Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Растения рода вероника, их химический состав и применение 13
1.1 Краткая ботаническая характеристика растений рода вероника 13
1.2 Химический состав растений рода Вероника 20
1.3 Применение растений рода вероники в медицине 27
Глава 2 Объекты и методы исследования 32
2.1 Характеристика объектов исследования 32
2.2 Методы фитохимического исследования 32
2.2.1 Приготовление водных экстрактов для проведения качественных реакций 32
2.2.2 Углеводные производные 33
2.2.2.1 Свободные сахара 33
2.2.2.2 Связанные сахара 33
2.2.3 Азотсодержащие соединения 33
2.2.3.1 Азотистые основания 33
2.2.3.1.1 Качественное обнаружение 33
2.2.3.2 Аминокислоты 34
2.2.3.2.1 Качественное обнаружение 34
2.2.3.2.2 Количественное определение 34
2.2.4 Дубильные вещества 35
2.2.4.1 Качественное обнаружение 35
2.2.4.2 Количественное определение 36
2.2.5 Органические кислоты 36
2.2.5.1 Качественное обнаружение 36
2.2.5.2 Количественное определение органических кислот 36
2.2.6 Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями 36
2.2.7 Кумарины 37
2.2.8 Фенолкарбоновые кислоты 37
2.2.9 Фенологликозиды 37
2.2.10 Флавоноиды 38
2.2.11 Изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ 39
2.2.12 Тритерпеновые соединения 40
2.2.12.1 Качественное обнаружение 40
2.2.12.2 Количественное определение 40
2.2.13 Иридоиды 41
2.2.13.1 Приготовление спирто-водных извлечений 41
2.2.13.2 Качественное определение иридоидов 42
2.2.14 Приготовление гексановых экстрактов 42
2.2.14.1 Каротиноиды 42
2.2.14.1.1 Качественное обнаружение 42
2.2.14Л .2 Количественное определение 42
2.2.15 Минеральный состав растений 43
2.3 Методы изучения фенольных соединений 43
2.3.1 Хроматографический анализ 43
2.3.2 Физические методы анализа 44
2.3.3 Химические методы доказательства структуры 46
2.4 Методы изучения углеводов 51
2.4.1 Кислотный гидролиз 51
2.4.2 Хроматографический анализ 52
2.4.3 Количественное определение моносахаридного состава полисахаридных комплексов 52
2.4.4 Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ 54
2.5 Определение числовых показателей сырья 55
2.6 Морфолого-анатомические исследования 56
2.7 Методы токсико-фармакологических исследований 56
2.7.1 Изучение острой токсичности 56
2.7.2 Изучение отхаркивающего действия 57
2.7.3 Изучение противовоспалительной активности 58
2.7.3.1 Влияние на процессы экссудации 58
2.7.3.2 Влияние на пролиферацию 59
2.7.3.3 Влияние на проницаемость капилляров у кроликов 59
2.7.4 Изучение анальгезирующего действия 60
2.7.4.1 Изучение анальгезирующего действия на модели «горячая пластинка» 60
2.7.4.2 Изучение анальгезирующего действия на модели «корчей» 60
2.7.5 Изучение диуретической активности 61
2.7.6 Изучение антиаритмической активности на хлорид кальциевой модели 61
2.7.7 Изучение антимикробной активности 62
2.8 Статистическая обработка результатов эксперимента 62
Глава 3 Изучение качественного и количественного состава, выделение основных групп биологически активных веществ растений рода вероника 63
3.1 Изучение качественного состава основных групп биологически активных веществ 63
3.1.1 Углеводные производные 63
3.1.1.1 Свободные сахара 63
3.1.1.2 Связанные сахара 64
3.1.2 Азотсодержащие соединения 64
3.1.2.1 Качественное обнаружение 65
3.1.2.2 Определение аминокислот 65
3.1.3 Дубильные вещества 69
3.1.3.1 Качественное обнаружение 69
3.1.3.2 Количественное определение 69
3.1.4 Органические кислоты 69
3.1.4.1 Качественное обнаружение 69
3.1.4.2 Количественное определение свободных органических кислот 3.1.4.3 Количественное определение аскорбиновой кислоты 70
3.1.5 Кумарины 71
3.1.6 Фенолкарбоновые кислоты 72
3.1.7 Фенологликозиды 72
3.1.8 Флавоноиды 73
3.1.9 Изучение фенольных соединений травы вероники простертой методом ВЭЖХ 74
3.1.10 Тритерпеновые соединения 77
3.1.10.1 Качественное обнаружение 77
3.1.10.2 Количественное определение тритерпеновых соединений 77
3.1.11 Иридоиды 78
3.1.12 Каротиноиды 78
3.1.12.1 Качественное обнаружение 78
3.1.12.2 Количественное определение каротиноидов 79
3.1.13 Минеральный состав растений 79
3.2 Выделение основных групп биологически активных веществ.. 81
3.2.1 Выделение фенольных соединений 81
3.2.1.1 Разделение веществ хлороформной фракции 83
3.2.1.2 Разделение веществ этилацетатной фракции 85
3.2.1.3 Выделение рутина из водного остатка 88
3.2.1.4 Выделение арбутина из бутанольной фракции 88
3.2.1.5 Разделение веществ водного остатка 88
3.3 Выделение углеводов 89
3.3.1 Выделение водорастворимых полисахаридных комплексов 89
3.3.2 Выделение пектиновых веществ 92
3.3.3 Выделение гемицеллюлозы А и В 92
Глава 4 Химическое изучение фенольных соединений и углеводов растений рода вероника 95
4.1 Исследование структуры фенольных соединений 95
4.1.1 Оксикумарины 95
4.1.2 Оксикоричные кислоты 100
4.1.3 Фенолокислоты 102
4.1.4 Простые фенологликозиды 103
4.1.5 Флавоноидные агликоны 104
4.1.6 Флавоноидные гликозиды 108
4.2 Исследование углеводных производных 122
4.2.1 Исследование качественного состава полисахаридных комплексов методом хроматографии на бумаге 122
4.2.2 Количественное определение моносахаридного состава полисахаридных комплексов 125
4.2.3 Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ 125
Глава 5 Исследование подлинности, показателей качества сырья «вероники трава» 131
5.1 Разработка характеристик подлинности сырья «Вероники трава» 131
5.1.1 Исследование морфологических признаков сырья «Вероники трава» 131
5.1.2 Характеристика микродиагностических признаков сырья «Вероники трава» 134
5.2 Числовые показатели 154
5.2.1 Определение влажности 154
5.2.2 Определение золы 154
5.2.3 Определение экстрактивных веществ 154
5.3 Разработка методик количественного определения основных групп действующих веществ растений рода Вероника 155
5.3.1 Количественное определение суммы флавоноидов в растениях рода Вероника 156
5.3.1.1 Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве вероники простертой 156
5.3.1.1.1 Изучение условий спектрофотометрического определения суммы флавоноидов 157
5.3.1.2 Методика количественного определения суммы флавоноидов 161
5.3.1.3 Содержание суммы флавоноидов в траве вероники простертой, вероники длинолистной, вероники дубравной, вероники широколистной, вероники колосистой 163
5.3.2 Количественное определение иридоидов в растениях рода Вероника 166
5.3.2.1 Разработка методики количественного определение иридоидов в растениях рода Вероника 166
5.3.2.2 Методика количественного определения иридоидов 171
5.3.2.3 Содержание иридоидов в траве вероники простертой, вероники длиннолистной, вероники дубравной, вероники широколистной, вероники колосистой 172
Глава 6 Изучение фармакологической активности растений рода вероника 179
6.1 Изучение острой токсичности 179
6.2 Изучение отхаркивающего действия 181
6.3 Изучение противовоспалительной активности 182
6.3.1 Влияние на процессы экссудации 182
6.3.2 Влияние на пролиферацию 184
6.3.3 Влияние на проницаемость капилляров у кроликов 185
6.4 Изучение анальгезирующего действия 188
6.4.1 Изучение анальгезирующего действия на модели «горячая пластинка» 188
6.4.2 Изучение анальгезирующего действия на модели «корчей» 189
6.5 Изучение диуретической активности 190
6.6 Изучение антиаритмической активности на хлорид кальциевой модели 191
6.7 Изучение антимикробной активности 193
Выводы 200
Литература
- Применение растений рода вероники в медицине
- Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями
- Азотсодержащие соединения
- Исследование качественного состава полисахаридных комплексов методом хроматографии на бумаге
Применение растений рода вероники в медицине
Растения рода вероника характеризуются многообразием химического состава (Приложение 1).
Наибольшее число исследований посвящено изучению фенольных соединений и иридоидов, содержащихся в растениях данного рода. Среди фенольных соединений наиболее изучены флавоноидные соединения. При проведении фитохимического анализа надземных органов вероники длиннолистной, заготовленной в период цветения в Аксу - Джабалдынском заповеднике Казахстана, качественными реакциями было установлено наличие флавоноидных соединений (реакция с магневой стружкой и концентрированной соляной кислотой), антоцианов (изменения окраски извлечения в зависимости от рН среды). Количественный анализ флавоноидов показал, что их содержание в траве вероники длиннолистной составляет 2,2 %. Хроматографированием на бумаге спиртового извлечения вероники длиннолистной в системе растворителей н-бутанол - уксусная кислота — вода (в соотношении 4:1:5) выявлено наличие шести веществ флавоноидной природы с Rf: 0,07; 0,14; 0,20; 0,24; 0,37; 0,45 (проявитель 1% спиртовой раствор хлорида алюминия), наличие четырех антоциановых соединений с Rf: 0,1; 0,15; 0,19; 0,24 [82].
Наличие антоцианов установлено также в цветках вероники длиннолистной и вероники дубравной [104].
Н.Ф. Гусевым, СВ. Тесловым, Н.М. Гусевой были исследованы некоторые растения рода Veronica L., произрастающие в Кунгурской - Красноуфимской лесостепи Предуралья, на содержание флавоноидов методом двумерной хроматографии на бумаге. В результате в траве изучаемых вероник было обнаружено различное количество флавоноидов: в веронике длиннолистной -13, в веронике дубравной - 10, в веронике колосистой - 15, в веронике широколистной - 9. В верониках длиннолистной, колоситой, дубравной методом хроматографии на бумаге был идентифицирован апигенин [38].
При исследовании метанольного экстракта травы вероники колосистой методом адсорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте было выделено в индивидуальном состоянии четыре соединения флавоноидной природы. По окраске пятен на хроматограммах и результатам качественных реакций (проба по Брианту) установили, что выделенные вещества относятся к производным флавона, два из которых гликозидного характера, а два -агликона. На основе хроматографического и спектральных исследований выделеные вещества были охарактеризована как: гликозиды - цинарозид (лютеолин-7-0-Р-Б-глюкозид) и его агликон - лютеолин {5,1,ъ - тетр-оксифлавон), апигенин-7 Р-0-глюкуронид, и его агликон - апигенин (5,7,4 -триоксифлавон) и агликоны — лютеолин и апигенин [126].
При исследовании влияния техногенного загрязнения на территории газоперерабатывающего комплекса и в его окрестностей на содержание фенольных соединений в траве вероники колосистой воздушно - сухое и измельченное сырье обрабатывали хлороформом. Экстракцию флавоноидов проводили в трехкратной повторности этанолом 96%, 60% и 30%. Определение наличия индивидуальных флавоноидов и их количества в веронике колосистой, произрастающей в зоне влияния выбросов ОГПЗ и на контрольной территории, проводили методом двумерной хроматографии на бумаге в системе растворителей: н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), а затем в системе: уксусная кислота-вода (15:85). Хроматограммы высушивали и просматривали в УФ- свете и парах аммиака, а также проявляли 1% спиртовым раствором хлорида алюминия. Количественное определение флавоноидов проводили фотоколориметрическим методом на КФК-56П. Количество флавоноидов рассчитывали по калибровочному графику, построенному по цинарозиду. В результате исследования в траве вероники колосистой, произрастающей в условиях промышленного воздействия было обнаружено от 4 до 6 флавоноидов, от 7 до 9 фенолкарбоновых кислот. Содержание суммы флавоноидов в биомассе растений, произрастающих в зоне действия атмосферных выбросов ОГПЗ, превышает количество флавоноидов в биомассе растений контрольных участков [90].
Продолжая исследования вероники колосистой, В.И. Фролова и С.Ф. Джумырко выделили ряд других флавоноидных соединений из растения, произрастающего на Северном Кавказе. Свежесобранную траву вероники колосистой, последовательно экстрагировали этанолом, ацетоном (на холоду) и водными (50%-ным) этанолом и ацетоном при нагревании. При сгущении экстрактов получили зеленовато-желтого цвета осадки, которые после предварительной очистки петролейным эфиром, диэтиловым эфиром, хлороформом и водой последовательно, кристаллизовали из смеси спирт-ацетон-вода (5:4:1). Полученные очищенные суммы флавоноидов делили на колонке с полиамидным сорбентом, используя для элюации смесь хлороформ — метиловый спирт в соотношениях (9,5:0,5; 9:1; 8:2; 5:5; 2:7). В результате было выделено три индивидуальных вещества. По результатам сравнения физико-химических показателей с данными литературы выделенные вещества охарактеризовали как 4 - метоксискутелляреин-7-0-В-глюкозид, 6-оксилютеолин-7-0-Б-глюкозид, б-оксилютеолин-7-О-диглюкозид.
В спиртовых экстрактах надземной части вероники длиннолистной, вероники дубравной, вероники широколистной, ими же, методом хроматографии на бумаге были идентифицированы флавоноидные соединения: 4/- метоксискутелляреин-7-0-Б-глюкозид, 6-оксилютеолин-7-0-0-глюкозид, 6-оксилютеолин-7-О-диглюкозид, космосиин и цинарозид [129].
Флавоноидные соединения локализуются в различных органах растений рода вероника. Они найдены в цветках и листьях вероники колосистой. Листья вероники колосистой и вероники длиннолистной содержат гликозиды лютеолина и 6-гидроксилютеолина. В листьях вероники дубравной обнаружены соединения флавоноидной природы, такие как 7-глюкуронид лютеолина и 7-дигликозид лютеолина, 7-глюкуронид апегинина, 7-глюкуронид хризоэриола, гликозиды 6-гидроксилютеолина и акацетина [ 104].
В литературе имеются сведения о наличии в растениях рода вероника и других групп фенольных соединений. Так качественными реакциями в траве вероники длиннолистной было установлено наличие дубильных веществ [82]. Дубильные вещества были обнаружены и в траве вероники широколистной, их содержание составляет 4%, а также в траве вероники колосистой и вероники дубравной [104]. Среди фенольных соединений в растениях рода вероника встречаются и кумарины. Их наличие установлено в траве вероники длиннолистной, вероники дубравной и вероники широколистной [82,104]. Для растений рода вероника характерно и наличие фенолкарбоновых кислот. При проведении сравнительного исследования химического состава травы вероник на содержание фенолкарбоновых кислот, методом хроматографии на бумаге установлено, что они имеют близкий качественный состав фенолкарбоновых кислот. Так, у вероники длиннолистной, вероники колосистой и у вероники дубравной обнаружено по 8 веществ, а у вероники широколистной 7 веществ относящихся к фенолкарбоновым кислотам, две из которых были идентифицированы как кофейная и хлорогеновая кислоты. Кроме того, во всех видах вероник обнаружены неохлорогеновая и феруловая кислоты. Последняя отсутствует в веронике широколистной. В веронике дубравной и веронике широколистной обнаружена шикимовая кислота, а в верониках колосистой и длиннолистной - хинная кислота [34].
В растениях рода вероника, идентифицированы также: п-кумаровая, протокатеховая, изованилиновая, ванилиновая, п-гидроксибензойная, изоферуловая, сиреневая, вератровая, изохлорогеновая кислоты [104].
Наибольшее содержание свободных полифенолов отмечено в траве вероники колосистой (3,26%), а наименьшее в веронике дубравной и веронике широколистной (до 1,5%) [34].
Другим не менее важным классом БАВ растений рода вероника являются иридоиды. Исследование спиртовых экстрактов травы вероник на наличие иридоидных соединений методом хроматографии на бумаге установлено различное их количество в видах вероник: в веронике дубравной — 2, в веронике широколистной - 3, в веронике длиннолистной — 4, в веронике колосистой - 5 веществ иридоидной природы. Во всех исследуемых видах обнаружен и идентифицирован аукубин. Максимальное количество суммы иридоидов (в пересчете на аукубин) отмечено в траве вероники колосистой (до 0,66%), а минимальное - в веронике широколистной и веронике дубравной (до 0,4%) [34].
В литературе имеются данные о нахождении других соединений иридоидной природы в растениях рода вероника. Так, в траве вероники длиннолистной, широколистной, дубравной, простертой отмечено наличие каталпола и изокаталпола. Эти соединения обнаружены и в вероники колосистой: стебель, лист, корень содержит каталпол, а трава - изокаталпол. Наряду с указанными соединениями в траве вероники длиннолистной, вероники простертой и вероники колосистой был обнаружен ацетат метилкаталпола, а ацетат каталпола — в траве вероники простертой и вероники колосистой; метилкаталпол идентифицирован в траве вероники простертой и вероники длиннолистной
Приготовление спирто-водных извлечений и фракционирование природных соединений органическими растворителями
Для доказательства строения фенольных соединений использовали химические методы: кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз, щелочное расщепление, ацетилирование, метилирование и др. [144, 145, 150, 151].
Кислотный гидролиз проводили в мягких и жестких условиях. Для обнаружения качественного состава гликозида проводили жесткий кислотный гидролиз следующим образом: 0,01 - 0,02 г исследуемого гликозида растворяли в 10 — 20 мл 10%-й хлористоводородной кислоты в 50%-м растворе уксусной кислоты и нагревали на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 2-4 часов. Динамику гидролитического расщепления контролировали хроматографией на бумаге в 15%-й уксусной кислоте. По окончании гидролиза реакционную смесь обрабатывали в делительной воронке диэтиловым эфиром (5 раз по 5 мл). Эфирное извлечение сушили над безводным натрия сульфатом, упаривали до сухого остатка и кристаллизовали из этилового спирта.
Фильтраты после отделения агликонов упаривали досуха, растворяли в 70%-м этиловом спирте и анализировали методом хроматографии на бумаге в системе н-бутанол-пиридин-вода (6:4:3). Для обнаружения Сахаров использовали анилингидрофталатный реактив с последующим высушиванием хроматограмм при 105С в течение 5 минут [133, 134]. Для определения порядка присоединения Сахаров к агликону проводили кислотный гидролиз в мягких условиях. Для этой цели 0,01 - 0,02 г гликозида смешивали с 10 - 20 мл 0,05% хлористоводородной кислоты и нагревали в колбе с обратным холодильником в течение 1,5 - 2,0 часов с отбором проб через 5, 10, 20, 30, 45, 60, 90 и 120 минут с последующим хроматографированием продуктов кислотного гидролиза.
Щелочной гидролиз: 0,01 - 0,03г исследуемого гликозида растворяли в 10мл 0,5%-ного водного раствора калия гидроокиси и нагревали в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 3 часов. Пробы для анализа отбирали через 5, 10, 20, 30, 60 и 120 мин, нейтрализовали и хроматографировали в ряде подходящих систем растворителей (15%-я и 30%-я уксусная кислота). При щелочном гидролизе не расщепляются 3 - биозид и 7-биозиды с 1-2 порядком связи между сахарами [77].
Ферментативный гидролиз проводили энзимами желудочного сока виноградной улитки. Для этого 0,01 - 0,02 г исследуемого гликозида растворяли в 10 мл дистиллированной воды, добавляли равное количество энзимов виноградной улитки и инкубировали при 38 - 40С в течение суток, периодически отбирая пробы для анализа. После достижения полноты гидролиза смесь разбавляли 2-3 объемами этилового спирта и кипятили на водяной бане 20-30 минут для денатурации белка энзима. Реакционную смесь трижды обрабатывали равным объемом диэтилового эфира, эфирные извлечения объединяли, упаривали досуха, остатки растворяли в 5 мл этилового спирта, добавляли по каплям воду до появления опалесценции, раствор подогревали и оставляли для кристаллизации. Получали кристаллические агликоны. Водные растворы упаривали до 5 мл, добавляли небольшими порциями при перемешивании 30 мл 96%-го этилового спирта и подогревали на водяной бане при 70 - 80С. Выделившиеся осадки отделяли, а фильтраты упаривали в вакууме досуха. Остатки растворяли в 0,25 - 0,5 мл метилового спирта и идентифицировали углеводную часть [141, 150]. Для определения порядка присоединения Сахаров в гликозиде проводили ферментативный гидролиз рамнодиастазой. Для этого 0,01 - 0,02 г исследуемого гликозида растворяли в 10 мл дистиллированной воды, добавляли равное количество рамнодиастазы и инкубировали при 38-40 С в течение суток, периодически отбирая пробы для анализа. После достижения полноты гидролиза смесь разбавляли 2-3 объемами этилового спирта и кипятили на водяной бане 20-30 минут для денатурации белка энзима. Реакционную смесь трижды обрабатывали равным объемом диэтилового эфира. Эфирные извлечения объединяли, упаривали досуха, остатки растворяли в 4 мл этилового спирта, добавляли по каплям дистиллированную воду до появления опалесценции. Раствор подогревали и оставляли для кристаллизации. Получали кристаллический агликон. Водные фильтраты упаривали до 5 мл, добавляли небольшое количество порциями при перемешивании 30 мл 96%-го этилового спирта и нагревали на водяной бане при температуре 70-80 С. Выделившиеся осадки отделяли, а фильтраты упаривали в вакууме досуха. Остаток растворяли в 0,25-0,5 мл метилового спирта и идентифицировали углеводную часть [144, 145].
Щелочное расщепление является одним из классических методов идентификации флавоноидов с выделением фенолов и оксибензойных кислот.
Щелочное расщепление проводили в расплаве щелочи при температуре 180 - 250С при нагревании на масляной или песчаной бане в течение 5-10 минут. Затем реакционную смесь охлаждали, нейтрализовали хлористоводородной кислотой до рН 8,0 и фенольные соединения экстрагировали эфиром (5 раз по 5 мл). После подкисления до рН 2,0-3,0 в аналогичных условиях экстрагировали оксибензойные кислоты [144]. Из флавоноидов, незамещенных по С-6 и С-8, получают фракцию фенолов, содержащую флороглюцин, а из кислотной фракции из 6-замещенных флавоноидов - п-оксибензойную, протокатеховую и др. кислоты. Эти соединения выделяли возгонкой или хроматографией с последующей идентификацией по основным физико-химическим свойствам [144].
Ацетилирование дает возможность определить количество оксигрупп в агликонах, а также судить об их реакционной способности в зависимости от положения [6]. Физико-химические свойства ацетильных производных используют для идентификации отдельных соединений и различия между некоторыми классами флавоноидов. Ацетилирование проводят со свежеперегнанным уксусным ангидридом в присутствии кислых или основных катализаторов: конц. серная кислота, пиридин или натрия ацетат при различных условиях [86].
Ацетилирование проводили следующим образом: 0,020 — 0,025 г исследуемого соединения растворяли в 2 мл уксусного ангидрида и прибавляли 1 каплю концентрированной серной кислоты. Через 3 минуты раствор вливали в 20 мл холодной воды и оставили на ночь. Выделившиеся осадки отделяли, промывали водой, кристаллизовали из этилового спирта и исследовали полученные продукты [6].
Метилирование используют для получения производных с четкими температурами плавления и для определения места присоединения углеводного компонента [7].
Метилирование чаще всего проводят при помощи диметилсульфата в среде ацетона в присутствии калия карбоната, реже метилом йодистым. 0,01 - 0,02 г исследуемого флавоноида растворяли в 10 мл безводного ацетона, к раствору прибавили 0,3 г свежепрокаленного калия карбоната и 0,2 мл свежеперегнанного диметилсульфата. Реакционную смесь при перемешивании нагревали в колбе с обратным холодильником на водяной бане 16-18 часов. После исчерпывающего метилирования (контроль - хроматография на бумаге) реакционную смесь подкисляли серной кислотой до рН 4 - 5 и фильтровали. Фильтрат упарили досуха, остаток растворили в водном ацетоне и оставили на сутки при температуре +4С. Выпавшие игольчатые кристаллы перекристаллизовывали из водного этилового спирта. Для определения места присоединения углеводного компонента метилированный продукт вновь растворяли в небольшом количестве ацетона и гидролизовали 10 мл 2%-й хлористоводородной кислоты на кипящей водяной бане. Выпавшие кристаллы сушили и исследовали полученный продукт.
Лактонизация. Нагревание с ледяной уксусной кислотой проводят при установлении структуры хлорогеновой кислоты. 0,03 г исследуемого вещества растворяли в 5 мл ледяной уксусной кислоты и нагревали в колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течении б часов. Раствор упарили в вакууме до 1 мл и оставили в холодильнике при 4С для кристаллизации. Образование лактона (кофеилхинидина) не наблюдалось, что свидетельствует о замещении оксигруппы в положении С-5 D-хинной кислоты. Проведенная обработка D-хинной кислоты в аналогичных условиях приводит к получению хинидина с т.пл. 212 - 214С [43].
Азотсодержащие соединения
Количественное определение функциональных групп пектиновых веществ (свободных карбоксильных, метоксилированных карбоксильных), общее количество карбоксильных, а также содержание метоксильных групп проводили титрометрическим методом [47].
Для определения свободных карбоксильных групп (Кс) в исследуемых образцах около 1,0 г (точные навески) пектиновых веществ помещали в конические колбы емкостью 300 мл, смачивали чистым 96%-м этанолом (во избежание комкования), добавляли 100 мл дистиллированной воды, перемешивали и оставляли на ночь для полного растворения пектинов. Затем смеси титровали раствором гидроксида натрия (0,1 моль/л) до появления не исчезающего в течение минуты красного окрашивания при добавлении 6 капель индикатора Хинтона (водные 0,4% растворы фенолового красного, бромтимолового синего, крезолового красного и дистиллированной воды в соотношении 3:1:1:1).
Для определения метоксилированных карбоксильных групп (Км) к этим же пробам после определения содержания свободных карбоксильных групп добавляли точно отмеренные 10 мл раствора гидроксида натрия (0,5 моль/л), закрывали колбы и оставляли на 2 часа при комнатной температуре для омыления метоксилированных карбоксильных групп. Затем в колбы вносили точно отмеренные 10 мл раствора кислоты хлористоводородной (0,5 моль/л) и избыток кислоты оттитровывали раствором гидроксида натрия (0,1 моль/л).
Влажность, общую золу, золу нерастворимую в 10 % хлористоводородной кислоте, экстрактивные вещества определяли согласно методике ГФ XI издания [29]. В качестве растворителей при определении экстрактивных веществ использовали воду дистиллированную, этиловый спирт различных концентраций (96%, 70%, 50%, 30%).
Морфолого-анатомические исследования Исследование проводили на свежем и гербарном материале, собранном в Курской области в период массового цветения растения в течении 2003-2004 года. Изучение анатомических признаков сырья «Вероники трава» проводили общепринятыми методами ГФ XI издания [29].
Для получения микрофотографий использовался лабораторный микроскоп «Биолам С-11» с цифровой насадкой. Фотографии были обработаны на компьютере с помощью программ Adobe Photoshop 7.0.
Методы токсико-фармакологических исследований Экспериментальная работа выполнена на животных четырех видов: беспородных белых крысах (180,0-220,0 г), беспородных белых мышах (18,0-20,0г), кроликах породы Шиншилла (массой 3,0-3,5 кг), лягушках.
Эксперименты проводили в соответствии с установленными документами "Об утверждении правил лабораторной практики" (МЗ РФ, приказ № 267 от 19 июня 2003 г.), Good Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies (FDA, 21 CFR Part 58, 22.12.1978), OECD Principles on Good Laboratory Practice (OECD, ENV/MC/ CHEM (98) 17, 1977)
Для определения острой токсичности использовали методику Штабского Б.М. [137]. Исследования проводили на беспородных белых мышах обоего пола, массой 18,0-20,0 г. Настои травы вероники простертой, вероники дубравной, вероники длиннолистной, вероники широколистной, вероники колосистой готовили в соотношении 1:10, вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 1 г/кг до 5 г/кг (в пересчете на сухое сырье) в объемах от 0,2 до 1 мл. Полисахаридные комплексы, полученные из исследуемых вероник, вводили в дозах от 100 мг/кг до 300 мг/кг, растворенные в дистиллированной воде. После введения изучаемых веществ каждую группу животных (не менее 6 животных) помещали в изолированную клетку при стандартном температурном и пищевом режиме и вели наблюдение в течение 24 часов [107].
Для исследования отхаркивающего действия использовали модель изучения моторной функции мерцательного эпителия пищевода лягушки по методике В.В. Гацура [23].
Оценку отхаркивающего действия проводили по следующему тесту. Лягушку фиксировали на корковой пластинке брюшком вверх. На кончик языка наносили исследуемый раствор в количестве 0,1 мл. Для регистрации движения ресничек использовали шелковую нить размером 15 мм, которую по истечении 30 секунд после нанесения исследуемых препаратов помещали у основания языка. По секундомеру замечали время, в течении которого заглатывалась нить. Регистрировали время, затраченное на перемещение нитки на 10 мм без препарата (контроль) и после нанесения исследуемого препарата.
Учитывая значительный разброс исходных скоростей движения мерцательного эпителия от одного животного к другому, нами предложен расчет коэффициента ускорения (КУ), как отношения скорости, полученной после аппликации исследуемого препарата к исходной. Уменьшение данного коэффициента говорит о повышении двигательной активности мерцательного эпителия [31].
Эффективность отхаркивающего действия сравнивали с препаратом заводского производства - Мукалтином.
Настои и отвары из исследуемых видов вероник готовили в соотношении 1:10. Из полисахаридных комплексов и Мукалтина готовили 1%-ные водные растворы. Эксперименты проведены на осенних лягушках Rana Temporarea. 2.7.3 Изучение противовоспалительной активности
Оценку противовоспалительного действия изучаемых водных извлечений и полисахаридных комплексов проводили в соответствии с методическими рекомендациями по исследованию противовоспалительных препаратов [85, 107] влияющих на разные стадии процесса воспаления.
Влияние на процессы экссудации Антиэкссудативные свойства оценивали на модели острого воспалительного отека, вызванного субплантарным введением в заднюю лапу мыши 0,05 мл 2,5% водного раствора формалина [107].
В опыт брались мыши массой 18-20 г. Животных подбирали строго одного веса. В опыт брали две группы мышей. Одной из них за 2 часа до введения формалина, а затем через 5 часов и 18 часов после него вводили внутрижелудочно различные препараты изучаемых растений. Настои готовили в соотношении 1:10 и вводили в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье) массы тела (в объеме 0,2 мл на 20 г массы животного), полисахаридные комплексы вводили в дозах 100 мг/кг (в объеме раствора 0,2 мл на 20 г массы животного). Мышам второй группы в те же сроки применяли воду очищенную. Воспаление вызывали путем впрыскивания в толщу бедра одной из задних лапок 0,05 мл 2,5% раствора формалина. Через 24 часа после введения формалина мышей забивали и у них отрезали воспаленные и невоспаленные задние лапки на уровне тазобедренного сустава. О выраженности воспалительного отека судили по приросту веса воспаленных лапок, который определяли по разнице в весе между воспаленными и невоспаленными лапками; о противовоспалительном действии изучаемых препаратов - по разнице между величиной отека лапы, вызванного формалином у контрольных животных и мышей, получавших изучаемые препараты. Препарат сравнения (ацетилсалициловую кислоту) вводили в аналогичных условиях в дозе 300 мг/кг. 2.7.3.2 Влияние на пролиферацию
Антипролиферативные свойства исследуемых препаратов изучали на модели "ватной гранулемы" у беспородных белых крыс массой 180-220 г [107].
У крыс, находящихся под легким эфирным наркозом в области спины тщательно выстригали шерсть и в асептических условиях делали разрез кожи и подкожной клетчатки длиной 1-2 см. Затем пинцетом через образовавшийся разрез кожи в подкожной клетчатке формировали полость, куда помещали предварительно простерилизованный ватный шарик массой 25 мг, после чего накладывали 1-2 шва. Через 7 дней, на протяжении которых вводили исследуемые препараты настои в соотношении 1:10 в дозе 1 г/кг массы тела (в пересчете на сухое сырье - 1 мл) и суммы полисахаридов в дозах 100 мг/кг массы животного, имплантированный шарик с образовавшейся .вокруг него грануляционной тканью извлекали и высушивали до постоянной массы при t 55-60С. Массу образовавшейся грануляционно-фиброзной ткани определяли по разнице между массами высушенной гранулы и имплантированного ватного шарика. Препарат сравнения (индометацин) и дистиллированную воду (контроль) вводили в аналогичных условиях.
Антифлогистическую активность указанных лекарственных форм (настоев в дозе 1 г/кг (в пересчете на сухое сырье), полисахаридных комплексов в дозах 100 мг/кг) определяли при моделировании локальной воспалительной реакции с помощью ксилола [91] на кроликах-альбиносах массой 3,0-3,5 кг.
У кроликов предварительно выстригали шерсть на коже живота (участок 13 см). Препараты вводились внутримышечно за час до введения индикатора проницаемости, роль которого выполнял раствор трипановой сини. Трипановую синь вводили в краевую вену уха в виде 1%-ного раствора на 0,9%-ном растворе натрия хлорида из расчета 2 мл на 1 кг массы животного.
Исследование качественного состава полисахаридных комплексов методом хроматографии на бумаге
В ИК-спектре вещества 3.16 отмечаются полосы поглощения при 3430 см" (оксигруппы), 1660 см"1 (карбонильная группа у-пирона), 1600-1450 см 1 (колебания ароматических колец), 1110-1040 см"1 (характерная для С-гликозидов) [13, 14, 57, 88, 113].
По молекулярной массе (табл.13), количественному соотношению агликона (61,3) и углеводного компонента, а также соотношению интенсивностей поглощения максимумов длинноволновой полосы в УФ -спектрах гликозида и агликона (60%) установили, что исследуемое вещество может быть отнесено к моногликозидам [75, 76, 86].
В продуктах кислотного гидролиза (10% соляная кислота в 50% уксусной кислоте, 2 часа) идентифицировали с достоверными образцами лютеолин (вещество 3.11) и D - глюкозу.
В УФ-спектре вещества 3.11 имеются максимумы поглощения при X = 255 нм, 266 нм, 350 нм. По данным спектральных исследований в УФ-области с применением комплексообразующих и ионизирующих реактивов и качественных реакций вещество 3.16 имеет незаменимые окси-группы в 5, З1, 41 - положениях [13, 14, 58].
Спектральными исследованиями в УФ-области (табл. 18) установили, что углеводный компонент находится у С-7 (на основании отсутствия батохромного сдвига с натрия ацетатом [76].
Спектральные исследования в ИК - области методом дифференциального анализа подтвердили пиранозную форму сахарам, что характеризуется наличием трех полос поглощения в области 1100-1010 см"1, а (3-гликозидная связь о пиранозидов - полосой при частоте 890 см"1 [13, 14, 58]. Кроме того, конфигурация связи подтверждается расщеплением, моногликозида ферментным препаратом Aspergillus [86]. Таким образом, в результате проведенных исследований вещество 3.16 охарактеризовано как лютеолин-7-0-(3-В-глюкопиранозид или цинарозид [55].
Вещество 3.18 - бледно-желтые кристаллы, полученные из этилового спирта, т.пл. 188-190 С. Имеет бурое окрашивание на хроматограмме в УФ-свете, после проявления раствором циркония хлорокиси окраска переходит в желтую, при действии паров аммиака оранжевеет (табл. 13). Дает положительную цианидиновую реакцию по Брианту и образующиеся при этом красные пигменты не переходят в слой октанола, что позволяет отнести выделенное соединение к флавоноидным гликозидам. Жидкость Фелинга восстанавливается только после предварительного гидролиза, что свидетельствует о гликозидной природе исследуемого соединения [24].
В ИК-спектре вещества 3.18 обнаруживаются полосы поглощения при 3450 см"1 (оксигруппы), 1660 см"1 (карбонильная группа у-пирола), 1600-1450 см 1 (валентные колебания двойных связей бензольных колец) [24].
Вещество 3.18 по данным молекулярной массы, суммарной формуле, содержанию доли агликона (40%) характеризуется как соединение, содержащее 2 углеводных остатка и агликон. При полном кислотном гидролизе (10% соляная кислота в 50% уксусной кислоте, 2 часа) в гидролизате обнаружили сахара D-глюкозу и L-рамнозу и агликон. Спектральными исследованиями в УФ-области установлено, что углеводные компоненты у вещества 3.18 находятся у С-3 (батохромный сдвиг, вызванный циркония хлорокисью исчезал при добавлении лимонной кислоты), а также выявлены свободные гидроксильные группы находятся у С-7, С-5, С-4 , С-3 . Батохромный сдвиг максимума длинноволновой полосы на 50 нм под ионизирующем влиянием натрия гидроксида указывает на присутствие свободной оксигруппы у С-4 . С борной кислотой и натрия ацетатом происходит батохромный сдвиг длинноволновой полосы на 30 нм, что характеризует наличие 3 ,4 диоксигруппировок. Оксигруппы у С-7 обнаруживаются по батохромному сдвигу максимума длинноволновой полосы на 35 нм в присутствии натрия ацетата. Наличие оксигрупп также подтвердили качественными реакциями. Вещество 3.18 при взаимодействии с раствором циркония хлорокиси дает интенсивную желтую флуоресценцию [24], которая исчезала при добавлении метанольного раствора лимонной кислоты. Эта реакция позволяет обнаружить оксигруппу у С-5.
Положительная цирконил-лимонная проба с агликоном вещества 3.18 позволила определить наличие свободного гидроксила у С-3 [147].
В дифференциальном ИК-спектре вещества наблюдается три полосы поглощения в области 1100-1010 см", что подтверждает пиранозную форму Сахаров, а полоса при 890 см"1 указывает на [3-гликозидную связь пиранозидов [58,113].
С целью определения последовательности присоединения моносахаридов в веществе 3.18 провели мягкий ступенчатый гидролиз 0,5% хлористоводородной кислотой в 50% этиловом спирте с отбором проб и хроматографированием продуктов гидролиза.
В продуктах реакции промежуточного гликозида не обнаружили, а нашли вещество 3.10 и рутинозу. Таким образом, непосредственно с агликоном связана D-глюкоза, L-рамноза является терминальным сахаром.
Выделенный агликон (вещество 3.10) в Уф-свете имеет максимумы поглощения при 375 нм, 270 нм, 255 нм. Под действием натрия ацетата наблюдается батохромный сдвиг на 15 нм, что свидетельствует о свободной оксигруппе у С-7. Положительная реакция с диазотированной сульфаниловой кислотой также подтверждает наличие незамещенной оксигруппы у С-7. В присутствии циркония хлорокиси батохромный сдвиг I полосы достигает 90 нм, уменьшающейся на 40 нм при добавлении лимонной кислоты, что характерно для флавоноидов с оксигруппами у С-7, С-5 и С-3 соответственно. 119 С натрия гидроокисью в Уф-спектре наблюдается батохромный сдвиг I полосы на 45 нм, что характеризует наличие 3 ,4 -диоксигруппировки. С борной кислотой и натрия ацетатом происходит батохромный сдвиг длинноволновой полосы на 25 нм, что связано с образованием комплекса по С-3 и С-4 оксигруппам [76]. Следовательно можно предположить, что в агликоне оксигруппы находятся у С-3, С-5, С-7, С-3 , С-4 . Таким образом агликон (вещество 3.10) охарактеризовали как 3,5,7,3 ,4 пентаоксифлавон или кверцетин [55].
Вещество 3.18 гидролизуется рамнодиастазой, которая как известно отщепляет биозиды только в гликозидах с 1-6 порядком связи. Это дало нам основание отнести соединение 3.18 к биозидам с подобным сочленением моносахаров. Анализ молекулярных вращений выявил пиранозный окисный цикл глюкозы и рамнозы.
Таким образом, на основании проведенных исследований и полученных результатов вещество 3.18 охарактеризовали как кверцетин-3-O-P-D-глюкопиранозо-(1- 6)-0-сс-Ь-рамнопиранозид (рутин) [55].
Вещество 5.19 - светло-желтые кристаллы, полученные из этилового спирта, т.пл. 232-234С. Имеет темное окрашивание в УФ-свете на хроматограмме, после проявления раствором циркония хлорокиси окраска переходит в желтую, при действии парами аммиака зеленеет (табл. 13). Дает положительную цианидиновую реакцию и образующиеся при этом красные пигменты не переходят в слой октанола. Жидкость Фелинга восстанавливается только после предварительного гидролиза по Киллиани, что позволяет отнести соединение к флавоноидам гликозидной природы [24, 141].
В ИК-спектре вещества 3.19 отмечаются полосы поглощения в области 3450-3520 см"1 (фенольные оксигруппы), 1650 см"1 (карбонильная группа у-пирона), 1610, 1560, 1510 см"1 (колебания ароматических колец), 1110-1040 см"1 (характерная для С-гликозидов) [13, 14, 58, 88, 113].
В УФ - спектре вещества 3.19 имеются максимумы поглощения при X = 270 и 335 нм. По данным спектрального исследования в УФ - области с применением комплексообразующих и ионизирующих реактивов и качественных реакций вещество 3.19 имеет незамещенные оксигруппы в 5,7,4 -положениях (табл. 18) [75, 76, 86].
По молекулярной массе (табл. 13), суммарной формуле, количественному соотношению агликона (40,2%) и углеводного компонента, а также соотношению интенсивностей поглощения максимумов длинноволновой полосы в УФ - спектрах гликозида и агликона (40%) установили, что вещество может быть отнесено к дигликозидам [75, 76, 86].
Проведенные исследования дали возможность предположить, что выделенное соединение может быть С-гликозидом 5,7,4 -триоксифлавона. Это подтверждается также при кислотном гидролизе в мягких условиях 10%-й соляной кислотой в 50%-м этаноле в течение 5 часов. Результаты гидролиза контролировали через каждые 30 минут. По истечении указанного промежутка времени в гидролизате качественными реакциями и хроматографией на бумаге не было обнаружено агликонов и углеводных остатков. Для проверки предположенных являются ли эти вещества продуктами расщепления или изомерами, мы выделили эти соединения с помощью препаративной хроматографии на бумаге и подвергли их повторному гидролизу в тех же условиях. При этом из каждого из них получены те же 4 изомера, что и из исходного гликозида (рис. 18).
При проведении ферментативного гидролиза рамнодиастазой, ферментом виноградной улитки и гриба Aspergillus orizae обнаружили исходное вещество, т.е. вещество не расщепляется.
После гидролиза по Киллиани в продуктах гидролиза хроматографией на бумаге с достоверными образцами в различных растворителях обнаружили агликон апигенин (вещество 3.12) и D-глюкозу с небольшой примесью арабинозы.
