Введение к работе
Актуальность пройдет.
Развитие современных методов диагностики различных нарушений
свертывающей и фябришлитической системы крови, которые часто сопро
вождают различные заболевания (например, раковые), или сами являются
причиной заболэваний (например, гемофилии), невозможно без очищенных
белковых факторов гемостаза, таких например, как тромбин, тромбопла-
стин, плазманоген, шгазмин, урокиназа. В последнее время значительно
возрос интерес к методам прямого определения белковых факторов, при
нимающих участие во-первых, в тромбообразовании (протромбин, тром
бин, т.наз. белки РГУКА - бедки, синтезированные в присутствии анти
витаминов К, антлтромбия Ш. фибриноген и продукты его деградации) и,
во-вторых в растворении сгустков (плазманоген, его активаторы,
плазмин и его ингибиторы). Этот интерес вызван, с одной стороны.
широким применением разных корректирующих препаратов (прилюдные и
генго-инженарчые активаторы и ингибиторы свертывания и фибрзнолиза,
отдельные факторы свертывания), использование которых нево&можно без
постянной количественной оценки их уровня в плазме ила сыворотке
больного, а с другой стороны тем,, что именно зти методы дают воз
можность осуществлять быструю ж точную диагностику различных тромбо-
змболических осложнений, в частности, ііредавфарктшх состояний,
инфарктов, инсультов, легочных и других эмболии и т.п., которые на
сегодняшний день являются причиной значительного количества леталь
ных исходов. Кроме того. Чернобыльская катастрофа в Украине привела
к значительному росту различных заболеваний, особенно раковых (и
гематологических. ' .'
В основе методов функционального определения факторов свертывания или фибрияолиза лежат воспроизведение In vitro процесссз свертывания или фибриголиза, протекающих в плазме крови, при помощи очищенных белковых факторов CHareed J. et el. 1982, Віск ЕЛ., 1982]. При этом количественные различия в' протекании втих процессов с ис- , пользованием плазмы больного в сравнении с контролем (нормой), дает возмояаость выявить и количественно оценить те или друїде нарушения гемоствза. Для осуществления таких исследований в мировой практике используют, наряду с другими, очищенные препараты тромбина и тром-бопластина, которые являются ключевыми реактивами при -определении фибриногена, антитромбана Ш, протромбинового и тромбинового времени плазмы, белков PIVXA и т.п., а тэкяэ очещэзныэ препараты плазминоге-на, плазмина и урокияэзы, без которых практически невозможно определить такие показатели, как уровень плазмишгенз, активаторов и инга-
битеров фибринолиза. Однако, до начала ваша исследований (1982) отечественная промышленность нэ владела методами получения указанных препаратов, а сами препараты промышвяно-не изготовлялась. Очевидно, что для внедрения таких методов в практику, а также для создания новых функциональных методов анализа, необходимо, прежде всего, создать методы прэпаратЕвшго получения очищенных белковых препаратов, пригодные для применения в клинической диагностике, изучить полу:заняв препарата и проверить их. действие при диагностике различных нарушении в системе гемостаза.
Наиболее эффективными методами получения очищенных белковых препаратов крови являются различные хроматографаческяэ методы, базирующиеся на использовании производных целлюлозы, агарозн или синтетических органических полимеров. Неорганические полимеры (силохрсш, сгликагвлж, макропористое стекло) имеет достаточную порястисть и развитую поверхность, стойки к действию механических, химических . и биологических факторов, для них достаточно основательно разработаны, методы химической модификации поверхности СТшичкин Г.В. и др., 1986], однако, до начала наших исследовании (1982) вопрос о использовании их для очистки белковых факторов гемостаза в научной . литературе не ставился.
Хроматографаческое исследование таких сорбентов, модифицированных лигандаш разной специфичности, позволило бы выявить' новые возможности в фракционирования плазмы крови с целью получения очищенных белковых препаратов.
Указанные проблемы и определяют актуальность предпринятого исследования.
Щзль работы.'
Целью проведенных исследований было получение модифицированпых кремнеземных сорбентов для выделения некоторых белковых факторов гемостаза, а именно, тромбина, тромбопластина, плазмина, плазмияогена и урокиназы, и их хроматографичаское изучение.
Для достижения этой цели были" поставлены следующие задзчи: :
разработка способа модификации кремнеземных носителей с целью создания бяоспвцафачвских и гэль-фильтрационных сорбентов для получения очщенннх препаратов тромбина, тромбопластина, урокиназы, плазшногена и шшзмина.
выявление основных закономерностей сорбции и десорбции тромбина, тромбозластанЕ, урокиназы, алазминогена и плазмина. на . созданных сорбентах.
з
,- разработка методов .получения указанных белковых препаратов с
іспользованием созданных сорбентов из. утильного сырья (осадок фрак
ции Ш Кона донорской плазмы). .
изучение свойств полученных белковых препаратов и возможности їспользования их в клинической лабораторной практике.
разработке способа получения субстрата для определения фибри-згалитической активности на основе фибрина, модифицированного красителями. :
изучение основных физико-химических свойств, кинетических параметров гидролиза полученных модифицированных фибринов и возможности использования их в качестве субстратов для определения фибриноли-гической активности.
Научная новизна.
-
Впервые продемонстрирована возможность использования кодифицированных кремнеземных сорбентов для получения белков крови. Путем ковалентной модификации кремнеземных носителей впервые получен ряд новых биоспецифичных ссрбэнтов для выделения тромбина, плазминогена, шюзминэ та урокинага, содержащих в качестве биоспвцкфичных лигандов с-хлорбензильные и п-фенилборонатные группы, остатки Ъ-liys, Ь-Arg, гексаметшюндиамин, а такхэ антибиотики-полипептиды грамицидин С и баїщтрацин. Впервые разработан метод активации гидроксильных групп на поверхности модифицированного кремнезема при помощи тозилхлорида, позволявший проводить ковалентвув ишобилизацив биологически-активных соединений в "мягких" условиях (рН 7-8, комнатная.температура).
-
Изучена закономерность сорбции лротеилаз на иммобилизованных бацитрацинэ и грамицидине С. Впервые показано, что сорбция протеиназ на таких сорбентах полностью' определяется способом иммобилизации ли-ганда и зависит от рН.
-
Впервые установлено наличие в молекуле плазминогена центров специфического связывания с п-хлорбензильвымн и п-фенилборонатнымя группами, а также с бацятрацином и грамицидином С. Аффиино-хромато-графическим анализом Фрагментов плазминогена установлено размещение этих центров в молекуле плазминогенэ.
-
С использованием биоспецифическлх кремнеземных сорбентов создана технология препаративного получения тромбина, шгазманогеяя, плззмина и урокиназы. Для этого в качестве исходаого сырья использовали осадок фракции ШШ (Ш) Кона донорской плазмы и мочу человека.
-
Впервые осуществлен синтез кремнеземных сорбентов, содержащих на поверхности гидроксильиые группы, и проанализирована пригод-
ность таких сорбентов для гвль-фидьтраіщонцоа очистки тромбошізсти-на кадаверного мозга человека. Предложен метод оценки степени чистоты препаратов тромбопластша и разработана технология получения очищенных препаратов тромбопластша. /,
6. Впервые получены субстраты для. определения фибринолитичэсхой активности на основе фибрина, ковалентно и некояалентно модифицированного красителями, а также, п-даазабензодсульфакислотой (азск^яб-' рин), я осуществлено их сравнительное изучение.
?. С использованием азофибрина созданы новые методы определения фябршолнтгческой активности, плазминогена, активаторов и ингибиторов фибрииолиза. .
Практическая значимость работы.
Разработаны методы ковалентного закрепления на поверхности кремнеземов органических и природных соединении, что позволяет осуществлять целенаправленный синтез сорбентов для гель-фильтрации я ^специфической хроматографии. На основв полученных биоспецифических сорбентов создана технология препаративного получения очищенных препаратов тромбина и плазминогена (плазмина) из осадка фракции Л+Ш (Щ) Кона донорской плазмы и урокиназы из' мочи человека. Созданная технология позволяет получать препараты с высоким выходом по активности (60-80%) и высокой степени чистоты. На основе полученных' сорбентов для гель-фальтрации разработана технология препаративного получения очищенного препарата тромбошгастива из, кадаверного мозга человека. Изучены условия лиофильного высушивания и хранения препаратов.
Создана технология получения азофибрша путем козалентной мода-., факации фибрина (фракции I Кона) п-дпазобензолсулъфокислотоа» Разра-ч ботаны методы определения фябринолитической активности с использованием азофибрина. [ .. .'
Продемонстрована возможность использования в клинической' диагностике препаратов тромбина, тромбошіастинз, плазмина. урокиназы и азофибрша как в виде отдельных реактивов, так и в составе наборов для определения протроибинового и тромбинового временя' и времени . рекальцификзцаз, уровня белков PIVKA, антитромбина Ш, продуктов деградации фибрина/фибриногена, фибршолатической активности плазмы, плазминогена, активаторов . и ингибиторов фиоринолнза, урокиназяой активности мочи.
Серийный выпуск кремнеземных сорбентов - биоспецифических сор-
бентов, содержащих остатки Ir-Lys, L-Arg, бацитрацина и грамицидина С, сорбентов, активированных тозшюоридом и сорбентов для. гель-фяльтрацли налажен на совместном российско-австрийско-гермаяском. предприятии "БиоХймМак" (г.Москез, Россия). Серийный выпуск препаратов тромбина, тромбопластина, плазминогена, шіазмияа, урокиназы, азофибрина, а так- же наборов, в состав которых входят указанные препараты, налажен на научно-производственной фирме "Симко" (г.Львов, Украина) и малом научно-производственном предприятии "БиоМарк" (г.Львов, Украина).
Апробация работы.
Основные результаты работы представлялись на I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983), Ш Всесоюзном съезде врачей-лаборантов (Москва, I9S5), П Украинском съезде гематологов и трансфузиологов (Киев, I93S), Всесоюзном симпозиуме "Хроматография в биологии и иэдацше" (Москва, 1986), Всесоюзном совещании по сорбентам для хроматографии (Косов, 1986), Всесовзной конференции "Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике" (Москва, 1987), 17 Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии. {Алма-Ата, 1987), V Украинском биохимическом съезде (Евано-йранковск, 1987), Ш Всесоюзной научно-практн-' ческой конференции' "Актуальные проблемы производства , кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и ерганотерапевтических препаратов" (Москва, 1987), Республиканскойшколе-конфзречцш "Структура и функция биополимеров" (Львов, 1988), П іЛспубликанский конференции Литовского республиканского общества гематологов и трансфузиологов (Вильнюс, 1989), I Республиканский конференции по лектинам . "Изучение и применение лэктинов" (Тарту," 1989), ХІ7 Мездународном съезде по общей и прикладний химии (Москва, 1989), V Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматогрвфии (Юрмала, 1990), Ш Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Киров, 1991), Ш Симпозиуме по протеолнтйческим ферментам (Москва, 1993).
Основные положения, выносимые на зашиту.
-
Методы получения сорбентов на основе химически модифициро-ваншх кремнеземов, пригодных для биоспзцифической хроматографии белков крова и гель-фильтрации.
-
Результаты изучения взаимодействия тромбина, урокиназы и плазминогена с полученными биоспецифическими сорбентами. ,
3. Результаты изучения взаимодействия длазмнногена с биосдаци-фачными сорбентами, содержащими остатки ингаи'иторов протешаз. ,
: 4. Методы препаративного получения очищенных препаратов тромбина, швзманогена, плазмина, урокиназы и тромбоплзстияа с применением химически модифицированных кремнеземных сорбентов.
-
Метод получения нового субстрата для определения фибриноля-тической активности - азофиОрина, и результаты изучения его осноел^х ' физико-химических свойств и кинетических параметров'гидролиза ..
-
Результате изучения пригодности полученных препаратов тромбина, тромбопластина, плазмиаогена, плазмина, урокиназы и азофибрина для клинической диагностики нарушении системы гемостаза.
