препараты легко включаются в обмен веществ и усваиваются организмом, при правильном применении безвредны, не вызывают побочных явлений и привыкания, а комплекс биологически активных веществ, содержащийся в них, оказывает разностороннее и взаимодополняющее действие. В связи с этим изучение новых видов растительного сырья и их внедрение в научную медицину является одной из задач современной фармакогнозии.
Источником новых лекарственных растений остается опыт народной медицины. В частности, в народной медицине стран Европы, Азии, Африки находят применение дурнишник обыкновенный (Xanthium strumarium L.) и дурнишник беловатый (Xanthium riparium Itz. Et Hertsch) как потогонное, антимикробное, противоопухолевое, противогрибковое средство. В народной медицине Йемена дурнишник обыкновенный применяется в качестве анальгезирующего, кровоостанавливающего средства, а также для лечения кожных заболеваний. Надземная часть дурнишника обыкновенного официнальна в Китае как потогонное, спазмолитическое, седативное средство. Оба растения - дурнишник обыкновенный и дурнишник беловатый - произрастают в России во многих районах европейской части, на Кавказе, в Западной Сибири. Дурнишник обыкновенный достаточно широко распространен и на территории Йемена.
Из данных литературы известно, что из двух приведенных видов дурнишника, произрастающих в России, в химическом отношении изучен только дурнишник обыкновенный, для него характерно наличие сесквитерпеновых лактонов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, флавоноидов. Однако до настоящего времени в России систематического изучения дурнишника беловатого не проводилось, так лее как и не проводилось изучение дурнишника обыкновенного из флоры Йемена. Поэтому изучение дурнишника беловатого, произрастающего на территории Центральной России, и дурнишника обыкновенного из флоры Йемена с целью введения их в научную медицину является актуальным.
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось фармакогностическое изучение дурнишника обыкновенного и дурнишника беловатого как перспективного лекарственного растительного сырья для введения в научную медицину.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
-проведение фитохимического изучения дурнишника беловатого, произрастающего в Центральной России, и дурнишника обыкновенного флоры Йемена;
выделение и исследование полисахаридных комплексов;
разработка методик количественного определения основных групп биологически активных веществ: суммы полисахаридов и суммы флавоноидов;
проведение морфолого-анатомических исследований с целью выявления диагностических признаков для определения подлинности сырья;
разработка и обоснование товароведческих показателей для определения доброкачественности сырья;
проведение предварительных фармакологических исследований.
Научная новизна
Проведено фитохимическое изучение травы дурнишника беловатого флоры Центральной России и дурнишника обыкновенного флоры Йемена. Установлено наличие углеводных производных, азотсодержащих соединений, органических кислот, тритерпеновых соединений, каротиноидов, фенольных соединений (дубильных веществ, кумаринов, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов), эфирного масла. Исследован минеральный состав растений.
Различными методами хроматографии (бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ) в траве дурнишника беловатого идентифицировано 8, а в траве дурнишника обыкновенного 10 веществ фенольной природы. Новыми для травы дурнишника беловатого были дигидрокумарин, 7-метоксикумарин, кумарин, галловая кислота, хлорогеновая кислота, феруловая кислота, кверцетин, лютеолин 7-глюкозид; для травы дурнишника обыкновенного - кумарин, хлорогеновая кислота, апигенин, дигидрокверцетин.
Методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) установлен качественный состав эфирного масла из травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного. Идентифицировано 48 веществ у дурнишника беловатого и 39 веществ у дурнишника обыкновенного.
Впервые выделены и изучены полисахаридные комплексы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного. Полисахаридные комплексы представлены водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами, ге-мицеллюлозами А и Б. Изучен их качественный и количественный моносаха-ридный состав. Проведено определение функциональных групп пектиновых веществ.
Для объективной оценки качества травы дурнишника обыкновенного и дурнишника беловатого впервые разработаны методики гравиметрического оп-
ределения суммы полисахаридов и спектрофометрического определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид.
Проведено морфолого-анатомическое изучение надземной части дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного. Установлены диагностические признаки для определения подлинности сырья. Разработаны числовые показатели, регламентирующие качество сырья.
Фармакологические исследования показали наличие у дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного анальгезируюшего, диуретического, жаропонижающего, антимикробного действия.
Практическая значимость
Полученные результаты позволяют расширить сведения о химическом составе, фармакологической активности дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного. Результаты фармакологических исследований являются экспериментальным обоснованием для дальнейшего углубленного изучения данных растений с целью введения их в научную медицину.
На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:
методика количественного определения суммы полисахаридов в траве дурнишника беловатого (Акт внедрения № 80 в работу ОКК ЗАО Фирма "Здоровье" от 20.11.2009 г);
методика количественного определения суммы полисахаридов в траве дурнишника обыкновенного (Акт внедрения № 15 в работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ВГМА им. Бурденко от 02.08.2010 г.);
методика количественного определения суммы флавоноидов в траве дурнишника обыкновенного (Акт внедрения № 52 в работу ОКК ЗАО Фирма "Здоровье" от 20.11.2009 г).
Положения, выносимые па защиту:
-результаты фотохимического исследования травы дурнишника беловатого флоры России и дурнишника обыкновенного флоры Йемена;
-данные по выделению полисахаридных комплексов и изучению их состава;
методики количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов;
результаты морфолого-анатомическнх исследований с установлением диагностических признаков сырья;
результаты разработки и определения показателей доброкачественности для травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного;
-результаты предварительных фармакологических исследований травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного.
Апробация работы
Основные положения диссертации апробированы и представлены на 74-й и 75-й межвузовских научных конференциях студентов и молодых ученых "Молодежная наука и современность" (Курск, 2009, 2010), "Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов" (Курск, 2008); на 74-й научной конференции КГМУ, сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН "Университетская наука: теория, практика, инновации" (Курск, 2009); на межвузовской научной конференции, посвященной памяти профессора В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ (Курск, 2009); на 3-й и 4-й международной научной конференции "Актуальные проблемы регионоведения" (Курск, 2008,2009); на IV Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010); на международных научно-практических конференциях: "Лекарственные растения и биологически активные вещества: фитотерапия, фармация, фармакология" (Белгород, 2008), "Биологически активные соединения природного происхождения: фармацевтический маркетинг, фармацевтическая технология, фармакология, ботаника" (Белгород, 2008), "Кластерные подходы в современной фармации И фармацевтическом образовании" (Белгород, 2008), "Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения", посвященной 10-летию образования ботанического сада Белгородского государственного университета, (Белгород, 2009), "Фитодизайн в современных условиях" (Белгород, 2010), "Молодые ученые в решении актуальных проблем науки" (Владикавказ, 2010); на международных форумах "Интегративная медицина" (Москва, 2008, 2009); на XVI и XVII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2009, 2010); на научной конференции "Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции" (Пятигорск, 2010); на юбилейной научно-практической конференции с международным участием "Фармакогнозія XXI століття. Досягнення та перспективи" (Харків, 2009); на международной научно-практической конференции "Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства" (Казахстан, 2009); International medizinscher congress. Program Abstracts. Euromedica Hannover 2009, (Ганновер, 2009) на II Российском фитотерапевтическом съезде (Москва, 2010 г).
Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.2009.50639).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них 2 в журналах, рекомендуемых ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), главы "Объекты и методы исследования", экспериментальной части (3 главы), общих выводов, списка литературы, приложения. В тексте содержится 26 таблиц, 106 рисунков. Список цитируемой литературы включает 180 источников, из них - 91 на иностранных языках.
Применение растений рода Дурнишник в народной медицине и фармакологические исследования
Литературные данные о химическом составе дурнишника обыкновенного и дурнишника беловатого приведены в табл.1. Растения рода Дурнишник - известный источник сесквитерпеновых ксантанолидов. Этот класс соединений является одним из преобладающих [128, 158, 159, 174].
Изучение состава сесквитерпеновых лактонов дурнишника обыкновенного проводилось и проводится в разных странах. Ксантиносин -новый сесквитерпеновый лактон - был определен в надземной части дикорастущих экземпляров юга Европы и Индии. В растениях, произрастающих в Португалии, Египте, России и др., были идентифицированы ксантинин и ксантатин как главные составляющие наряду с ксантиносином [129, 174]. Комплекс этих соединений был подробно изучен на экспериментальных гибридах Xanthium strumarium L., выращенных в Индии и Гонконге. [143, 164, 169].
В процессе изучения разных по морфологии подвидов дурнишника обыкновенного, произрастающих на западе штата Техас, (США), установлено, что, наряду с преобладанием вышеописанных лактонов, в большом количестве присутствуют их стереоизомеры ксантомин, ксантиносин, томентосин, ксантоманол и диацетоксилксантомин [131, 139, 160].
В работах многих зарубежных исследователей качественно обнаружено большое количество различных сесквитерпеновых ксантанолидов. Это 3,4-дидесульфат карбоксиатрактилозида и 3,4-дидесульфат атрактозида, таусенторин, 8-эпиксантатин, 1.К.53-эпоксид, ксантомин-8-эпиксантанин, [161], ксантатин, 3,9- дигидроксиксантатин, ксатамол и ксантомин [162], 2-эпиксантанин, 8-эпиксантанин 5-эпоксид [150], 8-эпиксантатин эпоксид [98, 167].
В результате многочисленных исследований сесквитерпеновые ксантанолиды были не только качественно определены, но выделены и подробно изучены. Пащенко М.М. и Пивненко Г.П. в 1964 году разработали методику выделения кристаллического лактона ксантатина (С Н Оз) из травы дурнишника обыкновенного, основанную на применении метода колоночной хроматографии с использованием в качестве сорбента окиси алюминия. ИК-спектр лактона имеет полосы поглощения 1752, 1651, 1600см" , что соответствует наличию насыщенного пятичленного лактона, карбонильных групп, двойных сопряженных связей и изопропильной группировки [90]. Из травы дурнишника беловатого также были выделены ксантинин и ксантатин методом колоночной хроматографии [92].
Для ряда сесквитерпеноидов, выделенных из надземной части растения, была установлена пространственная конфигурация. Так, после выделения из растения Xanthium strumarium L. изучена структура ксантанола, изоксантанола и их С-4-эпимеров [173]. С помощью метода одномерной и двумерной ЯМР-спектроскопии определена структура 2-гидрокситоментосин-1-(3,5-р-эпоксида [138], 11-а,13-дигидроксиксантатина [106], 4-3,5-р-эпоксиксантатин-1-а,4-а-эндопероксида и 1-Р,4-Р,4-а,5-а-эндоксиксан-11-(13)эн-12-оиновой кислоты [137]. Методом ЯМР - корреляционной спектроскопии установлена структура 11-а,13-гидроксиксантатина и стигмастерола [95, 157]. Методами ВЭЖХ, ЯМР — спектроскопии и масс-спектрометрии выделен диацетил ксантомин и установлено его пространственное строение [125]. Jeong Нооп с соавт. описали свойства трех сесквитерпенов, выделенных из дурнишника обыкновенного. Извлеченная фракция из листьев была подвергнута очистке методом ВЭЖХ. Структуру сесквитерпенов устанавливали методом ЯМР-спектроскопии. В результате удалось идентифицировать ксантатин, ксантиносин и 4-оксобедфордскую кислоту [128].
Ряд сесквитерпенов был обнаружен при изучении хлороформных экстрактов плодов дурнишника обыкновенного, собранных на территории Канады [175]. Выделена смесь ксантанолидов, ксантиносина, ксантатина, 4-гидроксиксантиносина, ксантинина, 4-эпи-изоксантанола, 4- эпиксантанола, 2-гидроксиксантиносина и 4-оксобедфордекой кислоты [100, 114]; ксантанол и изоксантанол [134]. Семена Xanthium strumarium L. содержат гликозиды
карбоксиатрактилозид [108], ксантиальдегид и ксантиенопиран. Их структура установлена спектроскопическими методами [176].
В дурнишнике обыкновенном установлено наличие стероидных соединений. Стероиды надземной части растения, листьев и цветков представлены следующими соединениями: изогексакозаном, хлоробутанолом, р-ситостеролом, а-ситостеролом, пальмовой кислотой [102], сигмастеролом [157], глюкозидом р-ситостерина, є-ситостерином и струмастерином [102, 104]. Из метанольного экстракта корня дурнишника обыкновенного выделены стигмастерол-З-О-Р-О-гликопиранозид и сигмастерол [157].
В растениях рода дурнишник изучены фенольные соединения, представленные фенолкарбоновыми кислотами, флавоноидами, дубильными веществами. Фенолкарбоновые кислоты и их производные содержатся в различных частях дурнишника обыкновенного [109]. Наиболее изучены кофейная кислота и её производные. В 1970 году Пащенко М.М. и Пивненко выделили из травы дурнишника обыкновенного 3,4-диоксикоричную (кофейную) кислоту и 1,4-дикофеиловый эфир хинной кислоты (цинарин). Эти же кислоты были идентифицированы в дурнишнике беловатом [93]. Позднее, кроме кофейной, из надземной части дурнишника обыкновенного были выделены и изучены феруловая, галловая и хлорогеновая кислоты [103, 170].
Ting Han с соавт. изучали химический состав плодов дурнишника обыкновенного, в частности, они исследовали фенолокислоты образцов, собранных на территории Китая. Плоды высушивали, измельчали, экстрагировали 75% спиртом этиловым, упаривали под вакуумом, суспендировали водой и последовательно экстрагировали органическими растворителями: петролейным эфиром, хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом. Из н-бутанольной фракции методом колоночной хроматографии были выделены фенольные кислоты и установлена их структура методом УФ-, ИК- и ЯМР-спектрометрии. В результате исследования установлено, что общее содержание фенолокислот варьирует от 0,31% до 1,44%; установлена структура
З-О-кофеилхинной (хлорогеновой), 5-О-кофеилхинной, 1,5-ди-О кофеилхинной, 1,4-ди-О-кофеилхинной, 4,5-ди-О-кофеилхинной, 3,5-ди-О-кофеилхинной кислот, 1,3,5-три-О-кофеилхинной, кофейной и феруловой кислот [94, 155]. Также была разработана методика ВЭЖХ для выделения и определения кофеилхинных кислот (моно-, ди- и трикофеилхинные кислоты) [101].
Другими авторами из водно-ацетонового экстракта плодов дурнишника обыкновенного были получены кофейная кислота, калия 3-О-кофеилохиннат, 1,5-ди-О-кофеилхинная кислота и 1,3,5-три-О-кофеилхинная кислота [109, 123, 141, 146, 166].
Флавоноиды обнаружены в надземной части и плодах дурнишника обыкновенного методом ТСХ-анализа. Флавоноиды надземной части представлены агликонами: лютеолином, кверцетином и их гликозидами. В плодах идентифицированы изофлавоноиды: формононетин и ононин [152, 170].
Дубильные вещества найдены только в листьях дурнишника обыкновенного [60]. Многие работы были посвящены проблеме изучения эфирного масла дурнишника обыкновенного. Так, Esmaelli с соавт. методом гидродистилляции получили эфирное масло из листьев (0,35%) и стеблей (0,3%) растения. В эфирном масле стеблей установили наличие 22 веществ, образующих 86,4% общего состава масла. Основные соединения - борнилацетат (19,5%), лимонен (15,0%), р-селинен (10,1%)), борнеол (17,9%), дезметоксиинсеколин (6,0%), терпинен-4-ол (5,4% ) и а-кадиналь (5,3%). Было установлено, что количество монотерпенов составляет 55,8%), сесквитерпенов - 26,4% . В эфирном масле листьев идентифицировано 28 веществ (85,2% из общего состава масла). Основные из них - лимонен (24,7%), ботеол (10,6%), р-кубебен (6,3%), борнилацетат (5,9%) и сабинен (4,2% ). Количество монотерпенов составляет 49,4%о, сесквитерпенов-29,1% [113].
Обнаружение и идентификация сесквитерпеновых лактонотов
Изучение качественного состава фенольных соединений проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы " GILSTON", модель 305, Франция; инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для "Windows". В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6 х 250 мм Kromasil С 18, размер частиц 5 микрон. В качестве подвижной фазы метанол-вода- кислота фосфорная концентрированная, в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,8 мл /мин. Продолжительность анализа 80 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора "GILSTON" UV/VIS модель 151, при длине волны 254 нм.
Для исследования траву дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстия 2 мм по (ГОСТ 214-83). Около 5,0 г измельченного растительного сырья помещали в колбы объемом 200 мл, прибавляли 45 мл спирта этилового 70% и нагревали на водяной бане с обратными холодильниками в течение 1 часа с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажные фильтры в мерные колбы вместимостью 50 мл и доводили объем спиртом ЭТИЛОВЫМ 70%) до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05%о растворов стандартных образцов (РСО) фенольных соединений в спирте этиловом 70%. По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и хроматографировали по вышеприведенной методике.
Идентификацию разделенных веществ проводили путем сопоставления времен удерживания пиков, полученных на хроматограмме пробы, с временами удерживания стандартных растворов.
Методом внутренней нормализации определено относительное содержание отдельных идентифицированных веществ в исследуемых образцах [69].
Наличие тритерпеновых соединений в сырье определяли в бутанольных фракциях спирто-водных извлечений и водных извлечениях с помощью качественных реакций: - для обнаружения сапонинов при помощи гемолиза эритроцитов крови брали 0,05 г высушенного смолообразного остатка бутанольного извлечения, растворяли в 5 мл изотонического раствора и прибавляли равный объем 2%-ной взвеси эритроцитов в изотоническом растворе, перемешивали и оставляли на сутки [81]; - к спиртовому раствору смолообразного остатка бутанольной фракции прибавляли 1% спиртовой раствор холестерина [81]; - к бутанольной фракции прибавляли 1%-ный раствор ванилина в кислоте хлористоводородной (реакция Розенталя) [81]; - прибавляли 2-3 капли водного извлечения в пробирку содержащую 5 мл 0,1н раствора кислоты хлористоводородной и в пробирку с 5 мл 0,1 н раствора натрия гидроксида и сильно встряхивали. По объему и интенсивности пены судили о природе сапонинов [29, 81];
Для подтверждения наличия тритерпеновых соединений исследуемые извлечения хроматографировали в тонком слое сорбента на пластинках «Силуфол» в системе растворителей: хлороформ-этилацетат (9:1), с последующим проявлением 20%-ным раствором кислоты серной [81].
Определение количественного содержания тритерпеновых соединений проводили фотоэлектроколориметрическим методом, основанным на реакции с концентрированной кислотой серной, с последующим измерением оптической плотности [33]. 5,0 г измельченного сырья (точная навеска) помещали в колбы вместимостью 100 мл и прибавляли 50 мл воды. Экстрагировали на кипящей водяной бане в течение 2 часов. Полученные извлечения фильтровали в мерные колбы объемом 50 мл и доводили дистиллированной водой до метки. 5 мл извлечений помещали в колбы, прибавляли 3 мл смеси концентрированной кислоты хлористоводородной и воды в соотношении 1:1, нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Полученные растворы охлаждали под струей холодной воды и сливали в делительные воронки. Колбы, где проводили гидролиз, ополаскивали 5 мл воды и добавляли смыв в делительные воронки. Сюда же вносили 20 мл смеси хлороформ - спирт этиловый 96% (5:1) и взбалтывали в течение 10 мин. Хлороформные извлечения фильтровали через фильтр с 5 г безводного натрия сульфата в стеклянной колонке с 2 г алюминия оксида. Операцию повторяли 3 раза, используя по 20 мл смеси хлороформ -спирт этиловый 96%.
Хлороформные элюаты упаривали на кипящей водяной бане досуха. Сухие остатки переносили в мерные колбы на 25 мл спиртом этиловым 70% и доводили до метки. К 5 мл полученных растворов прибавляли 5 мл концентрированной кислоты серной, перемешивали. Оптическую плотность измеряли через 30 мин на фотоэлектроколориметре при длине волны 490 нм, используя в качестве раствора сравнения воду.
Количественное определение
Исследование морфологических признаков травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного проводили на свежем и гербарном материале. Исследование проводили общепринятыми методами ГФ XI издания [глава 2, раздел 2.5] [25].
Морфологические признаки травы дурнишника беловатого: Стебель - 15 - 120 см высотой, бороздчатый, светло - желтый с редким жестким щетинистым опушением. Листья 10-20 см длиной и до 15 см шириной, треугольные или яйцевидные, 3-5 лопастные, у основания клиновидные, на верхушке коротко заостренные, неравномерно и крупно пильчато-зубчатые, с обеих сторон покрыты щетинистыми волосками, с короткими золотисто - желтыми железистыми волосками
Дурнишник беловатый однополые, собраны в колосовидные пазушные (Xanthium riparium Itz. Et Hertsch) соцветия. В верхней части общего соцветия располагаются корзинки с мужскими цветками, в нижней - с женскими. Корзинки с мужскими цветками шаровидные, многоцветковые с однорядной оберткой, состоящей из свободных листочков. Цветки с пятизубчатым венчиком, тычинок в числе пять, они свободные, на конце загнутые, нити тычинок прикреплены у основания венчика, столбик нераздельный.
Корзинки с женскими цветками, одиночные или клубочками находятся в нижней части соцветия, двуцветковые, обертка двухрядная. Наружные листочки обертки свободные, кожистые. Внутренние листочки сросшиеся, на верхушке с двумя твердыми клювовидными колючками с отверстиями, по всей поверхности, усаженные крючковидными или прямыми шипами, при созревании семянок твердеющие. Пестичные цветки заключены по два в сросшуюся обертку с нитевидным трубчатым малозаметным венчиком, рыльце двураздельное, его лопасти нитевидные расходящиеся, с сосочками, выставляющиеся наружу через отверстия в клювовидных колючках на верхушке обертки.
Морфологические признаки травы дурнишника обыкновенного: Стебель -15 - 120 см высотой, серовато -зеленый прямой жесткий ветвистый, реже простой, с коротким опушением, наверху железистым. Листья черешковые сердцевидные трех -пятилопастные неравно крупно зубчатые, с обеих сторон с тонкими прижатыми волосками или с щетинистым опущением (рис. 23).
Корзинки дурнишника обыкновенного однополые, собраны в колосовидные пазушные соцветия. В верхней части общего соцветия располагаются корзинки с мужскими Рис. 23. Дурнишник обыкновенный цветками, в нижней - с женскими. Корзинки с /«__ .« т ч r (Xanthium strumanum L.) мужскими цветками шаровидные, многоцветковые с однорядной оберткой, состоящей из свободных листочков. Цветки с пятизубчатым венчиком, тычинок в числе пять, они свободные, на конце загнутые, нити тычинок прикреплены у основания венчика, столбик нераздельный.
Корзинки с женскими цветками, одиночные или клубочками находятся в нижней части соцветия, двуцветковые, обертка двухрядная. Наружные листочки обертки свободные, кожистые. Внутренние листочки сросшиеся, на верхушке с двумя твердыми клювовидными колючками с отверстиями, по всей поверхности, усаженные крючковидными или прямыми шипами, при созревании семянок твердеющие. Пестичные цветки заключены по два в сросшуюся обертку с нитевидным трубчатым малозаметным венчиком, рыльце двураздельное, его лопасти нитевидные расходящиеся, с сосочками, выставляющиеся наружу через отверстия в клювовидных колючках на верхушке обертки.
Задачей наших исследований было изучение анатомических признаков травы дурнишника беловатого и дурнишника обыкновенного, которые могут быть использованы для диагностики сырья.
Анатомические исследования проводили на временных микропрепаратах, приготовленных по ГФ XI издания с последующей микрофотосъемкой [глава 2, раздел 2.5]. Исследовали надземные части растений (стебель, лист, черешок, соцветие и цветки).
Анатомическое строение дурнишника беловатого Стебель в поперечном сечении округлый, неравномерно слегка ребристый, шероховатый (рис. 24). Клетки эпидермиса стебля удлиненно-прямоугольные с прямыми или косыми конечными стенками или же клетки на концах сужены. Встречаются также многоугольные клетки изодиаметрической формы. Устьица отсутствуют (рис. 27, 28). Эпидермис опушен простыми волосками. Волоски двух типов - одни толстостенные 4-5 клеточные с длинной заостренной верхушкой, широким округлым основанием, покрыты бородавчатой кутикулой (рис. 27); в местах соединения клеток этих волосков имеются слабые узловидные вздутия (коленчатые волоски). Часто клетки волосков заполнены бурым содержимым. Волоски второго типа (рис. 27, 28) тонкостенные, многоклеточные, однорядные тупоконечные. Иногда клетки волосков заполнены буроватым содержимым, а конечная клетка нередко оборвана. Эти волоски наклонены к поверхности стебля, иногда почти прилегая к нему, и формой своей напоминают гусеницу (гусеницеобразные волоски).
Изредка встречаются эфиромасличные железки, состоящие из 8 клеток, расположенных в 2 ряда. В выделительных клетках железок хорошо видны друзы оксалата кальция (рис 26).
Стебель пучкового типа строения (рис. 24, 25). Первичная кора хорошо выражена. Уголковая колленхима образует 3-6 слоев клеток. Клетки коровой паренхимы несколько крупнее клеток колленхимы, округлой или овальной формы. Эндодерма хорошо выражена (рис. 25). В центральном цилиндре коллатеральные проводящие пучки разнообразной величины, располагаются кольцом в один ряд среди одревесневшей паренхимы, образующей механическое кольцо. Флоэма имеет мощную склеренхимную обкладку. Сосуды ксилемы расположены радиальными рядами, между которыми находится толстостенная склерифицированная паренхима (рис. 25). Сердцевина очень широкая, образована крупно-клеточной тонкостенной основной паренхимой, в клетках которой встречаются мелкие друзы оксалата кальция (рис. 29). Клетки сердцевины овальной или многоугольной формы. Иногда в центре сердцевины клетки разрушаются и образуют полость (рис. 24).
Определение экстрактивных веществ
Количественное определение полисахаридов в лекарственных растениях и препаратах из них проводят гравиметрическими [30], спектрофотометрическими [11] методами.
Метод спектрофотометрии основан на измерении оптической плотности в видимой области продуктов взаимодействия моносахаридов, образовавшихся после гидролиза полисахаридов с хромогенными реактивами, например, с кислотой пикриновой в щелочной среде [11].
Наиболее распространенным методом для анализа растительного сырья, содержащего большое количество полисахаридов, является гравиметрический метод, основанный на экстракции суммы полисахаридов из сырья с последующим осаждением их спиртом этиловым 95% [30]. Для анализа сырья "Дурнишника трава" нами разработана методика гравиметрического определения полисахаридов. Разработка методики проведена на одном образце сырья дурнишника беловатого. При этом изучены следующие стадии: - экстрагирование суммы полисахаридов; - условия осаждения полисахаридов.
Одной из продолжительных стадий при анализе полисахаридов является их количественная экстракция из лекарственного сырья. Процесс экстракции полисахаридов зависит от различных факторов: степени измельченности сырья, времени экстракции, температуры экстракции, типа экстрагента, соотношения сырье-экстрагент. В качестве экстрагента для выделения полисахаридов из сырья использовали воду очищенную [30, 70]. Измельченность сырья оказывает большое значение на процесс экстрагирования. Оптимальное значение измельченности, найденные различными авторами, в среднем совпадают и равны 1-3 мм [62]. Проведенные нами исследования по изучению влияния степени измельченности на экстракцию суммы полисахаридов приведены в табл.12.
Из данных таблицы 12 видно, что максимальное извлечение полисахаридов из травы дурнишника беловатого достигается при степени измельчения сырья до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм.
Для извлечения полисахаридов в литературе описана многократная экстракция сырья водой [30]. Нами использована экстракция до полного извлечения полисахаридов из измельченного сырья при соотношении сырье-растворитель 1:10. Полученные результаты представлены в табл. 13.
Из данных таблицы 13 видно, что при использовании пятикратной экстракции в течение 150 минут (5 раз по 30 минут) извлечение полисахаридов происходит полностью.
Для осаждения полисахаридов из водных извлечений используют спирт этиловый 96% [30]. Нами проведены исследования по изучению оптимального соотношения извлечения и спирта, обеспечивающего максимальный выход полисахаридов из сырья. Полученные результаты представлены в табл. 14.
Из данных таблицы 14 видно, что полнота осаждения полисахаридов из водных извлечений достигается при использовании пятикратного количества спирта этилового 95%. Описанные выше исследования по оптимизации условий экстракции и осаждения полисахаридов позволили разработать методику количественного определения полисахаридов в траве дурнишника. Методика количественного определения суммы полисахаридов
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 10,0 г измельченного сырья помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл воды, колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 30 минут. Экстракцию повторяют еще четыре раза по 100 мл в течение 30 минут каждый раз. Водные извлечения объединяют, центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 минут и декантируют в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 66 мм и предварительно смоченной водой. Фильтр промывают водой и доводят объемом раствора водой до метки (раствор А).
25 мл раствора А помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 125 мл спирта этилового 95%, перемешивают, подогревают на водяной бане при температуре 60 С в течение 5 минут. Через 30 минут содержимое центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 30 минут.
Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13-16 кПа через высушенный до постоянной массы при температуре 100-105 С стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Затем осадок количественно переносят на тот же фильтр и промывают 15 мл смеси спирта этилового 95% и воды (3:1). Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100-105 С до постоянной массы.
Из данных таблицы 15 видно, что максимальное содержание суммы полисахаридов накапливается в траве дурнишника беловатого от 14,31% до 15,41%, а в траве дурнишника обыкновенного оно составляет от 10,08% до 12,10%.
Ошибка метода количественного определения суммы полисахаридов с 95% вероятностью не превышает 4,92 % (табл.15).
Для количественного определения флавоноидов в лекарственных растениях и фитохимических препаратах используют весовые, объемные, фотоколориметрические, спектрофотометрические, флуориметрические и полярографические методы. Весовой метод используют для анализа растительного сырья с большим содержанием флавоноидов. Из объемных методов применяют потенциометрическое титрование в неводных растворителях и комплексонометрическое титрование [8].
Однако, первый метод малоизбирательный внутри каждой группы флавоноидов, а второй используется для определения флавоноидов, в молекуле которых содержится диоксигруппировка. Описано также применение полярографического метода. По чувствительности он почти не уступает флуориметрическому. Широкое применение нашли хроматографические методы количественного определения. Наиболее распространенным является спектрофотометрическое определение флавоноидов в УФ-области спектра в сочетании с хроматографией на бумаге или в тонких слоях сорбента. Спектрофотометрический и фотоколориметрический методы в видимой области применяют после проведения реакций с хромогенными реактивами [9, 40, 52]. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов
