Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы
1.1 Основные модели удерживания в нормально-фазовом режиме на силикагеле 9
1.2 Вопросы разделения изомеров полиеновых соединений 11
1.3 Факторы, влияющие на удерживание ионогенных соединений в условиях обращенно-фазовой хроматографии 13
1.4 Антоцианы; равновесия в водных растворах и поведение в условиях ВЭЖХ 19
ГЛАВА 2 Объекты и методы исследования
2.1 Хроматографическое оборудование 24
2.2 Нормально-фазовый режим 25
2.3 Обращенно-фазовый режим 27
2.4 Дополнительное оборудование 28
ГЛАВА 3 Нормально-фазовая ВЭЖХ соединений с кратными связями, расположенными возле полярной группы
3.1 Хроматографическое поведение непредельных третичных спиртов 30
3.2 Расчетные оценки различий хроматографического поведения спиртов 38
3.3 Хроматографическое поведение халконов 45
3.4 Заключение по главе 52
ГЛАВА 4. Разделение геометрических изомеров полиеновых соединений в нормально-фазовых условиях
4.1 Общая характеристика удерживания 53
4.2 Селективность разделения ДЕ-изомеров на типовых силикагелях 55
4.3 Силикагели с разными структурно-геометрическими характеристиками (отечественного производства) 60
4.4 Однокомпонентные элюенты 66
4.5 Расчет характеристик молекул полиеновых соединений и селективности разделения изомеров 68
4.6 Нормально-фазный вариант с привитыми полярными фазами .72
4.7 Заключение по главе 74
ГЛАВА 5. Исследование факторов, влияющих на удерживание ионогенных соединений в обращенно-фазовом режиме
5.1 Вопросы определения мертвого объема. 75
5.2 Удерживание неорганических ионов 82
53 Поведение фенилбензопириллиевых катионов 85
5.4 Заключение по главе 89
ГЛАВА 6 Исследование поведения конверсируемых ионогенных соединений (антоцианов) в обращенно-фазовом режиме и кислых подвижных фазах
6.1 Общая модель удерживания 90
6.2 Удерживание в присутствии хлорной кислоты 99
6.3 Удерживание в присутствии трифторуксусной кислоты 106
6.4 Удерживание в элюентах с добавками гексансульфоната натрия 109
6.5 Обоснование влияния муравьиной кислоты при использовании элюентов на ее основе 111
6.6 Заключение по главе 118
Основные результаты и выводы 120
Список литературы 122
Приложения 141
- Факторы, влияющие на удерживание ионогенных соединений в условиях обращенно-фазовой хроматографии
- Обращенно-фазовый режим
- Хроматографическое поведение халконов
- Силикагели с разными структурно-геометрическими характеристиками (отечественного производства)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - один из наиболее востребованных инструментов современной аналитической и фармацевтической химии. Непрерывное появление новых сорбентов и модификация известных способов разделения, расширение и усложнение инструментальной базы, появление принципиально новых (для ВЭЖХ) типов детекторов свидетельствует о пристальном внимании, проявляемом к данному методу анализа. Развитие теории жидкостной хроматографии привело к созданию адекватных моделей удерживания соединений различного строения в условиях как обращено фазовой, так и нормально-фазовой ВЭЖХ, и следовательно, к возможности прогнозирования хроматографического поведения полифункциональных соединений. Следует отметить, что теоретическая трактовка тонких эффектов взаимодействий собрата, сорбента и компонентов подвижной фазы в адсорбционном слое в большинстве случаев неоднозначна, и потому носит дискуссионный характер. Изучение этих эффектов, выявление закономерностей их проявления приводит не только к уточнению известных или к появлению новых толкований наблюдаемых процессов, но и позволяет непосредственно управлять селективностью разделения, упрощает поиск оптимальных условий анализа специфических многокомпонентных систем: таких, например, как поливитаминные препараты, экстракты натуральных красителей, природных и искусственных смесей, содержащих физиологически активные соединения.
Актуальность таких исследований обостряется наличием проблем фальсификации фармацевтических препаратов и пищевой продукции, определения качества и безопасности промышленных продуктов и исходного сырья. Подавляющее количество биологически активных соединений характеризуются высокой полярностью или способностью ионизироваться, и поэтому можно заключить, что знание факторов, влияющих на их удерживание не только способствует снижению времени, затрачиваемому на подбор условий разделения, но и предохраняет от возможных аналитических ошибок.
Целью работы явилось изучение влияния структуры геометрических изомеров природных и синтетических непредельных соединений на их хроматографическое поведение в зависимости от состава элюента и состояния адсорбционного слоя; выявление факторов, определяющих удерживание ионогенных органических и неорганических веществ в зависимости от рН, солевого фона и добавок модификаторов подвижной фазы.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
• экспериментальное определение параметров удерживания 40 непредельных соединений в 36 нормально-фазовых хроматографических системах;
• экспериментальное определение параметров удерживания 62 ионогенных и неионогенных соединений (антоцианы, флавилиевые соли, халконы, сульфоналы, амины, неорганические соли и пр.) в 15 обращенно-фазовых системах;
• синтез, препаративное ВЭЖХ-разделение ряда геометрических изомеров полиеновых соединений и подтверждение их структур спектроскопическими методами: ИК, ЯМР Ни С, УФ и видимой области;
• расчет геометрических и энергетических характеристик структур использованных соединений и образуемых ими модельных водородных связей методами квантовой химии и молекулярной механики;
• расчет факторов, влияющих на удерживание антоцианов и их равновесных форм в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с кислыми подвижными фазами.
Научная новизна работы. На основе наблюдаемого поведения в условиях нормально-фазовой (НФ) и обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ дана новая трактовка механизмов удерживания без непосредственного применения инкрементных моделей и (для НФ) - без использования общих физико-химических свойств сорбитов.
Показано, что в присутствии полярных а протонных модификаторов подвижной фазы в условиях НФ на силикагеле (ацетон, сложные эфиры) основной вклад в механизме заместительной сорбции трех непредельных изопреноидных спиртов вносят карбонильные группы модификаторов.
С помощью квантовохимического (и молекулярно-механического) расчета характеристик молекул сорбитов обоснован порядок их удерживания (НФ). В основу расчетов положено формирование водородных связей между гидроксильными группами спиртов и поверхностными функциональными группами сорбента при учете их стерической доступности и подвижности.
Найдено, что селективность разделения Z, -изомеров полиеновых соединений и халконов (НФ) определяется в большей степени структурой поверхности неподвижной фазы и в меньшей - составом элюента. Установлена тесная корреляция между селективностью и конформационными возможностями молекул и степенью доступности их якорных групп.
Показано, что в присутствии кислот и солей в адсорбционном слое обращенно-фазового сорбента может формироваться дополнительный заряд, что позволило объяснить наблюдаемое поведение сорбатов - гидрофильных и гидрофобных ионов.
Обоснована возможность образования ионных пар в адсорбционном слое между неорганическими анионами и органическими катионами типа флавилия. Предложена математическая модель, адекватно описывающая характер удерживания антоцианов при варьировании кислотности и солевого состава подвижной фазы.
Практическая значимость работы. Разработан комплекс из 12 методик определения витаминов, полупродуктов их производства и кислот цикла Кребса методом ВЭЖХ, апробированных на Болоховском химкомбинате синтетических полупродуктов и витаминов, НПО "Витамины" (г. Москва), НО "Биовитамины" (г. Белгород), НО "Завод лимонной кислоты" (г. Белгород), ОАО "Ай Си Эн Лексредства" (г. Курск), ООО "Технофарм" (г. Курск). Кроме того, выполнен ряд работ и разработан комплекс методик (17) для определения продуктов поисковых синтезов биологически-активных соединений. Перечень работ приведен в Приложении.
Положения, выносимые на защиту:
1. Обоснование закономерностей удерживания трех непредельных спиртов, обусловленных их геометрическими и конформационными характеристиками и хроматографическими свойствами полярных модификаторов подвижной фазы.
2. Обоснование механизма разделения геометрических изомеров полиеновых соединений и халконов, определяемого различием их структурных и конформационных свойств.
3. Обоснование удерживания органических ионов в присутствии органических и неорганических противоионов.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005); II Школе-семинаре «Ионообменные процессы и выделение физиологически активных веществ» (Воронеж, 2006); 61 региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2006); III всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» («ФАГРАН-2006», Воронеж, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы, в том числе 19 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК и 3 в виде тезисов докладов.
Факторы, влияющие на удерживание ионогенных соединений в условиях обращенно-фазовой хроматографии
С основными взглядами на удерживание и селективность в обращеино фазовых режимах можно ознакомиться, например, в [26-29]. Теоретические воззрения на удерживание приводят к выражениям, подобным (1.1). Классическая сольвофобная теория удерживания приведена в [54]. Несмотря на то, что нормально-фазовый режим на силикагеле может быть с успехом использован для разделения ионогенных соединений [6, 25], он обладает рядом неудобных свойств, а потому применяется нечасто. Основная неприятная особенность неполярных привитых фаз, использованных в обращенно-фазовой хроматографии высокополярных и ионогенных соединений - неоднородность поверхности, в общем случае выражающаяся в наличии остаточных силанольных групп. Их концентрация оценивается примерно в 2.2 групп/ым2 [22, 23, 29], причем их содержание и доступность коррелирует с характеристиками хроматографических сигналов [29]. Кислотность этих групп намного выше, чем у гелей кремневой кислоты (рК -4-9), [22, 29, 30, 32]. В основном, эта величина определяется структурой поверхности силикагелевой матрицы: близко расположенные ( силанолы вступают в водородную связь, что повышает их кислотность. Загрязнения силикагеля также могут способствовать падению их рК [30]. Еще один неприятный для экспериментатора фактор - малое знание действительного состава привитой фазы, чему способствуют коммерческие тайны фирм-изготовителей. Для нивелирования коллапса привитых неполярных фаз (капиллярного выталкивания воды из пор) [36]в элюентах с высоким содержанием воды используются полярные вставки или заполнение неприкрытых участков поверхности полярными же (обычно нитрильными) фрагментами [31].
Модели удерживания непрерывно модифицируются [33-35]. Тем не менее, возможность получения и обоснования действительно линейных зависимостей вида «удерживание - состав элюента» невысока [37]. Вопрос обоснования и экспериментального определения «мертвого объема» колонок всегда занимал внимание исследователей. Общие методы представлены в обзоре [51] и были проверены нами (Глава 5). Нами был использован наиболее обоснованный (с нашей точки зрения) метод Knox [50]. Не углубляясь в рассмотрение полученных в [50] зависимостей, приведем их итоги: Термодинамический мертвый объем (VM), определенный Knox как объем всех компонентов подвижной фазы в колонке определяется временами выхода элюентных сигналов (их количество всегда на 1 больше, нежели компонентов подвижной фазы) и концентрациями этих компонентов. В выражениях (1.3 - 1.5), записанных для бинарного элюента, ХА и YA - концентрации компонента А подвижной фазы в ней самой и в колонке, соответственно. VA, VB ,VR - времена выхода элюентных сигналов компонентов А, В и сигнала скачка состава элюента, вызванного введением в колонку пробы, состав которой отличен от состава подвижной фазы. Находимая методом Knox величина VM должна быть почти постоянна для всех составов подвижной фазы. Мертвый объем, как и объемы подвижной фазы, находящиеся в разных отношениях к набивке колонки, могут быть найдены разными (в том числе и разрушающими саму колонку) методами [52]. Процессы, происходящие с участием заряженных частиц вблизи раздела фаз (одна из которых большей частью неполярна, а вторая - раствор, обладающий определенной ионной силой) крайне сложны и рассматриваются обычно в исследованиях поверхностного натяжения [39, 41, 44]. Значительная часть работ (например, [11]) имеет лишь теоретическое значение. Тем не менее, выделим важнейший аспект, связанный с малым удерживанием ионов в условиях ОФ. Он, разумеется, связан с необходимостью потери части гидратной оболочки при сорбции - а значит, со снижением энергетической выгоды при уходе из фазы раствора. Второй фактор определен классической электродинамикой [43] и приводит к возникновению сил отталкивания ионов от неполярной поверхности. Эти силы рассчитываются через удобную математическую абстракцию («имиджевые» или зеркальные заряды, расположенные в толще неполярного диэлектрика). Расчет приводит к следующему выражению для распределения ионов вблизи поверхности [44]; D - диэлектрическая проницаемость раствора, X - постоянная экранирования Debye-Huckel, к - постоянная Больцмана, Т - температура, "К. На Рис. 1.1 приведена иллюстрация этого выражения. Экспериментальная проверка этого эффекта затруднена вследствие обязательного наличия зарядов у реальных поверхностей. Вопросы возникновения поверхностных зарядов, ионных пар, приводящих к значительному экранированию зарядов сорбатов (что повышает удерживание) и процессов, происходящих в жидкой фазе сложны и весьма дискуссионны [53, 55-65]. Можно выделить две группы публикаций: сторонников ионных пар [55, 65] и поверхностных зарядов [56-58]. Возможен также комбинированный подход [59-60]. С основными подходами, объясняющими удерживание в ион-модифицированной ВЭЖХ (IM-RPLC) можно ознакомиться в исчерпывающих обзорах J. G. Chen [55] и Jan Stahlberg [57]. Критику механизма механизма удерживания, построенного на моделях образования ионных пар можно считать во многом справедливой, (хотя следует признать, что расчет реального потенциала, создаваемый поверхностными зарядами на сложной поверхности крайне затруднителен [56]).
В самом деле, при наличии ярко выраженной специфической (гидрофобной) адсорбции ионного модификатора (I1R, ion interaction reagent) следует принять во внимание изменение поверхностного потенциала, что может увеличивать удерживание тех ионогенных элюатов, чей заряд противоположен к образованному заряду поверхности и уменьшать удерживание элюатов, полярность заряда которых одинакова поверхностному. Эти эффекты нашли достаточное экспериментальное подтверждение. С другой стороны, их количественное описание не может быть точным, поскольку вовлекает необходимость построения моделей адсорбционного слоя, осложненного адсорбированными (или распределенными) гидрофобными ионами. Отсюда следует необходимость построения моделей двойного электрического слоя на неплоских поверхностях, что само по себе является крайне сложной задачей. Кроме того, поскольку адсорбция (распределение) есть следствие выравнивания химических потенциалов адсорбата в подвижной и неподвижной фазе, следует также учитывать активность адсорбата в растворе. По-видимому, не может быть единых воззрений на механизм удерживания ионогенных соединений; каждая система должна рассматриваться в плане ее особенностей. Комбинированная модель Cecchi [59-60] учитывает изменение потенциала поверхности без отказа от ион-парных взаимодействий, что дает возможность оценить вклад ряда факторов в удерживание. Эта модель также позволила предположить, что отказ от вклада стехиометрических факторов (характерный для ион-парного подхода) необязателен. Можно добавить, что стехиометрический ион-парный подход вполне оправдан для практических вопросов разделения [66, 67]. Способ использования «инертных солей» в составе элюента известен давно; в ряде случаев он приводит к росту удерживания ионогенных соединений, и почти как правило - к улучшению эффективности и снижению асимметрии пиков. Существуют наблюдения, где подобные добавки вели к сложной зависимости удерживания (например, [53]), что объяснялось суммарным действием различных энергетических вкладов. Существующие воззрения на возможности образования ионных пар [45-48] не дают однозначных ответов. Согласно Bjerrum (электростатическое приближение), ионная пара - это два иона противоположного заряда, расстояние между которыми таково, что энергия электростатического притяжения между ними равна величине 2кТ. Более поздние воззрения накладывают ограничение на время жизни пары - два иона должны обладать единым вектором поступательного движения на время не менее одного периода молекулярного колебания. Пара может рассматриваться как термодинамический объект, поведение которого описывается константой
Обращенно-фазовый режим
Использованы колонки ReproSil-Pur С18 AQ (Dr. Maisch), Nucleosil 100-C18, Диасфер I10-C18 (БиоХимМак). Размер колонок всегда 4 250 мм, скорость потока элюента 1 мл/мин. Соединения растительного происхождения (антоцианы) получали в виде смесей экстракцией из соответствующих растительных форм. В основном, использовали экстракты шкурок винограда в элюенте с близкой (для применяемого элюента) кислотностью. Также применялись растворы индивидуальных антоцианов, очищенных хромато графически. Полупрепаративное выделение применяли только при необходимости идентификации спектрофотометрическим методом (по виду агликона) или хроматографически - после снятия гликозидных остатков. Влияния кислотности экстракта (выделенных фракций) на времена удерживания во всем диапазоне проделанных измерений не обнаружены; по крайней мере, при разности рН элюента и инжектируемых растворов не более 1. Используемые концентрации антоцианов как правило, были невелики (что доказывалось отсутствием концентрационного изменения удерживания). Увеличение рабочих концентраций не приводило к изменению времен удерживания, что говорит о незначительности процессов самоассоциации. Каждое измерение времени удерживания повторяли 2-4 раза; расхождения не превышали 0.5 %. После каждой серии измерений колонка промывалась ацетонитрилом, ее работоспособность проверяли измерением удерживания антоцианов в реперных условиях (при рН 1.2 и 2.2); изменения удерживания не превышали 2% и имели случайный характер. Измерения рН проводили на рН-метре ОР-213 (Radelkis, Hungary) с комбинированным стеклянным электродом. Режим измерений wspH (то есть один из рекомендованных IUPAC, при котором рН-метр настраивают по водным буферным растворам, и измеряют кислотность элюента после добавки органического модификатора). Показания иономера использованы как величины активности водородных ионов (ац) в дальнейших расчетах.
Рассмотренный нами диапазон не превышал рН 1.1-3.7. Спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области снимали с помощью спектрофотометра Specord М40 в кюветах с длиной оптического пути 1-10 мм. Идентификацию соединений (при необходимости) проводили посредством измерения спектров ЯМР Н, Си F на спектрометре Tesla BS567 (в хлороформе-di, диметилсульфоксиде-dg или тяжелой воде) с отсчетом химических сдвигов от сигналов ГМДСО и DSS (внутренние стандарты) или остаточных растворителей. Квантовохимические расчеты строения и свойств рассматриваемых соединений проводили с помощью пакета HyperChem 7.1 и GAMESS (использованы неэмпирические методы на базисах малом 3-21G и среднем 6-31G и полуэмпирический метод AMI); для аппроксимации экспериментальных данных и расчета равновесий и общей математики использовали пакеты MatLab 6.5 и MathCad 11. Соединения II (3,7,11,1-тетраметилгексадека-1-ен-3-ол, изофитол) и III являются полупродуктами цепи одного из способов синтеза витамина Е, имеющего промышленный характер; соединение I - побочный продукт синтеза. Все три спирта различаются только кратностью связи, находящейся непосредственно рядом с единственной полярной группой; это, а также наличие длинного углеводородного фрагмента делает их классическими объектами для нормально-фазной ВЭЖХ. Поведение спиртов І-ІІІ изучалось на колонке uPorasil (5 мкм, размер 4.6 250 мм) при скорости потока элюента 1 мл/мин и рефрактометрическом детектировании.
Использованы бинарные элюенты на основе гексана с (только) протонноакцепторньши полярными добавками: диэтиловый эфир (ДЭЭ, диапазон концентраций 6.2-18.2 мольн. доля,%), ацетон (3.5-7.2) и сложные эфиры: этилацетат (6.6-12.9), бутилацетат (5.0-9.9), этилпропионат (5.7-11.2 мольн. доля,%). Основными факторами сольватации в данной системе будет специфическое взаимодействие (очевидно, максимальное для ацетона и минимальное для диэтилового эфира) и диполь-дипольное взаимодействие между сорбатами и полярными добавками. Почти во всех рассмотренных системах (кроме варианта ацетона, что будет обсуждено ниже) сохранялся единый порядок удерживания компонентов: II III I. Для иллюстрации удерживания vs. вид и концентрация полярной добавки на Рис. 3.2 приведено удерживание соединения II. (Здесь, вопреки рекомендациям [6] мы воспользуемся именно мольной долей, хотя применение молярности только слегка ухудшает линейность этих зависимостей). Для всех полученных значений удерживания величина R (квадрат коэффициента корреляции Пирсона) больше 0.994. В целом, приведенные данные неудивительны. Табулированные значения полярностей (р ) находятся в ряду ацетон этилацетат ДЭЭ; полярности бутилацетата и этилпропиоиата будут находиться между этилацетатом и ДЭЭ. Несколько необычной может показаться почти одинаковая наблюдаемая элюирующая способность этил- и бутилацетатов на фоне резко сниженной элюирующей способности этилпропиоиата.
То есть, для этих сложных эфиров (R-CO-0-R1) увеличение К на две метиленовых группы почти не меняет их элюирующих свойств; в то время как увеличение R на одну группу дает хорошо заметный эффект. Вероятно, это связано с преимущественным способом связывания между молекулами сложных эфиров и поверхностью силикагеля. Если это связывание обусловлено преимущественно карбонильной группой (что очевидно), то удлинение R (в нашем случае почти в 2 раза) приведут к увеличению стерических помех (для «якорной» карбонильной группы), что и снизит элюирующую способность. В самом деле, рассчитанные малликеновские заряды на соответствующих атомах кислорода для оптимизированных структур всех трех сложных эфиров почти одинаковы (-0.357 на карбонильном кислороде и -0.283 на эфирном). Сами по себе подобные зависимости могут оказаться малопригодными для детального анализа удерживания, поскольку весьма зависимы от ряда факторов — например, марки и состояния сорбента, возможной нелинейности реальных зависимостей, ошибок измерения. Можно лишь отметить, что наклоны логарифмических зависимостей Снайдера-Сочевиньски [2-3] минимальны для соединений І-ІЇЇ при применении ДЭЭ (до 1.15) и максимальны при использовании этилацетата (до 1.41). Сложная трактовка этих значений, связанная с разной адсорбционной способностью полярных добавок и разной сольватацией ими спиртов I-III затрудняет понимание наблюдаемых процессов. Но на этом этапе рассуждений мы можем отметить важный момент: по-видимому, основное участие в процессах сорбции принимает только один из
Хроматографическое поведение халконов
Халконы - карбонилсодержащие непредельные соединения, в которых двойная связь находится рядом с карбонильной группой и следовательно, может вступать с пей в сопряжение. Можно также сказать, что возможно также кросс-сопряжение всей халконной структуры; впрочем, для подобных заключений мы воспользуемся расчетом оптимизации. Рассмотрим поведение трех соединений, Рис. 3.8. Их можно назвать подобными; для нас же важна их возможность образовывать Z -изомеры по двойной связи, находящейся (как уже указано) непосредственно возле единственной полярной карбонильной («якорной») группы. Эти изомеры легко образуются при освещении ультрафиолетом растворов IV-VI (то есть их транс-язомеров, обычно образующихся при синтезе) в элюенте, что не требует применения дополнительных синтетических методик. После образования заметных количеств Z-изомеров растворы могут быть введены в хроматограф. Измерения проведены на хроматографе Милихром-1 с колонкой КАХ-1 (производство завода «Научприбор», г. Орел) размером 2 64 мм, заполненной силикагелем Сипасорб 600 (5 мкм). Эффективность колонки по нитробензолу составляла около 5500 т.т., что позволяло достаточно точно определять времена удерживания. Для приготовления элюента использованы растворители, осушенные и сохраняющиеся над молекулярным ситом NaA (4А). За время всех измерений температура (комнатная) изменялась не более, чем на 1. Для приготовления элюентов использован только один полярный модификатор — ДЭЭ, который смешивали с гексаном. Скорость потока элюента всегда была равна 100 мкл/мин, длина волны детектирования - 300 нм, что являлось компромиссным решением для различного поглощения рассмотренных соединений. На Рис. 3.9 приведены логарифмические зависимости удерживания всех шести халконов от мольной доли, % ДЭЭ в гексане.
Наклоны этих зависимостей (лежащие в диапазоне 0.85-0.99) меньше единицы и соответственно, меньше таковых для спиртов, рассмотренных ранее. Это можно трактовать, например, как меньшую сольватируемость халконов по сравнению со спиртами, поскольку применяемый в этих измерениях ДЭЭ не обладает протоннодонорными свойствами. Параметры относительного удерживания халконов приведены в Табл 3.4. Линейность полученных зависимостей весьма высока, и мы можем считать приведенные значения достаточно достоверными. Известно, что бензол проявляет слабые протонноакцепторные свойства; на этом его отличии от гексана построено исследование степени гидролизованности поверхности силикагеля [22]. Бензол может также использоваться в качестве «полярной» добавки, что будет рассмотрено далее. Это означает, что фенильные фрагменты халконов способны участвовать в сорбции. В самом деле, халконы IV удерживаются менее всего. Таблица 3.4 Параметры линейных зависимостей Igk" Е-изомеров соединений V, VI от IV (добавление фенильной группы) и Z-изомеров от соответствующих Е-изомеров. Поскольку ДЭЭ практически не проявляет протоннодонорных свойств и обладает сравнительно небольшим (1.15 D) дипольным моментом, то мы можем предположить, что различия в степени взаимодействия между ним и халконами в подвижной фазе будут минимальными. Значит, для объяснения наблюдаемых эффектов мы можем сосредоточиться на вопросах взаимодействия структур халконов с поверхностью.
Вполне возможно, что наиболее выгодная ориентация молекул Е-халконов к поверхности сорбента - та, при которой плоскости их структур параллельны поверхности. Согласно данным Табл. 3.4, при появлении фенильных заместителей с любой стороны молекулы IV, наклоны растут. Причем этот рост неодинаков и является большим именно при переходе IV— V, то есть когда изменения касаются той части молекулы, где находится этениленовый фрагмент. Для понимания подобного поведения обратимся к расчетным характеристикам рассматриваемых молекул. Оптимизированные структуры Е изомеров рассмотренных халконов в общем, не планарны. Тем не менее, разница между оптимальной структурой и полностью планерной составляет около 0.88 ккал/моль - величиной, которая вполне может быть ошибкой (особенностью) оптимизирующего алгоритма. И которой (при комнатной температуре) мы можем пренебречь. Можно также отметить, что применение молекулярно-механического метода ММ+ приводит к полностью планарным структурам. В таком случае, мы можем считать, что -структуры данных халконов с высокой вероятностью полностью сопряжены. Впрочем, нарушение этого сопряжения не требует высоких энергетических затрат: вращение кольца А вокруг связи, соединяющей его с карбонильным атомом углерода требует преодоление барьера в 1.8 ккал/моль; кольца В -2.0 ккал/моль.
Силикагели с разными структурно-геометрическими характеристиками (отечественного производства)
Получить дополнительную информацию о механизме удерживания рассматриваемых соединений можно используя силикагели с различными СГХ. Чтобы снизить возможное нивелирующее воздействие воды на структуру поверхности, доступной в условиях ЖХ, следует ограничить ее концентрацию. Для исследования влияния поверхности сорбента на селективность разделения геометрических изомеров взяли ряд силикагелеи с различными структурно-геометрическими характеристиками поверхности отечественного и импортного (Таблица 4.3). После соответствующей обработки ими были набиты колонки. Измерено удерживание изомеров соединений VII-IX (ряд, в котором происходит удлинение полиеновой цепи) Рис. 4.4 Удерживание транс-изомеров VII (0), VIII (с) и IX (о). .Для силикагеля КСМ-бс (средний D„ = 2 нм) указаны приблизительные значения при скорости потока элюента 0.2 мл/мин Значения селективности а для рассмотренных соединений приведены в левой части Таблицы 4.3. Элгоент 10 об.% диэтилового эфира в гептане (увлажнение 50%), скорость потока 2 мл/мин. Силикагель КСМ-бс не включен в таблицу, поскольку продемонстрировал явную зависимость удерживания от скорости потока элюента вплоть до скорости 0.2 мл/мин. Удерживание транс-изомеров соединений VII-IX проиллюстрировано на Рис. 4.4. При росте поверхности (и снижении среднего диаметра пор) растет удерживание, достигая максимума на узкопористом КСМ-5. Можно отметить, что этот рост обладает значительной корреляцией с декларированными значениями Sv . При дальнейшем снижении среднего диаметра пор (менее 3 нм, ШСМ и КСМ-бс) большая часть поверхности силикагеля становится недоступной, что объясняется либо жесткими стерическими препятствиями со стороны поверхности, либо капиллярной конденсацией воды в узких порах. На Рис. 4.5 приведены зависимости удерживания VIII и IX от удерживания VII; они высоколинейны (квадрат коэффициента корреляции
Пирсона более 0.986). Отклонившиеся (и не включенные в общие зависимости) точки представляют собой случай узкопористого силикагеля ШСМ. Удерживание VIII (и в особенности) IX снижается из-за уменьшения доступной для этих соединений поверхности. Можно сказать, что -изомеры всех трех соединений ведут себя подобно. Это позволяет предположить, что при адсорбции эти соединения преимущественно ориентированы перпендикулярно поверхности сорбента. Сразу можно отметить, что рост кривизны поверхности (изменение СГХ, снижение диаметра глобул, образующих частицы силикагеля), косвенно соответствующий росту удельной поверхности Syf) и уменьшению Д,,сильно сказывается не только на факторе удерживания, но и на селективности. В условиях дефицита воды только широкопористый сялохром С-120 продемонстрировал значения селективности, сходные со значениями, полученными на типовых увлажненных силикагелях. Это неудивительно: ведь Иными словами, можно сказать, что для рассмотренных соединений поверхность силохрома является плоской; для нашего рассмотрения удобно считать получаемую селективность «эталонной» - поскольку она максимальна. Конформационные эффекты, рассмотренные в предыдущем разделе, смогут быть реализованы в большей степени. Это же относится и к узкопористым ШСМ (и КСМ-бс, не приведено). Большая часть их поверхности недоступна. Указанные значения селективности для силикагеля ШСМ сохраняются и при использовании более сухих (около 10% увлажнения) элюентах. Из приведенных в Таблице 4.3 значений а видно, что наибольшее влияние рост Syd силикагеля оказывает на селективность разделения изомеров наиболее длинноцепочного IX и почти не влияет на разделение изомеров VII. Можно сказать, что во всем ряде силикагелеи их доступная поверхность является почти плоской для изомеров VII, а основной механизм удерживания одинаков для всех соединений. Это предположение позволит нам провести наглядную иллюстрацию изменения селективности. Для этого введем дважды нормированное удерживание: Можно сделать заключение, что относительное удерживание 9Z-, 1Z-, Е-изомеров IX меняется сравнительно немного (JV близка к "1"); но в области пор малого и среднего размера (КСМ-5 -КСК-2, 3.6 - 13.5 нм) резко растет удерживание 13Z- и 11Z- изомеров, и порядок выхода становится примерно следующим: 9Z 1 \Z J3Z 7Z all-. Поскольку очевидно, что наблюдаемые эффекты связаны именно с изменением кривизны поверхности сорбента и длиной сорбатов, то можно предложить два вероятных объяснения. Во-первых, если радиус кривизны поверхности сорбента положителен и имеет размер порядка размера молекулы IX, то стерические препятствия (доступность карбонильного кислородного атома) снижаются. В большей степени это относится к 13ZH llZ-изомерам. Во-вторых, если принять во внимание, что при адсорбции в узких порах может произойти блокирование вращения вокруг одинарной связи, ближайшей к полярному концу молекулы (C4-i5 для IX и С12-із для VIII). Тогда молекула 13Z соединения IX и молекула 11Z соединения VIII оказываются неотличимыми от молекул их трсшс-изомеров, и селективность а падает. Далее, для IX вклад в удерживание начинает оказывать вращение вокруг следующей (Q2-13) одинарной связи. Но для 11Z вращение вокруг связи С]2-із стерически затруднено и в фазе раствора и, следовательно, не должно значительно снижать удерживание. Оставшиеся 9Z, 7Z, Е с рассмотренных сторон своих характеристик не меняют, и поэтому сохраняют порядок выхода.
Следуя подобной логике, влажность элюента должна иметь большое влияние не только на удерживание, но и на селективность. Если в варианте силикагеля ШСМ почти нет возможности удаления воды из его пор осушенным элюентом, то эта процедура может быть выполнима для более широкопористых силикагелеи. И если это так, то при конденсации воды в более широких порах (КСМ-5 - КСК-2) величины а для изомеров IX должны быть близки к аналогичным значениям для силохрома. Действительно, при хроматографировании на силикагеле КСС-3 с элюентом того же состава, но увлажненным до насыщения, порядок удерживания становится нормальным. Наклоны В (1) при переходе от 50 до 100% -увлажненного элюента для 13Z, 11Z, 9Z, 1Z равны 2.18, 1.63, 0.72, 0.94 соответственно. Наибольшее изменение,
