Содержание к диссертации
Введение
1. Фукозоспецифичные лектины в диагностике и изучении новообразований 8
1.1 Важная роль a-L-фукозы в патологических процессах 10
1.1.1 Особенности динамики фукозилированных рецепторов лектинов на последовательных этапах онтогенеза 11
1.1.2 Антигены групп крови, изменение их экспрессии, ассоциируемое с патологическими трансформациями клетки 12
1.1.3 Фукоза в изучении заболеваний неопухолевой природы 15
1.1.4 Проявление фукозосо держащих опухолевых углеводных антигенов на мембранах злокачественных клеток 19
1.2 Фуколектины: распространение, выделение, строение и получение диагностических реагентов. Тонкая углеводная специфичность 21
1.2.1 Скрининг организмов на присутствие фукозоспецифичных лектинов 21
1.2.2 Методы определения локализации лектинов их выделение, получение диагностических реагентов 24
1.2.3 Строение фукозоспецифичных лектинов и тонкая углеводная специфичность 27
1.3 Фукозоспецифичные лектины в диагностике и изученииновообразований 35
2. Результаты и их обсуждение 44
3. Материалы и методы
3.1 Материалы 76
3.2 Методы исследования 79
Выводы 91
- Фуколектины: распространение, выделение, строение и получение диагностических реагентов. Тонкая углеводная специфичность
- Строение фукозоспецифичных лектинов и тонкая углеводная специфичность
- Фукозоспецифичные лектины в диагностике и изученииновообразований
- Методы исследования
Введение к работе
Лектины как цито- и гистохимические реагенты широко используются в изучении структуры гликопротеинов клеточной поверхности. Перспективным направлением является применение меченых лектинов в исследовании стадий трансформации клеточных мембранных и секреторных гликоконъюгатов при патологических процессах, в том числе злокачественных [1]. В этом плане наиболее ценными гистохимическими реагентами на углеводные детерминанты являются узкоселективные лектины, специфичные к терминальному углеводу. Особенно редко встречаются углеводсвязывающие белки, специфичные к фукозе. a-L-фукоза является важным компонентом секреторных гликоконъюгатов, а также определяет фенотип многих клеточных популяций человека [2]. Поскольку этот моносахарид входит в состав многих антигенных детерминант, в том числе групповых веществ крови, трансформация которых ассоциируется с патологическими преобразованиями в клетке, и канцероэмбриональных антигенов, проявляющихся при различных онкологических заболеваниях, то исследование олигосахаридной специфичности новых фуколектинов представляет особый интерес для применения их в патоморфологической диагностике.
Ряд хорошо изученных фуколектинов широко используется в цито- и гистохимических исследованиях. Ими являются препараты семян растений Ulex europaeus и Lotus tetragonolobus, гриба пецицы оранжевой Aleuria aurantia и плазмы морского угря Anguilla anguilla. Поиск новых селективных фукозоспецифичных реагентов остается актуальной проблемой.
Одним из доступных источников фуколектинов является икра некоторых видов рыб. В частности, икра окуня содержит фуколектин, олигосахаридная специфичность которого не изучена. Исследование специфичности данного лектина представлялось актуальным, так как это позволило бы определить перспективы его применения в качестве диагностического и прогностического маркера.
Фуколектины: распространение, выделение, строение и получение диагностических реагентов. Тонкая углеводная специфичность
Хотя лектины обнаруживаются в любой живой системе, концентрация их в различных видах организмов неравномерна. Ряд источников лектинов, такие как бактерии, растения, морские организмы содержат большие количества этих белков и могут служить для препаративного получения лектинов. Лектины млекопитающих и человека труднодоступны по причине их маленьких концентраций. Однако, ценность данных лектинов заключается в том, что они являются селективными маркерами отдельных клеток, а также тканевых структур. Остается важным проведение скрининга источников лектинов растительного и животного происхождения. Важен поиск токсичных лектинов для конъюгации с антителами. Кроме того, скрининг растений на присутствие в них нужных лектинов далеко не исчерпан, поскольку в одном и том же источнике (видовом) присутствует спектр лектинов [75]. Если раньше искали, в основном, специфичные к моносахаридам лектины, то теперь в центре внимания лектины с олигосахаридной специфичностью, в том числе из ранее охарактеризованных лектинов. В таблице 2 представлены данные о фукозоспецифичных лектинах и агглютининах из следующих видов организмов: бактерии, стрептомицеты, аскомицеты, высшие растения, простейшие, мерозоиты, ракообразные, рыбы, млекопитающие. Простым способом обнаружения фуколектинов в биологическом материале является исследование соответствующего экстракта на его способность агглютинировать эритроциты, а также осаждать фукополисахариды или фукогликопротеины. В связи с тем, что молекулы лектинов невидимы в электронном микроскопе для определения их локализации после связывания с биологическими структурами используют реагенты, содержащие электронно-плотную метку, например, меченые гликопротеины. Принципиальная возможность этого метода обусловлена тем, что в большинстве случаев лектины имеют субъединичную структуру, что приводит к поливалентности. Согласно стереохимическим закономерностям только один активный центр лектина связывается с углеводной детерминантой. Свободные активные центры могут далее реагировать со специфическими углеводами, находящимися в составе меченого Ш гликопротеина. В качестве меченого второго реагента можно использовать также антитела к лектину. В этом случае наличие свободных активных центров в связанной молекуле лектина не имеет значения, так как антитела могут взаимодействовать с целым рядом антигенных детерминант на поверхности молекулы белка.
Первую стадию фракционирования белка, после гомогенизации биологического материала, проводят высаливанием сульфатом аммония или хлоридом натрия. Для очистки фукозоспецифичных лектинов обычно используют аффинные сорбенты, на основе таких иммобилизованных лигандов, как гликопептиды муцина с анти-Н активностью из слизистой оболочки желудка свиньи, 0-фукозиламин, фукозосодержащие олигосахариды, фукозилированный бычий сывороточный альбумин, L-фукозилгликозиды и другие [125-126]. В качестве матрицы для ковалентного присоединения используют % традиционные макропористые гидрофильные сорбенты сферой и сепарон, фрактогель 55-65, сефарозу 4 В и 6 В, биогели Р-150 и Р-200, сефадексы G 150-200 и другие. Следует отметить разнообразие способов получения одних и тех же - лектинов, в зависимости от выбираемого аффинного сорбента. Пектины, как обычные белки, также можно выделять традиционными методами: ионообменной хроматографией, гель-хроматографией, однако, выходы существенно ниже, чем при применении аффинной хроматографии. После аффинной хроматографии полученные препараты представляют ) собой, как правило, семейство так называемых изолектинов, различающихся изоэлектрической точкой, рядом физико-химических свойств, а часто и тонкой углеводной специфичностью. С помощью аффинной хроматографии разделить изолектины достаточно сложно, и чаще используют ионообменную хроматографию. Перспективными источниками фуколектинов являются отходы производства, такие как зародыши семян, растительные соки, белковые пасты из соков кормовых трав, отжимы масличных семян, отжимы гемолимфы из морских организмов, икра рыб. Возможен путь отбора мутантных клеток растительного и животного происхождения и, особенно, микроорганизмов (в первую очередь бактерий и грибов) по признаку максимального продуцирования в среду того или иного лектина или группы лектинов. Для использования лектинов в качестве диагностических реагентов получают их конъюгаты с электронно-плотными метками. В настоящее время Iі используют многочисленные маркеры, представленные ферритином, коллоидным железом, гемоцианином, вирусными частицами, полистирольными, метилметакрилатными, кремниевыми микросферами. Широко используются частицы коллоидного золота [127,128]. Другой тип метки представляют гликопротеины — ферменты, в частности пероксидазы. Для их обнаружения обычно применяют субстраты, продукты окисления которых выявляются в виде электронно-плотных отложений. В настоящее время получено достаточное количество фукозоспецифичных лектинов в чистом виде, однако только для немногих образцов изучена тонкая углеводная специфичность, лежащая в основе их взаимодействия с углеводными структурами биополимеров.
Именно эта характеристика определяет ценность того или иного лектина и его конкурентоспособность с антителами как гисто- и цитохимического реагента. Лектины обладают уникальным свойством избирательно связываться с углеводными детерминантами гликопротеинов, гликолипидов и протеогликанов, не вызывая химических превращений, при этом каждый лектин проявляет характерную специфичность взаимодействия с углеводами. К сожалению, еще не для каждого лектина изучена с достаточной полнотой тонкая углеводная специфичность. Исследование тонкой специфичности лектина требует наличия коллекции соответствующих олигосахаридов, при этом для однозначной интерпретации результатов исследования гликопротеинов животных тканей необходимо, чтобы лектин проявлял специфичность к одному антигену и не взаимодействовал с близкими по структуре сахарами. Далее рассматриваются именно те фукозоспецифичные лектины, для которых изучена тонкая углеводная специфичность, установлена структура взаимодействующих с ними углеводных фукозосодержащих детерминант и применение которых наиболее перспективно. Хорошо изучены препараты семян утесника европейского (U.europaeus), аспарагуса {L.tetragonolobus), гриффонии (G.simplicifolia), галлактии В семенах U. europaeus находятся три типа лектинов: тип I, специфичный по отношению к L-фукозе, тип П, специфичный по отношению к олигомерам N-ацетил - D-глюкозамина и тип III специфичный на полилактозаминные цепи (DGalpl-4DGlcNAc) [104,105,129]. Пектины U. europaeus I и U. europaeus II являются металлопротеинами, содержащими два атома Са 2+ и один атом Zn 2+ или Мп 2+ на молекулу, однако только лектин II полностью теряет способность к осаждению углеводов после обработки 3DTA или кислотами. Лектин I состоит из трех субъединиц, имеющих молекулярную массу 30 -32 кДа каждая, и на одну субъединицу приходится один углеводсвязывающий сайт. Лектин U. europaeus /является гликопротеином с pi 6.0-6.1, содержащим 7.2% нейтральных углеводов. Манноза и глюкозамин является доминирующими моносахаридами, а также присутствуют фукоза, ксилоза и It галактоза. Аминокислотный анализ продемонстрировал присутствие аспарагиновой кислоты, серина и глицина, и в больших количествах триптофана, цистеина, метионина. Было показано, что серии присутствует только на N-конце белка.
Строение фукозоспецифичных лектинов и тонкая углеводная специфичность
Из семян L.tetragonolobus выделен фукозоспецифичный лектин -металлопротеин, существующий в трех изоформах, с молекулярными массами 120 кДа (А), 58 кДа (В) и 117 кДа (С). Активность всех изоформ ингибирует L-фукоза, при этом ее а-аномер в 10 раз эффективнее как ингибитор, чем/?-аномер [97-102]. Лектин L.tetragonolobus-A (LTL-A) и L.tetragonolobus-C (LTL-C) являются тетрамерами, a L.tetragonolobus-B (LTL-B) - димером. Все три изолектина имеют разную аффинность к фукозилированным олигосахаридам (таблица 4). Присутствие двух a-Fuc моносахаридов практически не влияет на активность лектинов. Наличие D-Gal в олигосахаридах тоже не влияет на аффинность, но влияет на температурную чувствительность и на кинетику реакций преципитации. Определенные дифукозилированные олигосахариды способны образовывать перекрестные связи и осаждать тетрамерные изолектины LTL-А и LTL-C, но не димерный LTL-B. Биантенные олигосахариды, содержащие Lex или Lea тип 2 антигены на невосстанавливающихся концах, являются бивалентными лигандами, в то время как биантенный олигосахарид, содержащий только одну Lex детерминанту, и моноантенные олигосахариды связываются с LTL, но без осаждения (таблица 4). Лектины L.tetragonolobus взаимодействуют с углеводными детерминантами, обладающими активностью Н-антигена, проявляя специфичность к олигосахаридным цепям антигена Н типа 2 (таблица 1). Замена этой связи на /51-3 полностью блокирует активность олигосахарида как ингибитора. Лектин A. aurantia представляет собой белок, молекулярная масса которого составляет 72 кДа. Молекула его состоит из двух полипептидных цепей (36 кДа), каждая из которых содержит один углеводсвязывающий сайт. В молекуле лектина отсутствуют серосодержащие амнокислоты и углеводы, а также нейтральные и аминосахара. Лектин A. aurantia агглютинирует эритроциты человека всех АВО и Le типов (таблица 5) [46]. Лектин A. aurantia способен связывать последовательность L-Fucal-3DGlcNAc, которая входит в состав фукозилированных структур гликопептидов мозга и может быть использован для их выделения и изучения. A. aurantia лектин связывается с Lea антигенной детерминантой и с последовательностью L-Fucal-6 DGlcNAc/?l-4Asn, в то время как лектины U.europaeus I и L.tetragonolobus обладают слабой аффинностью к этим гликанам. Гликаны, в составе которых присутствуют группы антигенов Н тип 1 и тип 2, слабо связываются лєктшіом A.aurantia. При исследовании клеток мышц человека и мыши с миодистрофией Дюшенна на связывание с лектинами U.europaeus I, L.tetragonolobus и A.aurantia наблюдалось четкое связывание с A.aurantia лектином.
Лектин IV из семян растения G.simplicifolia специфически связывается с антигенными детерминантами Leb и Ley (таблица 1) [91]. Это гетеродимерный металлогликопротеин, каждая субъединица которого содержит один ион Са , один Мп и один углеводсвязывающий сайт. Фуколектин плазмы угря A.anguilla взаимодействует с рядом Н содержащих антигенов (Ley H тип 1 Н тип 2 Le ) и распознает Lea антигенную детерминанту [117,118]. Лектин семян G.tenuiflora связывает Н антиген независимо от несущей последовательности, но не взаимодействует с дифукозилированными антигенами Le и Ley [92]. Перспективным диагностическим реагентом является изолектин икры окуня P.fluviatilis II. Данный фуколектин распознает Н дисахаридную детерминанту в том числе в составе дифукозилированных структур. Наибольшее сродство лектин проявляет к Н тип 1 антигенной детерминанте, не проявляя сродства к нефукозилированным олигосахаридам и к Lex и Lea антигенам, однако связывает Le детерминанту, являющуюся биоспецифическим маркером клеток рака толстой кишки [130,131]. Из коры бобовника золотой дождь (Laburnum anagyroides) получен фукозоспецифичный лектин [93]. В составе лектина обнаружено 13,1% углеводов. Для аминокислотного состава характерно высокое содержание серина, треонина, кислых аминокислот и отсутствие цистина и цистеина. Лектин агглютинирует эритроциты человека, однако наиболее высокий титр наблюдается с эритроцитами Н(О), что свидетельствует о специфичности анти-Н данного лектина. Кроме того, выявлены существенные различия титра гемагглютинации с индивидуальными образцами эритроцитов одной и той же группы крови. Например, титр гемагглютинации эритроцитов нулевой группы колебался в пределах 1:32 -1:512. Эритроциты группы А агглютинировались при титре 1:32 - 1:64, эритроциты группы В - 1:1 - 1:32. Вероятно, дифференцирование эритроцитов в пределах одной группы крови зависит от количества остатков L-фукозы на поверхности эритроцита. На основании изложенного можно заключить, что, используя избирательность отдельных фуколектинов по отношению к определенным концевым углеводным остаткам олигосахаридной цепи, можно определить химическую структуру фукозосодержащих детерминант и их распределение на клеточной поверхности. Важно, что знание углеводной специфичности позволяет избежать эмпирического подхода к применению этих белков для интерпретации результатов на основе химической структуры сахаридов.
Фукозоспецифичные лектины в диагностике и изученииновообразований
Способность к избирательному накоплению специфических фукозосодержащих глйкоконъюгатов, которую впервые обнаруживают клетки зародышей [132], сохраняют клетки половозрелых животных и человека. При этом в течение последующего приобретения органами и системами дефинитивной структуры, различия между отдельными популяциями клеток по составу и топографии рецепторов фукозоспецифичных лектинов возрастают [133]. В связи с этим некоторые фуколектины завоевывают прочные позиции в качестве селективных гистохимических маркеров определенных разновидностей клеток и тканевых неклеточных структур. (дифференцированности) составляющих клеточных популяций и существенно изменяется при патологии [134]. Вместе с тем, динамика тканевых и клеточных фуколигандов в процессе дифференцировки, как и при патологии, подчинена определенным закономерностям [135]. Это позволяет применять пектины в эмбриологических исследованиях, а также в патоморф о логической диагностике, в частности, в качестве опухолеспецифических маркеров и для уточнения гистогенеза опухолей [136]. Существенно, что изменения претерпевают фукополимеры в клетках или внеклеточном матриксе в зоне патологического процесса [137]; селективность маркирования других тканевых структур или клеточных популяций, как правило, не изменяется. В таблице 6 отражены основные фукозоспецифичные лектины, маркирующие отдельные типы и субпопуляции клеток и неклеточных тканевых структур. Первые результаты по применению лектинов для изучения злокачественно трансформированных клеток получены еще 30 лет назад, однако особенно широкое внедрение лектинов как инструмента исследований патоморфологии отмечается в последние годы [139]. Это обусловлено расширением знаний об олигосахаридной специфичности лектинов. Используя наборы фуколектинов с различной углеводной специфичностью, можно проследить этапы злокачественной трансформации тканевых и секреторных гликоконъюгатов при различных видах новообразований. В таблице 7 представлена специфичность фуколектинов к углевод со держащим опухолевоассоциированным антигенам. Среди новообразований наиболее детально изучены опухоли пищеварительного аппарата - желудка, тонкой и толстой кишки, поджелудочной железы а также печени.
Показана диагностическая ценность лектинов утесника {U.europaeus Г) и аспарагуса (L.tetragonolobus) при раке толстой кишки и поджелудочной железы [141]. Различными исследователями показано, что фукозоспецифичный лектин утесника является селективным гистохимическим маркером эндотелиоцитов человека [142,143]. Клетки большинства опухолей эндотелиального происхождения сохраняют высокое сродство к этому лектину, причем в ряде случаев обнаружение рецепторов лектина утесника служит более постоянным свидетельством эндотелиального генеза опухоли. Отсутствие в норме рецепторов лектина утесника в печени, костном мозге и лимфатических сосудах предложено использовать для дифференциальной диагностики гемангиом и лимфангиом [144,145]. С помощью лектина утесника I уточнен гистогенез недифференцированных назофарингеальных карцином, диагностируются гипернефромы. При исследовании нефробластом обнаружены существенные изменения в связывании, что позволило предположить, что в клетках нефробластом имеет место незавершенность конечных этапов биосинтеза углеводсодержащих биополимеров, подобно тому, как это описано при опухолях желудочно-кишечного тракта и мочевого пузыря. Показано также, что лектин аспарагуса может служить информативным маркером, позволяющим отличать высокодифференцированные почечно-клеточные карциномы (их клетки дают интенсивную реакцию с этим лектином) от низкодифференцированных {L.tetragonolobus — ареактивных) [146]. При использовании лектинов в качестве клеточных маркеров необходимо, однако, учитывать, что рецепторы отдельных лектинов, считающихся строго специфичными маркерами определенной популяции клеток, могут встречаться и в составе других клеточных популяций. Так, лектин утесника, признанный многими исследователями селективным гистохимическим маркером эндотелиоцитов человека, проявляет выраженное сродство к эпителиоцитам волосянных фолликулов, а также к гликоконъюгатам, накапливающимся в составе злокачественных клеток при опухолях толстой кишки, печени, почек - новообразованиях не эндотелиального происхождения [147].
Напротив, ряд опухолей эндотелиального генеза, характеризующихся особенно быстрым и агрессивным ростом, способность к связыванию лектина утесника утрачивает. В завершении целесообразно отметить, что, хотя маркирование лектинами дает возможность выявить начало патологического процесса, максимальной объективности можно достичь, сочетая лектины с моноклональными антителами или другими высокоспецифичными маркерами антигенных детерминант клетки. Анализ предоставленного материала позволяет заключить, что малейшие нарушения в жизнедеятельности клеток неизбежно отражаются на составе и характере распределения рецепторов фуколектинов поверхности клеточных мембран, что служит одним из наиболее ранних и объективных признаков патологии. Применение фукозоспецифичных лектинов обеспечивает получение надежной информации об изменениях состава и свойств гликоконъюгатов клеток и тканей в соответствии с характером и выраженностью многих патологических процессов, позволяет проводить раннюю диагностику ряда важных заболеваний человека, улучшить понимание их механизмов, а в ряде случаев — прогнозирование течения болезни и эффективности ее лечения. Наиболее ценными и перспективными в патологической диагностике фукозоспецифичными лектинами, в настоящее время представляются лектины утесника (U. europaeus Г), аспарагуса (L. tetragonolobus), гриффонии {G.simplisifolia ГУ), галлактии (G.tenuiflora), алеурии оранжевой (A. aurantia ), морского угря (A.anguilla), икры окуня (P.fluviatilis IT). Необходимо учитывать, что при ряде заболеваний гистохимические реакции с использованием лектинов по информативности превосходят традиционные методы гистохимии углеводов, а в некоторых случаях лектины являются более чувствительными и стабильными опухолевоспецифичными маркерами, чем моноклональные антитела к антигенным детерминантам клеток. Представляет интерес дальнейшее расширение исследований фуколектинов с целью определения их диагностической и прогностической ценности и вьшуске препаратов на их основе. Предметом исследования в настоящей работе являлся фуколектин икры окуня Perca fluviatilis, полученный аффинной хроматографией на иммобилизованном муцине кисты яичника человека группы крови Н(0) фирмой "Лектинотест" (Украина). По данным диск-электрофореза в ПААГ в щелочной среде (рН 8.6) лектин состоял из 5 отдельных белковых линий. При электрофорезе в ПААГ в присутствии Р-меркаптоэтанола была обнаружена одна зона с молекулярной массой 13 кДа. В отсутствии Р-меркаптоэтанола обнаружено несколько зон с молекулярными массами 13, 26, 40, и 52 кДа.
Методы исследования
Биологически активные олигосахариды выделяли из грудного молока человека. Грудное молоко хранили при -20. 1 литр молока центрифугировали (15 мин, 5000 об/мин), отделяли липидный слой с поверхности супернатанта, остаток липидов удаляли фильтрованием охлажденного до 0 супернатанта через стекловату. Белки осаждали добавлением равного объема холодного ацетона. Раствор оставляли на 50 часов при температуре 4С. Основную часть раствора отделяли от белкового осадка декантацией, остаток центрифугировали (20 мин, 5000 об/мин). Раствор концентрировали до 1/10 от начального объема на роторном испарителе при температуре не более 30С. Полученный концентрированный раствор (70 мл) обессоливали на Sephadex G-15 (М) в 0.05 М пиридин-ацетатном буфере со скоростью 1.2 мл/мин. На этой стадии отделяли большую часть лактозы от других олигосахаридов. Углеводы детектировали по реакции с фенол-серной кислотой, соли (СГ) определяли с помощью раствора AgN03. Фракции содержащие углеводы и не содержащие (СГ), объединяли, упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве воды. Нейтральные олигосахариды отделяли от сталированных на ионообменной смоле Dowex 1x8 (200X400 меш). Нейтральные олигосахариды элюировали 200 мл воды, со скоростью 5 мл/мин. Полученный раствор нейтральных олигосахаридов упаривали досуха, растворяли в 30-35 мл воды и разделяли гель-хроматографией на тандеме Toyopearl HW-40 (S), 50 х 900 мм + Bio-Gel Р-4 (Bio-Rad, США), 50x800 мм в 0.05 М пиридин-ацетатном буфере, со скоростью 1.25 мл/мин. Собирали фракции по 50 мл. Каждую фракцию рехроматографировали на той же колонке и далее делили с помощью ВЭЖХ на 3 колонках Separon SGX NH2 5мкм, (100 мг на 1 деление) в 60 % ацетонитриле со скоростью 1 мл/мин в изократическом режиме. Детекцию осуществляли с помощью рефрактометра R-401. Из полученных фракций отбирали три-, тетра-, пента- и гексасахаридную. Фракции упаривали досуха, растворяли в 10 мл воды и лиофилизовали. Каждую фракцию делили с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ в воде на тандеме из колонок (8x250 мм) Silasorb СІ8 на хроматографе Gilson модель 305 (Франция). Детекцию осуществляли с помощью рефрактометра модель 131 (Gilson). Из фракции 1 получали 2 -фукозиллактозу, из 2 - лакто-Ы-тетраозу, из 3 - лакто-Ы-фукопентаозу I, II и III, из 4 - лакто-N-дифукогексаозу I. Каждый олигосахарид рехроматографировали.
Олигосахариды упаривали досуха, дважды лиофилизовали из D2O (99.9 %) и растворяли в 0.45 мл. 99.96 % D2O. Структуру олигосахаридов подтверждали с помощью Н-ЯМР на спектрометре. Ш.2.2 СИНТЕЗ НЕОГЛИКОПРОТЕИНОВ Конъюгацию олигосахаридов с БСА проводили методом восстановительного аминирования [148]. Олигосахарид, БСА, цианоборогидрид натрия в соотношении (мкМ ) 290:1:1600 растворяли в 5 мл 0.2 М боратного буфера, рН 9. Реакцию проводили при 45С 30 ч. Далее раствор доводили 80%-ной уксусной кислотой до рН 3.5 - 4, диализовали против воды и лиофилизовали. Углеводы анализировали по методу Дюбуа с соавт. [151], используя в качестве стандарта 0-(+)-лактозу. Ш.2.3 ПОЛУЧЕНИЕ НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА СЕНСИБИЛИЗИРОВАННОГО ЛИГАНДОМ Ш.2.3.1 Приготовление коллоидного золота с диаметром частиц 17- 20нм (Аи17) [152]. 1 мл 1%-ного раствора НАиСЦ добавляли к 100 мл бидистиллированной воды в колбе Эрленмейера. Раствор нагревали до кипения, добавляли 3 мл 1%-ного раствора трехзамещенного цитрата натрия. Нагревание продолжали на уровне слабого кипения. Окраска раствора менялась от серой до фиолетовой, а затем до красной. Полученный коллоидный раствор охлаждали и добавляли азид натрия до концентрации 0.02%. Ш.2.3.2 Приготовление коллоидного золота с диаметром частиц 35-40нм (Аи40) [153]. 1 мл 1%-ного раствора HAuCLj добавляли к 100 мл бидистиллированной воды в колбе Эрленмейера. Раствор нагревали до кипения, добавляли 1 мл 1%-ного раствора трехзамещенного цитрата натрия. Нагревание продолжали на уровне слабого кипения. Окраска раствора менялась от серой до фиолетовой, а затем до вишневой. Полученный коллоидный раствор охлаждали и добавляли азид натрия до концентрации 0.02%. Ш.2.3.3 Определение оптимального количества лиганда и рН раствора необходимого для стабилизации комплекса с коллоидным золотом [153]. Лиганд растворяли в бидистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл. Готовили серию растворов коллоидного золота по 0.5 мл с различным значением рН, добавляли к аликвоте лиганда в 100 мкл. Через 30 мин в каждую пробирку добавляли 100 мкл 10% NaCl. При оптимальном значении рН цвет раствора не изменялся . Готовили серию разведений лиганда по 100 мкл. Доводили золь золота до необходимого рН (часто равной или на 0.5 единиц выше pi конъюгированного белка ). К каждой аликвоте лиганда добавляли 0.5 мл коллоидного золота.
Через 30 мин в каждую пробирку добавляли 100 мкл 10% NaCl. При оптимальной концентрации лиганда цвет раствора не менялся. Ш.2.3.4 Получение комплексов с коллоидным золотом 100 мл коллоидного золота Аи17 доводили до необходимой рН добавлением 0.1 М К2СО3. Неогликопротеин или лектин растворяли в бидистиллированной воде (1 мл), фильтровали и добавляли к золю золота. Через 10 мин образовавшийся комплекс стабилизировали добавлением 2 мл 1%-ного ПВП и коллоид центрифугировали при 10000 g 1.5 ч для отделения от непрореагировавшего белка и концентрирования комплекса. Бесцветный супернатант удаляли, осадок суспензировали в 5 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 6.5, содержащего 20% этиленгликоля и 0.02% азида натрия. Растворяли N-гидроксисукцинимидное производное биотина в ДМФА до концентрации 1 мг/мл. Готовили раствор белка: 1 мг/мл в 0,1 М ЫаНСОз рН9. Смешивали два раствора в соотношении 1:8 (белок : активированный биотин) и инкубировали при н.у. 4 часа. Проводили диализ против фосфатного буфера, лиофилизовали. Высокомолекулярную фракцию белков яда скорпиона проверяли на взаимодействие с маннозоспецифичным лектином семян канавалии (Con А). Процедуру обнаружения локализации лектина на мембране проводили с помощью пероксидазы. Благодаря поливалентности, Con А может связываться с маннозосодержащими гликопротеинами и затем с пероксидазой, которая вследствии высокого содержания маннозных цепей обладает сродством к лектину. Юмкл раствора белка (1мг/мл в 10 мМ трис-HCl, рН 7.5) наносили на мембрану и оставляли до полного высыхания. Далее мембрану промывали буфером А и проводили блокирование буфером Б при комнатной температуре 1 час. Мембрану обрабатывали буфером А 15 мин с тремя сменами буфера и помещали в раствор Con А (50 мг/мл в буфере А) на 1 час, затем промывали буфером А и инкубировали мембрану в растворе пероксидазы (50 мг/мл в буфере А ) 90 мин. Для прокрашивания, мембрану помещали в раствор субстрата: 2% о-фенилендиамин в метаноле (150 мкл), 50 мМ трис-HCl, рН 7,5 (5 мл), 30% Н2О2 (50 мкл). Через 30 мин мембрану промывали в дистиллированной воде и высушивали на воздухе. I Количественную преципитацию проводили по известной методике [150]. Все эксперименты повторяли трижды; для графического представления результатов использовали средние значения величин. Различные количества неогликопротеина от 0 до 150мкг, смешивали с 50 мкл (50мкг) лектина икры окуня в общем объеме 100 мкл фосфатного буферного раствора рН 7.2. После инкубирования при н.у. 24 часа, образованный преципитат центрифугировали при 5000 об/мин 15мин, промывали трижды холодным фосфатным буферным Р раствором, растворяли в 150 мкл 0.05N NaOH, и анализировали содержание белка бицинхонинатом натрия [154].
