Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Макролиды 11
1.1.1. Биологическая активность и механизм действия макролидов 15
1.1.2. Биосинтез макролидов 20
1.1.3. Комбинаторный биосинтез 28
1.2. Генерация и виртуальный скрининг библиотек химических структур 29
1.2.1. Способы описания химической структуры 32
1.2.2. Методы отбора структур 34
1.2.3. Виртуальные библиотеки поликетидов и их скрининг 38
Глава 2. Материалы и методы 43
Глава 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Компьютерная программа Biogenerator для генерации виртуальных библиотек макролидов и описаний синтезирующих их ферментативных, систем 54
3.2. База данных по структурным формулам макролидов и соответствующим им биологическим активностям 63
3.3. Прогноз биологической активности макролидов 66
3.3.1. Оценка точности прогноза биологической активности макролидов для различных обучающих выборок 66
3.3.2. Оценка точности прогноза биологической активности макролидов на тестовой выборке 73
3.3.3. Оценка точности прогноза биологической активности полусинтетических аналогов эритромицина 77
3.4. Генерация и скрининг виртуальной библиотеки аналогов эритромицина 80
Заключение 89
Выводы 90
Список работ, опубликованных по теме диссертации .91
Список литературы 94
Приложение 109
- Биологическая активность и механизм действия макролидов
- Генерация и виртуальный скрининг библиотек химических структур
- Прогноз биологической активности макролидов
- Оценка точности прогноза биологической активности полусинтетических аналогов эритромицина
Введение к работе
Среди применяемых в настоящее время лекарственных средств большую группу составляют природные соединения и их производные. Примерно 50% принципиально новых препаратов (New Chemical Entity), открытых с 2000 по 2006 годы, являются природными соединениями [1].
Макролиды - это одна из групп природных соединений, общей структурной особенностью которых является наличие макролактонового кольца. Число атомов в макролактоновом кольце варьирует от 8-ми до 62-х у различных соединений. К группе макролидов относятся антибиотики (например, эритромицин и кларитромицин), противогрибковые средства (нистатин, амфотерицин), противоопухолевые средства (эпотилон), иммуносупрессанты (FK506, рапамицин) противопаразитарные (авермектин) и др. [2]. Благодаря структурному разнообразию и многообразию проявляемых биологических эффектов, макролиды являются перспективной группой веществ для поиска среди них новых биологически активных соединений. Особенно актуален поиск новых антибиотиков в связи с развитием резистентности бактерий к уже существующим лекарствам.
В настоящее время поиск новых биологически активных макролидов осуществляется тремя путями: 1) скрининг биологических образцов; 2) химический синтез/модификация известных соединений; 3) модификация бактерий-продуцентов методами генной инженерии, приводящая к синтезу ими новых веществ. Последний подход активно развивается в последние годы и получил название «комбинаторный биосинтез» [3].
Разработка и применение методов комбинаторного биосинтеза стали возможны благодаря расшифровке механизма синтеза макролидов. Макролактоновое кольцо макролидов синтезируется из небольших
углеродных фрагментов посредством повторяющихся реакций
конденсации, подобно биосинтезу жирных кислот [4]. Этот процесс
катализируется модульными поликетидсинтазами (поликетидсинтазами
типа I). Модульные поликетидсинтазы (PKS) являются ферментативными
системами, состоящими из нескольких белков. Каждый белок имеет
доменное строение, и соответственно, несколько центров, обладающих
разными каталитическими активностями. Группа доменов, отвечающая за
один цикл конденсации, образует «модуль» [5]. Количество модулей в PKS
и набор доменов в каждом модуле определяют химическую структуру
синтезируемого данной ферментативной системой макролактонового
кольца. Образовавшееся в результате работы PKS макролактоновое кольцо
обычно подвергается пост-поликетидным модификациям
(гидроксилирование, гликозилирование, ацилирование и др.), в результате чего окончательно формируются структура и биологические функции синтезируемой молекулы.' Нуклеотидные последовательности 'генных кластеров многих модульных PKS, в частности, отвечающих за синтез эритромицина, нистатина, пимарицина, амфотерицина, кандицидина, полностью определены. Разработаны также методы генетических манипуляций с продуцирующими их микроорганизмами [6]. Полностью охарактеризованы генные кластеры, отвечающие за синтез авермектина [7], спинозина [8, 9], мицинамицина [10], сорафена [11]. Методами комбинаторного биосинтеза можно изменять количество и набор доменов и модулей в PKS, влиять на пост-поликетидные модификации макролактонового кольца, и, таким образом, изменять структуру синтезируемого PKS макролида.
Теоретически методами комбинаторного биосинтеза можно получить огромное количество новых макролидов [12], однако провести генно-инженерные эксперименты по получению такого большого числа
микроорганизмов-продуцентов невозможно. Также заранее неизвестно, будут ли синтезируемые ими вещества проявлять требуемую биологическую активность. Таким образом, является актуальной разработка компьютерного метода, позволяющего отбирать среди множества возможных вариантов макролидов структуры с требуемыми свойствами и определять состав необходимых для их биосинтеза ферментативных систем.
В настоящее время в литературе описано две попытки использования компьютерных методов для рационального поиска новых соединений из группы макролидов. Siani М.А. и соавторы провели генерацию виртуальных библиотек макролидов с размером макролактонового кольца 12 и 14 атомов, для отбора агонистов рецепторов мотилина они использовали модель фармакофора [13]. Adalsteinsson Н. и соавторы провели генерацию аналогов рапамицина и отобрали среди них методом докинга структуры, способные связываться с белком FKBP12 [14]: В этих работах генерация структур ограничивалась аналогами определенных макролидов, а в основе алгоритма отбора лежал механизм действия базового вещества. Gonzalez-Lergier J. и соавторы описывают метод генерации структур поликетидов и последовательностей ферментов в PKS типа I, который позволяет получить все возможные молекулы. Однако генерируемые структуры не замкнуты в цикл, и поэтому значительно отличаются от поликетидов, продуцируемых бактериями в живой природе [12].
Предлагаемый нами подход состоит в генерации in silico структур макролидов в соответствии с механизмом их биосинтеза и последующем анализе полученных виртуальных библиотек на основе компьютерного предсказания биологической активности. Такой анализ позволяет предварительно отобрать наиболее перспективные вещества, согласно
прогнозу обладающие требуемыми фармакодинамическими свойствами. Для структур макролидов определяется количество модулей, их последовательность и набор доменов в каждом модуле PKS типа I, которые обеспечивают синтез отобранных соединений, то есть конструируется ферментативная система, необходимая для биосинтеза определенной структуры. Предлагаемый метод может существенно сократить число экспериментов и повысить эффективность поиска новых биологически активных макролидов.
Цель исследования
Разработка метода конструирования in silico ферментативных систем синтеза макролидов, генерации соответствующих комбинаторных библиотек вторичных метаболитов и отбора тех вариантов ферментативных систем, которые обеспечивают получение веществ с заданным профилем биологической активности.
Задачи исследования
Создание компьютерной программы для генерации виртуальных библиотек структурных формул макролидов и описаний синтезирующих их ферментативных систем.
Создание базы данных, содержащей информацию о структуре и биологической активности макролидов.
Оценка применимости используемого метода прогноза биологической активности для предсказания биологической активности макролидов.
Апробация предложенного метода на примере генерации и скрининга виртуальной библиотеки аналогов эритромицина.
Научная новизна
Предложен оригинальный подход к конструированию доменного состава ферментативных систем, обеспечивающих синтез новых макролидов с требуемым профилем биологический активности.
Впервые создана компьютерная программа Biogenerator, позволяющая генерировать виртуальные библиотеки структур макролидов и описания синтезирующих их ферментативных систем.
Впервые создана база данных, содержащая информацию о структуре и видах биологической активности более 1000 макролидов.
Практическая значимость
Предложенный метод обеспечивает возможность конструирования новых биологически активных структур макролидов и необходимых для их биосинтеза последовательностей доменов в модульных PKS. Сконструированные ферментативные системы могут быть реализованы в бактериях-продуцентах с помощью методов генной инженерии. Описанный метод дает возможность рационального планирования генно-инженерных экспериментов по модификации бактерий-продуцентов макролидов. Применение описанного подхода позволит значительно сократить число экспериментов по получению структур макролидов и тестированию их биологической активности и, следовательно, существенно снизить временные и финансовые затраты при поиске новых лекарственных препаратов группы макролидов.
Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:
Московская международная конференция "Биотехнология и медицина", Москва, 2006.
14-я Международная конференция «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Словакия, Низкие Татры, 2006.
IV Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007.
Научная конференция ГУ НИИ БМХ РАМН, Москва, 2007.
4-ый Международный симпозиум «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы (CMTPI-2007)», Москва, 2007.
Биологическая активность и механизм действия макролидов
Макролиды обладают различными видами биологической активности: антибактериальной, противогрибковой, антипаразитарной, иммуносупрессорной, противоопухолевой и др. [2].
Антибактериальные макролиды широко используются в клинической практике с начала 1950-х годов. Эритромицин - классический представитель антибиотиков группы макролидов - был выделен McGuire и коллегами из Streptomyces erythreus в 1952 году [18]. К этой группе относят природные антибиотики (эритромицин, олеандомицин, спирамицин и др.) и ряд полусинтетических макролидов (рокситромицин, кларитромицин, азитромицин и др.) с размером макролактонового кольца 14-16 атомов углерода [19]. Клиническое применение обусловлено активностью макролидов в отношении грамположительных кокков и внутриклеточных возбудителей (микоплазмы, хламидии, кампилобактеры, легионеллы). Макролиды относятся к числу наименее токсичных антибиотиков [20].
Биологическое действие неполиеновых макролидных антибиотиков обусловлено нарушением синтеза белка на этапе трансляции в клетках чувствительных микроорганизмов (рис. 2). Молекула антибиотика способна обратимо связываться с каталитическим пептидил-трансферазным центром (P-site) рибосомальной 508-субъединицы и вызывать отщепление комплекса пептидил-тРНК (представляющего собой растущую пептидную цепь) от рибосомы. При этом нарушается цикличность последовательного присоединения пептидной цепи к пептидил-трансферазному центру (P-site) и акцепторному аминоацил-тРНК-центру (A-site) бОБ-субъединицы, то есть ингибируются реакции транслокации и транспептидации. В результате приостанавливается процесс формирования и наращивания пептидной цепи. Связывание макролидов с 508-субъединицей возможно на любой стадии рибосомального цикла [21, 22].
Макролиды, обладающие антибактериальной активностью, в основном хорошо переносятся пациентами, их побочные эффекты связаны с влиянием на желудочно-кишечный тракт. Наиболее серьезным побочным эффектом, наблюдаемым при приеме всех форм эритромицина, является холестаз [23]. Прием эритромицина может приводить к повышению уровня сывороточных трансаминаз и развитию холестатического гепатита. Механизм развития повреждения печени в результате приема эритромицина не ясен: показано, что эритромицин не ингибирует транспорт желчных кислот (таурохолевой кислоты) [24]. У части пациентов наблюдаются тошнота и рвота, сопровождающиеся болью в животе. Степень выраженности этих побочных эффектов варьирует у разных антибиотиков. В основном, макролиды последних поколений, такие как азитромицин, кларитромицин, рокситромицин, лучше переносятся и вызывают меньше побочных эффектов, чем эритромицин. Описанные выше побочные эффекты эритромицина связывают с тем, что он является ингибитором рецепторов мотилина, и, следовательно, усиливает моторику желудочно-кишечного тракта. Азитромицин и кларитромицин также усиливают моторику, тогда как макролиды, с размером макролактонового кольца 16 атомов, (ацетилспирамицин, джозамицин, мидекамицин, спирамицин и др.) мало влияют на нее или не влияют вовсе [23]. Эритромицин также вызывает удлинение интервала QT на кардиограмме, т.е. увеличение рефрактерного периода предсердий и желудочков. Это опасно для пациентов с заболеваниями сердца или при приеме эритромицина одновременно с лекарствами, которые увеличивают время реполяризации желудочков. Введение высоких доз эритромицина внутривенно может вызвать фибрилляцию и мерцание желудочков [23].
Противогрибковой активностью обладают главным образом полиеновые макролиды: амфотерицин В, нистатин, кандицидин; пимарицин и их производные. Три первых антибиотика имеют 38-ми членное макролактоновое кольцо, пимарицин - 26-ти членное. В соответствии с классификацией полиенов, амфотерицин В и кандицидин — гептаены, пимарицин и нистатин - тетраены. Участок макролактонового кольца, содержащий сопряженные двойные связи, называют хромофорной областью. Хромофорная область является гидрофобной частью молекулы. Напротив нее в макролактоновом кольце расположены полярные группы карбонильные, гидроксильные, эпоксидные - полиольная цепь. Такая молекулярная организация обуславливает взаимодействие противогрибковых полиеновых макролидов с другими биологическими молекулами и механизм их действия. Еще одной общей структурной особенностью большинства противогрибковых полиенов является участок макролактонового кольца, содержащий восемь атомов углерода (С8), который соединен с хромофорной областью и формирует полукеталь. С этим участком связано несколько структурных групп, важных для проявления полиенами биологической активности. Во-первых, это аминосахар, который связан с первым после хромофорного участка углеродом гликозидной связью. В большинстве гликозилированных полиенов аминосахаром является микозамин, некоторые полиены содержат вместо него перозамин. Вторая функционально важная группа -карбоксильная, которая связана с четвертым атомом углерода, считая от хромофорной области. Эта карбоксильная группа и аминогруппа микозамина ионизированы, поэтому та часть молекулы, к которой они-присоединены, слабо полярна. Ионизированные группы полиенов участвуют как в меж- так и во внутримолекулярных взаимодействиях, что важно для механизма действия антибиотиков. Часть молекулы полиенового макролида, расположенная напротив участка С8, обычно гидрофобна, нередко она содержит метальные или ароматические группы. В итоге, химическую структуру типичной молекулы гликозилированного полиена можно описать как макролактоновое кольцо, имеющее полярную гидрофильную «головку», гидрофобный «хвост», хромофорную и полиольную цепи, расположенные друг напротив друга [25]. Характерной особенностью макролактонового кольца является наличие полукетальной связи в полярной «головке». Полиеновый участок обеспечивает конформационную жесткость макролактонового кольца [26].
Генерация и виртуальный скрининг библиотек химических структур
В настоящее время в Chemical Abstracts Service зарегистрировано 107 соединений (http://www.cas.org), около 104 в World Drug Index (http://scientific.thomson.com/products/wdi/), 107 в базе данных коммерчески доступных образцов химических соединений ChemNavigator (http://www.chemnavigator.com/cnc/products/iRL.asp). Оценки числа молекул, которые теоретически могут быть синтезированы, варьируют от 10 до 10" [55-58]. Даже с помощью современных экспериментальных методов, таких как комбинаторная химия или высокопроизводительный скрининг, невозможно синтезировать и протестировать все возможные молекулы. Для отбора ограниченного количества наиболее перспективных образцов используют методы компьютерного конструирования лекарств, в частности виртуальный скрининг.
Виртуальный скрининг (ВС) основан на использовании вычислительных методов для поиска в базах данных структур, обладающих требуемой биологической активностью. Для виртуального скрининга используют как базы данных реально существующих соединений (например, собственные базы фармацевтических компаний, базы данных коммерчески доступных образцов химических соединений), так и виртуальные библиотеки химических структур.
Под виртуальной библиотекой понимается набор химических структур, которые теоретически могут быть синтезированы из конкретных исходных веществ с помощью определенных реакций [59]. Существуют компьютерные программы для генерации виртуальных библиотек химических структур, например SMOG [60], MOLGEN [61]. Разработан также ряд программ, например CombiGlide (Schrodinger), позволяющих одновременно генерировать библиотеки структур и проводить их виртуальный скрининг.
Выделяют два основных подхода к виртуальному скринингу соединений - основанный на структуре мишеней и основанный на структуре лигандов. Использование методов, основанных на структуре мишени, возможно при наличии информации о трехмерной структуре макромолекулы-мишени. С помощью этих методов можно найти соединения, которые комплементарны целевому участку на поверхности белка-мишени с учетом структурных и физико-химических свойств поверхности [62]. Методы виртуального скрининга на основе структуры лигандов основаны на анализе наборов известных лигандов с требуемой биологической активностью. Кроме того, фильтрация библиотек соединений проводится на основании оценок физико-химических свойств, лекарственного подобия («drug-likeness»), и других характеристик молекул.
Для описания молекулярной структуры разработано множество дескрипторов, которые заметно различаются по сложности. Дескрипторы часто делят на ID, 2D, 3D, в зависимости от «размерности» используемого представления молекулы [63], или, по структуре самого дескриптора, на скалярные, линейные, нелинейные [64]. Разработаны также 4D и 5D дескрипторы [65, 66]. В обзоре Pozzan А. выделены следующие группы дескрипторов: простые 1D/2D дескрипторы; 2D/3D «отпечатки пальцев»; фармакофоры; универсальные дескрипторы; дескрипторы, описывающие форму и поверхность [67]. Рассмотрим различные виды дескрипторов более детально.
Простые дескрипторы подсчитывают, исходя из молекулярной формулы (например, молекулярный вес и число атомов) или структуры молекулы (например, подструктурные фрагменты, число фрагментов, топологические индексы). В качестве простых дескрипторов также используют некоторые вычисленные физико-химические свойства (Log Р, площадь полярной поверхности). Простые дескрипторы используют, например, при фильтрации библиотек соединений на основе «правила пяти» Липинского [68]. Согласно «правилу пяти», плохой биодоступностью при пероральном введении обладают вещества, у которых молекулярный вес 500, CLogP 5, число доноров водородной связи 5, число акцепторов водородной связи 10.
«Отпечатки пальцев» представляют собой битовую строку. В простейших отпечатках каждая позиция двоичного разряда отвечает за наличие или отсутствие определенного фрагмента молекулярной структуры. Примером этого типа отпечатков являются ключи MACCS (MDL). Ограничением любого подхода, основанного на словаре фрагментов, является то, что в тестовой молекуле могут быть определены только занесенные в каталог фрагменты. Это может препятствовать распознаванию уникальных структурных мотивов. Для преодоления этого недостатка были разработаны «хешированные» отпечатки, в которых не используется словарь фрагментов. Например, отпечатки Daylight (Daylight Chemical Information Systems, Inc.) и Tripos Unity (Tripos, Inc.).
В трехмерных фармакофорных отпечатках каждая позиция двоичного разряда обычно описывает наличие или отсутствие в молекуле одного возможного размещения заранее определенного 3-х или 4-х точечного фармакофора, и эти отпечатки часто состоят из миллионов бит [69, 70].
Прогноз биологической активности макролидов
Для оценки результатов применения предложенного подхода для поиска новых биологически активных макролидов необходимо синтезировать и протестировать достаточно большое количество соединений. В то же время, методами генной инженерии можно получить лишь небольшое количество бактериальных штаммов, которые будут продуцировать отобранные соединения. Это весьма длительный процесс, причем экспериментальных данных будет заведомо недостаточно для статистически значимого заключения о пригодности предложенного метода. В связи с этим, валидация метода возможна только на известных из литературы экспериментальных данных.
Нами была проведена оценка применимости программы PASS для предсказания биологической активности макролидов на независимой тестовой выборке из 242 природных макролидов с экспериментально исследованной биологической активностью. Выборка была составлена на основе базы данных Dictionary of Natural Products (DNP). В тестовую выборку включены вещества, которые относятся к группе «Macrolide polyketides» и «Polyenes» по классификации этой базы данных.
Результаты предсказания биологической активности для тестовой выборки из 242 структур природных макролидов представлены в таблице 5. Таблица 5 содержит данные о количестве соединений в тестовой выборке и обучающей выборке PASS, проявляющих тот или иной вид активности в эксперименте, а также оценку точности прогноза (IAP) для каждой активности. Вычисление IAP для обучающей выборки проводилось в режиме скользящего контроля с исключением по одному.
В обучающей выборке PASS содержится 33 структуры из тестовой выборки, однако при выполнении прогноза для каждого из этих соединений соответствующие данные исключались из обучающей выборки (см. описание алгоритма программы PASS в гл. «Материалы и методы»).
Из представленных в таблице 5 данных видно, что для обучающей выборки все виды активности прогнозируются с высокой точностью: от 77,5% (антагонист интерлейкина 1) до 99,7% (стимулятор протеинкиназы С). Для тестовой выборки виды активности, для которых известно достаточно большое количество соединений, прогнозируются с приемлемой точностью: от 63,4% (антибиотик) до 99,8% (противопаразитарная). Исключением является иммуносупрессорная активность (48,4%). Оценка точности прогноза для активностей, представленных небольшим количеством соединений, не является статистически достоверной и может варьировать в широких пределах. Это подтверждается приведенными в таблице 5 данными: точность прогноза варьирует от 0,8% (ингибитор синтеза белка) до 100% (ингибитор синтеза холестерина).
Из таблицы 5 следует, что средняя точность прогноза по всем прогнозируемым видам активности для тестовой выборки, состоящей только из макролидов, составляет 75,5%. Средняя точность прогноза для обучающей выборки, включающей соединения разных классов — 89,4%. Таким образом, даже для тестовой выборки, состоящей из близких по структуре соединений, PASS позволяет прогнозировать различия в спектре активности с приемлемой точностью.
Макролиды природного происхождения часто модифицируют химически для улучшения их фармакодинамических и фармакокинетических характеристик. На основе эритромицина было получено множество полусинтетических производных (рокситромицин, кларитромицин, азитромицин и др.). Нами была проведена оценка применимости программы PASS для предсказания биологической активности полу синтетических аналогов эритромицина на независимой тестовой выборке, содержащей 612 соединений из базы данных MDDR.
В таблице 6 представлены данные о количестве соединений в тестовой выборке, проявляющих тот или иной вид активности в эксперименте, а также оценки точности прогноза (IAP) для каждой, активности. Всего с помощью программы PASS возможен прогноз 27 видов активности, известных для соединений из тестовой выборки.
Оценка точности прогноза биологической активности полусинтетических аналогов эритромицина
Для апробации разработанного подхода мы сгенерировали виртуальную библиотеку аналогов эритромицина с помощью программы Biogenerator и провели ее компьютерный скрининг.
Генерация аналогов эритромицина была выполнена при следующем наборе параметров: пропионат в качестве стартового блока, 6 модулей расширения, гликозилирование кладинозой по 3-му атому углерода, гликозилирование десозамином по 5-му атому углерода, гидроксилирование по 6-му и 12-му атомам углерода. Выбор параметров генерации обусловлен строением и механизмом синтеза эритромицина (см. главу «Обзор литературы», раздел 1.1.2). Полученная виртуальная библиотека состоит из 3072 структур.
Для сгенерированных структур был выполнен прогноз спектров биологической активности с помощью программы PASS. Результаты прогноза были проанализированы с помощью программы PharmaExpert. Были отобраны те виды активности, вероятность проявления которых выше 70% (Ра 0,7) хотя бы для одной структуры.
В таблице 7 приведен список отобранных видов активности и количество структур из сгенерированной виртуальной библиотеки, для которого был предсказан данный вид активности, а также ссылка на публикации, в которых описано экспериментальное подтверждение данного вида активности для эритромицина или его аналогов.
С вероятностью более 70% были предсказаны такие известные для эритромицина и его аналогов виды активности как «Антибактериальная», «Антибиотик», «Антибиотик макролидного ряда», «Ингибитор синтеза белка», «Ингибитор 50s субъединицы рибосомы». Помимо этого, был предсказан ряд видов активности, которые были экспериментально открыты в последние годы для эритромицина и его аналогов и не связаны с его антибактериальной активностью. В частности, такие экспериментально подтвержденные виды активности как «Антагонист HERG каналов» (HERG channel antagonist) [105, 106] и «Удлинение интервала QT» (QT interval prolongation) [99], «Субстрат CYP3A» и «Субстрат CYP3A4» (CYP3A substrate, CYP3A4 substrate) [107, 108], «Противопротозойная» (Antiprotozoal (Toxoplasma)) [104], «Гепатотоксическая» (Hepatotoxic) [23], «Вещество для лечения дискинезии» (Antidyskinetic) [ПО, 111], «Стимулятор моторики желудочно-кишечного тракта» (Gastrointestinal motility stimulant) [ПО, 111], «Антириккетсиозная» (Antirickettsial) [112], «Иммуносупрессант» (Immunosuppressant) [114], «Ингибитор ГДФ-маннозы 6-дегидрогеназы» (GDP-mannose 6-dehydrogenase inhibitor) [115], «Противомикоплазменная» (Antimycoplasmal) [23], «Антагонист фактора некроза опухоли альфа» (Tumour necrosis factor alpha antagonist) [113], «Антагонист интерлейкина 1» (Interleukin 1 antagonist) [120]. Наличие в спектре прогноза токсической активности (Toxic) объясняется тем, что в процессе обучения программы PASS эта активность автоматически приписывается всем соединениям обучающей выборки, для которых известна гепатотоксическая активность. Для 32 аналогов эритромицина предсказана противоопухолевая активность. Недавнее изучение рокситромицина, аналога эритромицина, показало, что он ингибирует ангиогенез in vivo [118]. Другое производное эритромицина, кларитромицин, индуцирует апоптоз в мышиных клетках В-клеточной лимфомы [119].
Для некоторых прогнозируемых видов активности в доступной литературе не было найдено экспериментального подтверждения. В частности, для таких предсказанных PASS видов биологической активности как «Субстрат Р-гликопротеина» (P-glycoprotein substrate), «Противопаразитарная» (Antiparasitic), «Ингибитор синтеза холестерина» (Cholesterol synthesis inhibitor), «Ингибитор транспортной ЬҐ двухсекторной АТФазы» (ЬҐransporting two-sector ATPase inhibitor), «Противогрибковая» (Antifungal), «Ингибитор КҐ экспортной АТФазы» (H -exporting ATPase inhibitor), «Ингибитор T клеток» (Т cell inhibitor), «Отхаркивающее средство» (Expectorant), «Антагонист потенциалзависимых калиевых каналов» (Potassium channel (Voltage-sensitive) antagonist). Поскольку такие виды активности были предсказаны только для некоторых структур из сгенерированной комбинаторной библиотеки, возможно они специфичны для этих соединений и никогда не проверялись для известных аналогов эритромицина.
Далее мы провели компьютерный скрининг библиотеки аналогов эритромицина. Эритромицин сравнительно хорошо переносится пациентами, наиболее серьезным побочным эффектом, наблюдаемым при приеме всех форм эритромицина, является холестаз [23]. Прием эритромицина может приводить к повышению уровня сывороточных трансаминаз и развитию холестатического гепатита. Механизм развития повреждения печени в результате приема эритромицина не ясен: показано, что эритромицин не ингибирует транспорт желчных кислот (таурохолевой кислоты) [24]. Был проведен поиск аналогов эритромицина, для которых вероятность проявления гепатотоксической активности наименьшая.
Использовалась сгенерированная ранее библиотека из 3072 аналогов эритромицина. Отбор соединений проводили при значениях Ра 0,8 для активности «Антибактериальная» и Ра 0,6 для активности «Гепатотоксическая». Инвариантная точность прогноза гепатотоксической активности составляет 75,9%, антибактериальной - 91,9%.
В результате было отобрано 17 аналогов эритромицина, удовлетворяющих заданным критериям. В таблице 8 приведены значения Ра и Pi для антибактериальной и гепатотоксической активностей эритромицина и его аналогов, а также отношение значений Ра для этих видов активности.
Из таблицы 8 видно, что наименьшее значение Ра для гепатотоксической активности при наибольшем значении Ра для антибактериальной активности прогнозируется для молекулы № 2456. В соответствии с результатами предсказания, вероятность проявления гепатотоксичности для молекулы №2456 составляет 56,5% , что существенно ниже, чем у эритромицина (94,1%). Таким образом, при наличии возможности выбора аналогов эритромицина, наиболее перспективным является аналог №2456 (рис. 20). Необходимая для синтеза этой молекулы информация о доменном составе PKS (рис. 20) получена с помощью программы Biogenerator и является основой для конструирования соответствующего микроорганизма-продуцента.
