Введение к работе
Актуальность темы. Исследования нейрорецепторов на молекулярном уровне с 1970-х годов являются бурно развивающейся областью физико-химической биологии. Одним из важнейших семейств нейрорецепторов являются лигандоуправляемые ионные каналы; наиболее изученным их представителем является никотиновый ацетилхолиновый рецептор постсинаптической мембраны. За прошедшие три десятилетия для изучения молекулярной структуры этого рецептора (в частности, рецепторного белка из электрического органа Torpedo) были использованы практически все существующие биохимические и физико-химические методы. Однако размер (-270 кДа) и сложность этого белка ограничивают как приложимость к нему многих высокоразрешающих методов (таких, как рентгеноструктурный анализ, спектроскопия ЯМР. избирательная химическая модификация), так и характер получаемой информации. Поэтому на сегодняшний день разумным компромиссом между интегративным и редукционистским подходами представляется более детальное биохимическое и физико-химическое изучение отдельных компонентов и доменов (таких, как изолированные субъединицы и достаточно протяженные фрагменты) этого рецептора; такой подход можно считать довольно плодотворным в приложении и к другим мембранным белкам.
Цель работы. Настоящая работа является частью проводимых в Институте биоорганической химии им М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН комплексных структурно-функциональных исследований никотинового ацетилхолинового рецептора. Цель работы состояла в изучении конформации. а также структурных основ лиганд-рецепторного взаимодействия у функциональных доменов нАХР Torpedo californica. При этом решались следующие задачи: 1) характеристика рекомбинантных и синтетических фрагментов рецептора, разработка условий очистки и ренатурации рекомбинантных фрагментов ccl-209 (N-концевой внеклеточный домен) и 5313-455 ("цитоплазматическая петля" и спираль МА); 2) исследование с помощью спектроскопии КД вторичной структуры фрагментов в различных условиях; 3) изучение взаимодействия а-нейротоксинов и холинэргических лигандов с фрагментами а-субъединицы нАХР с помощью спектральных методов.
Научная новизна. Разработаны условия очистки и ренатурации рекомбинантных белков, включающих остатки 1-209 а-субъединицы или 313-455 5-субъединицы нАХР Г.californica. С помощью спектроскопии КД впервые даны количественные оценки содержания вторичных структур
- г -
в изолированных вне- и внутриклеточном доменах нАХР, изучены эффекты детергентов и органических растворителей на конформацию этих рекомбинантных фрагментов. Посредством сопоставления спектральных данных для фрагментов с таковыми для интактного рецептора впервые продемонстрирована адекватность использования изолированных доменов в качестве моделей для изучения пространственной структуры нАХР. Для домена al-209 с помощью спектрофлюориметрии зарегистрированы изменения в микроокружении остатков Тгр при связывании лигандов.
Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на 3-х чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва-Пущино. 1996). Международном конгрессе по аналитической химии (Москва. 1997) и 16-й конференции Международного нейрохимического общества (Бостон. США. 1997).
По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных (гл. 1), изложения полученных результатов и их обсуждения (гл. 2), экспериментальной части (гл. 3). выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит {2. страниц и включает № рисунков и JL таблиц; список литературы насчитывает 2.6/ наименований.
