Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Глава I. Особенности полиморфно-ядерных лейкоцитов 8
1.1. Морфология и функции полиморфно-ядерных лейкоцитов 8
1.2. Активация нейтрофилов 11
1.3. Активные метаболиты кислорода 13
1.4. Сульфгидрильные соединения 20
Глава II. Хлораминовые производные аминокислот и таурина 23
Глава III. Хемилюминесценция суспензии гранулоцитов 30
3.1. Хемилюминесценция в присутствии активаторов 30
3.2. Хемилюминесценция системы нейтрофилы - люминол 35
Материалы и методы
1. Реактивы 45
1.1. Получение N-хлорпроизводных аминокислот и таурина 45
2. Объект исследования: выделение нейтрофилов 45
3. Методы исследования
3.1. Регистрация хемилюминесценции 47
3.2. Определение «активного хлора» в реакции гипохлорита натрия и хлораминов с серосодержащими соединениями 48
3.3. Статистическая обработка полученных результатов 48
Результаты и их обсуждение 49
Глава 1. Природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола, индуцированное нейтрофилами 49
1.1. Роль гидроксильного радикала 51
1.2. Роль хлораминов 56
Глава 2. Влияние серосодержащих соединений на хемилюминесценцию в системе стимулированные нейтрофилы - люминол 64
2.1. Влияние сульфгидрильных соединений на хемилюминесценцию люминола, вызванную N-хлорфенилаланином в присутствии пероксида водорода 65
2.2. Хемилюминесценция в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол в присутствии сульфгидрильных соединений 71
Глава 3. Хемилюминесценция системы нейтрофилы - люминол в присутствии биогенных хлораминов 85
3.1. Влияние N-хлорфенилаланина на хемилюминесценцию люминола в суспензии неактивированных нейтрофилов 85
3.2. Влияние хлораминов на хемилюминесценцию люминола в суспензии клеток, стимулированных ФМА 91
3.3. Влияние аминокислот и таурина на хемилюминесценцию в системе нейтрофилы - люминол 97
Приложение 105
Выводы 107
Список литературы 109
- Морфология и функции полиморфно-ядерных лейкоцитов
- Хемилюминесценция в присутствии активаторов
- Роль гидроксильного радикала
- Хемилюминесценция в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол в присутствии сульфгидрильных соединений
Введение к работе
При активации фагоцитов бактериальными или химическими агентами в процессе так называемого "респираторного взрыва" образуются активные метаболиты кислорода. Фагоциты способны генерировать не только супероксид анион-радикал, гидроксильный радикал, пероксид водорода [12]. В реакции, катализируемой миелопероксидазой, они секретируют сильный окислитель -хлорноватистую кислоту (ионизированная форма гипохлорит-анион) [77]. При взаимодействии гипохлорита с аминогруппами свободных аминокислот, пептидов, белков образуются соответствующие хлораминовые производные - биогенные хлорамины [189,201]. Все эти окислители и свободные радикалы сейчас часто называют активными оксидантами. Известно, что они образуются и внутри клетки, и секретируются в окружающую среду.
Изменение функциональной активности полиморфно-ядерных лейкоцитов, а именно продукции активных метаболитов кислорода, является важнейшим патогенетическим фактором, оценка которого актуальна для экспериментальной и практической медицины. Точная качественная и количественная характеристика активных метаболитов кислорода позволяет судить о микробицидном потенциале нейтрофила и о степени риска повреждения собственных тканей организма. Это требует тщательного изучения механизма продукции активных оксидантов, разработки методов их обнаружения и средств нейтрализации. В настоящее время в исследованиях процессов активации фагоцитов, сопровождающихся образованием активных форм кислорода, широкое применение находит метод регистрации хемилюминесценции с использованием химических усилителей (активаторов), прежде всего люминола и люцигенина [67]. В литературе есть данные о хемилюминесценции люминола при действии многих окислителей. Окисление люминола, проникающего внутрь клетки, - это сложный многостадийный процесс, начальные этапы которого сильно зависят от первичного окислителя [88,142,157, 158]. В ряде работ показано [10, 83], что люминол усиливает свечение фагоцитов за счет его окисления гипохлоритом. Однако до сих пор остается не изученным вопрос о конкретных механизмах, по которым в системе люминол -нейтрофилы возникает свечение с участием гипохлорита. Предполагается [35, 36],
что в суспензии стимулированных нейтрофилов свечение может быть также результатом действия на люминол хлораминовых соединений. Таким образом, встает вопрос о природе оксиданта, который непосредственно реагирует с люминолом в нейтрофилах.
При изучении функций фагоцитов с использованием хемилюминесцентных характеристик совершенно необходимы количественные сведения об излучении, генерируемом в клеточных структурах, и хемилюминесценции, обусловленной оксидантами в окружающей среде. Таким образом, очень важна другая проблема. Она сводится к вопросу о том, какая часть свечения при активации нейтрофилов обусловлена окислением люминола в клеточных структурах, какая снаружи клеток. Известно, что гипохлорит и хлорамины - соединения, содержащие активный хлор, обладают антибактериальным действием, могут модифицировать клетки крови. Ранее в нашей лаборатории было установлено [19-22,33,34,39], что гипохлорит и хлораминовые производные аминокислот, окисляя серосодержащие группы, снижают функциональную активность тромбоцитов, ингибируют их синтазу простагландина Нг, реакцию высвобождения плотных гранул, циклооксигеназное окисление липидов. Интересно, что действие хлораминовых производных разных аминокислот на тромбоциты различно: антиагрегационный эффект усиливается при снижении молекулярной массы хлораминов [22], и при удалении хлораминовой группы от отрицательно заряженной карбоксильной группы. В последнее время хлораминовые производные аминокислот и родственных соединений предложены в качестве противотромботического средства тромбоцитотропного типа действия [21]. В связи с этим представляет интерес выяснение возможного побочного действия биогенных хлораминов на лейкоциты. Известно, что хлораминовые производные аминокислот по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют лейкоциты [103,222]. В ряде работ высказывается мнение, что некоторые хлорамины способны регулировать нормальные физиологические процессы в фагоцитах. Из-за высокой концентрации таурина (20-50 мМ) в цитоплазме нейтрофилов при их активации в качестве вторичного продукта образуется преимущественно N-хлортаурин [150]. Предполагается [170], что на поверхности макрофагов имеется собственный рецептор для N-хлортаурина. N-Хлортаурин может проникать в клетку и
уменьшать по принципу отрицательной обратной связи производство медиаторов воспаления (окиси азота, простагландина Ег, фактора некроза опухоли а), тем самым, защищая от повреждения клетки [124, 148-152, 170,205]. Однако в литературе нет сведений о влиянии хлораминовых производных аминокислот на продукцию активных метаболитов кислорода в нейтрофилах.
Целью настоящей работы было изучение физико-химических основ хемилюминесценции люминола в суспензии активированных полиморфно-ядерных лейкоцитов, выяснение генерации реактивных оксидантов в клетке и окружающей среде.
Морфология и функции полиморфно-ядерных лейкоцитов
Концентрация лейкоцитов в крови здорового человека составляет от 4 до 10 тысяч клеток в 1 мкл. Процентное соотношение лейкоцитов в периферической крови следующее: нейтрофилы (сегментоядерные - 47-72 %, палочкоядерные - 1-6 %), лимфоциты - 19-37 %, моноциты - 3-11 %, эозинофилы - 0,5-5 %, базофилы - 0-1 %. В зависимости от присутствия в цитоплазме специфической зернистости все лейкоциты подразделяются на две группы: гранулоцити (зернистые) и агранулоциты (незернистые лейкоциты) [2].
К гранулоцитам относятся нейтрофильные (нейтрофилы), эозинофильные (эозинофилы) и базофильные (базофилы) полиморфно-ядерные лейкоциты. Гранулоцити - это крупные клетки от 9 до 15 мкм, образуются в костном мозге, циркулируют в крови несколько часов, а затем перемещаются в ткани. Для всех гранулоцитов характерна высокая лабильность клеточной поверхности, которая проявляется в адгезивных свойствах, способности к агрегации, образованию псевдоподий, передвижению и фагоцитозу [2,28]. 93-96 % всех гранулоцитов - это нейтрофилы [2], поэтому более подробно остановимся на рассмотрении особенностей именно этих клеток.
Нейтрофилы - это короткоживущие, неделящиеся клетки с сегментированным ядром. Количество сегментов в ядре зрелых нейтрофилов бывает от 2 до 5. Цитоплазма нейтрофилов слабооксифильна, содержит мелкую зернистость. Зернистость занимает не всю цитоплазму - поверхностный слой ее в виде узкой каемки остается гомогенным и содержит тонкие филаменты. Этот слой играет главную роль при движении клеток, участвуя в образовании псевдоподий. Зернистость в цитоплазме гранулоцитов подразделяют на азурофильную и специфическую [1,2]. Соотношение азурофильных и специфических гранул в нейтрофилах непостоянно. Новообразования гранул не происходит. Относительное число азурофильных (первичных) гранул составляет 10-30%. Они появляются в процессе развития нейтрофилов раньше вторичных и их больше в мало специализированных клетках. В процессе клеточной специализации число первичных гранул уменьшается. Они представляют собой разновидность лизосом (содержат типичные лизосомальные ферменты - кислую фосфатазу, кислую протеазу, арилсульфатазу и др.), с некоторыми специфическими особенностями (содержат миелопероксидазу и мурамидазу (лизоцим), которые обладают выраженным бактерицидным действием). Относительное число специфических гранул (вторичных) составляет 70-90 %. Появляются специфические гранулы в клетках позже азурофильных и имеют меньший размер. Эти гранулы содержат щелочную фосфатазу, пероксидазу, аминопептидазу, а также лизоцим и фагоцитин - основной белок с антибактериальными свойствами [1,2,18,28]. Ферменты гранул нейтрофилов способны действовать как внутри, так и снаружи клетки. Если объект недоступен эндоцитозу, или если клетки стимулированы растворимыми агентами, то нейтрофил выделяет оксиданты во внеклеточную среду. Фермент функционирует внутри клетки, когда объект доступен для эндоцитоза. В этом случае осуществляется фагоцитоз - одна из основных функций нейтрофилов. Фагоцитоз это сложный многостадийный процесс, включающий: активацию и миграцию (таксис) нейтрофила к инородной частице, адгезию на своей поверхности фагоцитируемой частицы, образование фагосомы, образование фаголизосомы и лизис ферментами фаголизосомального содержимого. Другими словами, инородная частица, посредством инвагинации плазматической мембраны, захватывается фагосомой и доставляется в клетку. В результате слияние фагосомы с гранулой образуется фаголизосома. Внутри оказываются активированные ферменты, и происходит внутриклеточное переваривание частицы [1,18].
Нейтрофилы, посредством хемотаксиса, могут мигрировать из кровеносных сосудов к источнику раздражения. Хемотаксис - это направленное движение клеток под влиянием химических раздражителей - хемоаттрактантов. Хемоаттрактанты вырабатывают уже активированные клетки, которые в свою очередь активируют покоящиеся нейтрофилы. В качестве хемоаттрактантов могут выступать продукты деградации тканей организма, бактериальные компоненты, активированные фракции системы комплемента [1,18].
Эозинофилы содержат сегментированное ядро, содержащее 2-3 сегмента. На своей поверхности зрелые эозинофилы экспрессируют рецепторы к IgG, IgE, компонентам комплемента СЗЬ, СЗа, С4, С5а, что обеспечивает активацию клеток и высвобождение содержимого гранул. Оксифильность специфических гранул в цитоплазме обусловлена содержанием в них основного белка богатого аргинином, предположительно, являющегося фактором резистентности при паразитарных инфекциях. В гранулах выявлена высокая активность гидролитических ферментов. Эозинофилы содержат гистаминазу и киназу, которые инактивируют биологически активные соединения гистамин и кинин, и являются, таким образом, отрицательными модуляторами воспаления [1,2,30]. Пероксидаза эозинофилов катализирует реакцию пероксида водорода с галоидами, в результате чего образуются HOBr, НОІ и HOSCN. Окислительный метаболизм и пероксидазная активность у эозинофилов выше, чем у нейтрофилов, хотя фагоцитоз нейтрофилами осуществляется интенсивней. Одной из главных функций эозинофилов считается создание микробицидного потенциала кожи и слизистых поверхностей, где они накапливаются в соединительной ткани в виде одноклеточных желез, секретирующих гранулы, которые содержат пероксидазу эозинофилов [12]. Эозинофильные гранулоциты участвуют в аллергических, анафилактических и защитных реакциях организма на чужеродный белок [1,18,28].
Базофилы содержат ядро, не имеющее структурных особенностей. На своей поверхности базофилы несут большое количество рецепторов к IgE. Цитоплазма базофилов заполнена крупными специфическими гранулами полигональной формы (диаметром 0,15-1,2 мкм), обладающими метохромазией (способность окрашиваться в тон, отличающийся от цвета красителя). Метохромазия связана с наличием в гранулах кислого гликозаминогликана - гепарина. В состав гранул входят гистамин, серотонин, пероксидаза, кислая фосфатаза, гистидин-декарбоксилаза (фермент синтеза гистамина) [2,28]. В результате активации базофилы продуцируют пероксидазу, супероксидный анион-радикал и перекись водорода, что свидетельствует о возможных биоцидных эффектах, аналогичных эффектам нейтрофилов. Выделяя гепарин, базофильные гранулоциты способны модулировать процессы свертывания крови и проницаемости сосудов.
Хемилюминесценция в присутствии активаторов
Опосредованная хемилюминесценция регистрируется после усиления люминесцентными зондами (люминофорами, активаторами). Активаторы взаимодействуют с первичным окислителем с образованием сильно светящегося продукта. В присутствии определенных активаторов хемилюминесценция может быть усилена в тысячи и сотни тысяч раз. По механизму действия активаторы разделяют на химические и физические. Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции в системе. В основе их действия лежит физический процесс переноса энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор. Химические активаторы хемилюминесценции - это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов. Считается, что собственная и опосредованная хемилюминесценции отражают одни и те же процессы, поэтому для анализа реакций в фагоцитирующих клетках, как наиболее доступную методику, чаще используют последнюю [68,80,83, 121, 160,162]. Широко применяемыми химическими активаторами являются люминол и люцигенин [7]. Известно, что в присутствии люминола свечение стимулированных фагоцитов возрастает в 103-104 раз [31,42,47].
Начальные стадии окисления люминола [90,157,158]. Важнейшим промежуточным продуктом окисления 5-амино-1,4-фталазиндиона считают 4-гидроперокси-1-окси-5-аминофталазин-4-олат (см. рис. 3). Известно, что на первых стадиях окисления люминола (до образования 4-гидроперокси-1-окси-5-аминофталазин-4-олата) процесс сильно зависит от многих факторов (оксидантов, адитивности, буферов и рН), в отличие от этого, распад 4-гидроперокси-1-окси-5-аминофталазин-4-олата зависит только от рН в системе [158].
В результате распада 4-гидроперокси-1-окси-5-аминофталазин-4-олата образуется перкислота. После образования перкислоты, энергия, высвобождаемая при отрыве азота, используется для образования неароматического эндопероксида. Дальнейший распад эндопероксида, начальным этапом которого является разрыв связи между атомами кислорода, заканчивается образованием аминофталевой кислоты в электронновозбужденном состоянии, что в дальнейшем приводит к свечению (см. рис.4). На этих этапах окисление люминола уже не зависит от первичного окислителя [157].
Одним из примеров окисления люминола конкретным окислителем может служить окисление люминола гипохлоритом в присутствии пероксида водорода. Известно, что введение пероксида водорода усиливает хемилюминесценцию люминола в присутствии гипохлорита [113,166]. Окисление люминола в присутствии этих соединений происходит последовательно. Сначала молекула люминола взаимодействует с ОСГ, в результате реакции образуется промежуточный продукт, взаимодействие которого с Н202 и вызывает хемилюминесценцию [9,142]. Хемилюминесцентное превращение люцигенина происходит по принципиально другой схеме [90]. Основным окислителем люцигенина (Н,М -диметил-9,9 -биакридиндинитрата) является супероксид анион-радикал. Но окислению предшествует первичное восстановление люцигенина с образованием свободного радикала (см. рис. 5). Опосредованная люцигенином хемилюминесценция нейтрофилов, в отличие от усиленной люминолом, отражает уровень образования внеклеточного супероксид анион-радикала (Ог"") [67, 72, 182], но не отражает уровень гидроксильного радикала и гипохлорной кислоты [89, 208].
Все растворимые и нерастворимые вещества, вызывающие респираторный взрыв в нейтрофилах (хемоаттрактанты, некоторые цитокины, форболовые эфиры, кальциевые ионофоры), одновременно усиливают хемилюминесценцию люминола, вызванную нейтрофилами [94,95,121-123]. Это указывает на связь между люминолзависимой хемилюминесценцией нейтрофилов и образованием активных форм кислорода, начинающегося с респираторного взрыва [48, 84, 145].
Механизм хемилюминесценции фагоцитов зависит от природы стимулирующих агентов. Например, люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов, активированная растворимыми иммунными комплексами, обусловлена ферментативным окислением арахидоновой кислоты (особая роль принадлежит циклооксигеназному пути). В этом случае, после активации клетки активируется мембранная фосфолипаза Аг, которая высвобождает арахидоновую кислоту из фосфолипидов. Арахидоновая кислота и ее производные (продукты ферментативного перекисного окисления) при взаимодействии с активными формами кислорода образуют реактивные продукты, усиливающие хемилюминесценцию. Люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов, вызванная нерастворимыми иммунными комплексами, зависит от НАДФН-оксидазной системы [73].
Избирательная недостаточность азурофильных гранул по миелопероксидазе - часто встречающийся дефект гранул оцитов [138]. Недостаточность миелопероксидазы встречается у 1-500 из 2000 человек [125]. Эта патология проявляется повышенной восприимчивостью к грибковым инфекциям -кандидозам, что особенно ярко выражено у больных страдающих диабетом [141]. Известно, что в суспензии нейтрофилов с дефицитом миелопероксидазы индуцируется хемилюминесценция люминола с очень низкими значениями интенсивности. Низкие значения интенсивностей хемилюминесценции наблюдаются, несмотря на то, что концентрации вырабатывающихся супероксид анион-радикала и пероксида водорода в клетках с дефицитом миелопероксидазы выше, чем в нормальных клетках [190]. Хемилюминесцентный ответ, усиленный люминолом (1 мкМ), стимулированных ФМА или опсонизированным зимозаном нейтрофилов с дефицитом миелопероксидазы имеет очень низкие значения -составляет менее 5 % по сравнению с контролем [83]. Не усиленный люминолом хемилюминесцентный ответ стимулированных зимозаном нейтрофилов с дефицитом миелопероксидазы составляет приблизительно 40-50 % по сравнению с контролем. В качестве контроля использовали хемилюминесцентный ответ клеток с нормальным содержанием МПО [83,181]. Интересно, что предварительная 15 минутная инкубация нейтрофилов с ингибитором миелопероксидазы - азитом натрия (1 мМ) сопровождается почти полным отсутствием сигнала опосредованной люминолом хемилюминесценции, и вызывает снижение интенсивности примерно на 50 % - не опосредованной люминолом хемилюминесценции. Аналогичные результаты были получены при инкубации клеток с другим ингибитором МПО -цианистым калием. Таким образом, нейтрофилы с дефектом МПО и нейтрофилы, предварительно обработанные ингибиторами МПО, вызывают одинаковую по интенсивности хемилюминесценцию, как в случае прямой, так и опосредованной люминолом хемилюминесценции [83]. Это дает право предполагать, что хемилюминесценция не опосредованная люминолом имеет две составляющих, в то время как люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов определяется только миелопероксидазной системой [79, 80, 83, 84].
Правильность этого предположения подтверждается в следующем опыте. В систему, состоящую из фосфатного буфера (0,01 М, рН7,0), хлорида (0,1 М), пероксида водорода (0,1 мМ) и люминола (50 нМ), ввели гранулярную фракцию, полученную из нейтрофилов с дефицитом миелопероксидазы. В течение 5 минут после введения этой гранулярной фракции увеличение интенсивности хемилюминесценции по сравнению с фоновыми значениями не наблюдалось. Через 5 минут в эту систему ввели гранулярную фракцию, полученную из «здоровых» нейтрофилов. Это сопровождается резким скачкообразным усилением интенсивности хемилюминесценции в изучаемой системе. Интенсивность хемилюминесценции в этом случае достигает значений, соответствующих стимулированным клеткам [83].
Роль гидроксильного радикала
С целью проверки участия гидроксильного радикала в формировании хемилюминесценции в системе активированные нейтрофилы - люминол, был использован специфический перехватчик гидроксильного радикала -диметилсульфоксид (ДМСО). Встает вопрос, какая концентрация ДМСО требуется для эффективного перехвата гидроксильных радикалов. Очевидно, что для снижения хемилюминесценции обусловленной гидроксильными радикалами на 50 %, скорости реакции гидроксильного радикала с люминолом и ДМСО должны быть равны, то есть: К] [Л] = к2 [ДМСО], где к - константы скорости реакций, [Л] - концентрация люминола, [ДМСО] - концентрация ДМСО.
Известно, что константа скорости взаимодействия гидроксильного радикала с ДМСО диффузионная примерно равная 1010 моль/л-с. Для люминола должны взять константу скорости не меньшую, тогда искомая концентрация ДМСО равна 0,02 мМ. Однако не наблюдалось значительного тушения хемилюминесценции ни при конечной концентрации ДМСО 0,02 мМ, ни при концентрации более чем на 2 порядка большей - 2,6 мМ (рис. 9, кривая 2). Получается, что реакция гидроксильного радикала с люминолом не дает заметного вклада в свечении, наблюдаемое при активации нейтрофилов.
При увеличении концентрации ДМСО до 261 мМ, наблюдалось сильное тушение интенсивности хемилюминесценции люминола в нейтрофилах, в максимуме хемилюминесценции достигающие примерно 50 % (рис. 9, кривая 3). Очевидно, это не связано с избирательным взаимодействием люминола с гидроксильным радикалом. Одна из причин этого тушения - взаимодействие ДМСО с активным хлором. Для доказательства этого было проведено изучение хемилюминесценции модельной системы. Если ДМСО предварительно проинкубировать с гипохлоритом или хлорамином в течение 5 мин, то при введении люминола в такую смесь свечение не наблюдалось (рис. 10, кривая 3) или было сильно ослабленным (рис. 11, кривая 3). ДМСО в очень высокой концентрации (1,3 мМ) ослабляет хемилюминесценцию и при ее измерении обычным способом, когда вначале к раствору люминола добавляется этот перехватчик, а затем индуцируется свечение введением гипохлорита (рис. 10, кривая 2) или хлорамина (рис. 11, кривая 2). Необходимо отметить, что ДМСО в использованных концентрациях (0,02-261 мМ) не вызывает хемилюминесценцию раствора люминола.
Рассмотрим теперь возможность протекания хемилюминесценции по третьему пути, когда хемилюминесценция может возникать непосредственно при окислении люминола хлораминами. Возможность этого следует из модельных опытов: обнаружено, что хлораминовые производные аминокислот вызывают свечение люминола [35, 36] и эта хемилюминесценция усиливается пероксидом водорода [229].
Ранее в нашей лаборатории было получено, что зависимость интенсивности свечения от времени для хлораминов отличается от хемилюминесценции под действием гипохлорита - она более длительна по времени. Также важно, что обнаруживается образование хлораминов в процессе перехвата гипохлорита аминокислотами, что доказывается в следующем опыте. Если в раствор люминола в присутствии аминокислот ввести гипохлорит, то видно, что в присутствии аминокислот обычная "быстрая" хемилюминесценция люминола с гипохлоритом, снижена. В присутствии аминокислот появляется продолжительная хемилюминесценция (минуты) с максимумом. Это свидетельствует о том, что часть гипохлорита перехватывается аминокислотой. В результате этого образуется хлораминовое производное, которое вызывает "длительную" хемилюминесценцию [35].
Во-первых, возможна ситуация, когда в окружающей среде нет соединений содержащих аминогруппы. В этом случае хлорамины могут образовываться на поверхности клеток. Так как хлорамины - долгоживущие соединения, они должны накапливаться во времени после стимуляции клеток. В результате накопления хлораминов должно наблюдаться усиление хемилюминесценции: если люминол вводить спустя некоторое время после стимуляции клеток, то свечение должно быть выше, чем в контроле. Для выяснения этого вопроса были проведены следующие опыты: в нейтрофилы люминол добавляли сразу, через 3, 10 или 11 минут после активации клеток ФМА. Кривая интенсивности хемилюминесценции в опыте после введения люминола через 3 минуты после ФМА выходит на исходную контрольную кривую (рис.12, кривая 2). При введении люминола через 10 минут после ФМА (рис.12, кривая 3) наблюдается усиление интенсивности хемилюминесценции по сравнению с контрольной кривой (рис.12, кривая 1): на 12 минуте регистрации интенсивность хемилюминесценции в опыте возрастает примерно на 40 % по сравнению с контролем. Светосумма, определяемая как площадь под кинетической кривой интенсивности хемилюминесценции с 12 по 21 минуты регистрации, возрастает примерно на 55 % по сравнению с контролем. При введении люминола через 11 минут после ФМА (рис.13, кривая 2) на 13 минуте регистрации интенсивность хемилюминесценции возрастает примерно на 70 % по сравнению с контролем. Светосумма, определяемая как площадь под кинетической кривой интенсивности хемилюминесценции с 13 по 21 минуты регистрации, возрастает примерно на 70 % по сравнению с контролем. Для выяснения природы соединений, ответственных за усиление хемилюминесценции в этом эксперименте, была использована салицилгидроксамовая кислота. Ингибитор миелопероксидазы не должен действовать после накопления продукта, вызывающего усиление хемилюминесценции, если оно обусловлено накоплением хлораминов. С целью проверки этого предположения нейтрофилы активировали ФМА, инкубировали 10 минут, вводили салицилгидроксамовую кислоту (0,05 мМ), инкубировали 1 минуту, затем вводили люминол (рис. 13, кривую 3). Однако, было получено, что введение салицилгидроксамовой кислоты в суспензию активированных нейтрофилов через 10 минут после ФМА, приводило к полному тушению хемилюминесценции. Таким образом, можно сделать вывод, что миелопероксидаза сохраняет свою активность в течение всего времени регистрации хемилюминесценции, то есть всё время образуется гипохлорит. Известно [113,166], что свечение гипохлорита резко усиливается в присутствии пероксида водорода. По-видимому, в нашей системе происходит накопление пероксида водорода, что приводит к усилению хемилюминесценции. Накопление пероксида водорода подтверждается в опытах с использованием каталазы. Стимулированные ФМА нейтрофилы инкубировали в присутствии каталазы (0,1 мг/мл) в течение 8 минут, затем вводили люминол. После введения люминола, на 12 минуте регистрации хемилюминесценции интенсивность свечения в опыте снижалась на 45±8 % (р 0,05) по сравнению с контролем.
Хемилюминесценция в системе стимулированные ФМА нейтрофилы -люминол в присутствии сульфгидрильных соединений
В качестве непроникающего через цитоплазматическую мембрану нейтрофилов перехватчика мы использовали восстановленный глутатион -соединение, содержащее одну сульфгидрильную группу. Восстановленный глутатион в конечной концентрации 0,2 мМ вводили в суспензию нейтрофилов до ФМА и люминола без инкубации, или через 2 минуты после ФМА и люминола. На рис. 20 показана зависимость интенсивности хемилюминесценции люминола от времени после стимуляция нейтрофилов ФМА. Введение восстановленного глутатиона (0,2 мМ) в суспензию нейтрофилов до их активации вызывает уменьшение интенсивности хемилюминесценции почти во все времена, но наиболее выражено это снижение в максимуме. В максимуме интенсивности хемилюминесценции была измерена зависимость эффективности тушения хемилюминесценции от концентрации восстановленного глутатиона. При концентрации глутатиона 0,2 мМ тушение хемилюминесценции в нейтрофилах кролика выходит на плато. Максимальное тушение хемилюминесценции составляет примерно 40-50 % (рис. 21). Это тушение не является результатом влияния восстановленного глутатиона на активацию нейтрофилов, так как введение глутатиона после активации клеток ФМА также снижает интенсивность хемилюминесценции (рис. 22).
Для сравнения было изучено действие окисленного глутатиона на хемилюминесценцию люминола в суспензии нейтрофилов. Окисленный глутатион (0,1 мМ) (рН=7,4) добавляли в клетки либо до ФМА и люминола без инкубации, либо вводили в активированные нейтрофилы через 2 или через 5 минут после люминола (для сравнения эффективности действия серосодержащих соединений, их концентрации подбирали таким образом, чтобы количество серосодержащих групп было одинаковым). На рис. 23 и 24 видно, что окисленный глутатион в используемой концентрации не оказывает заметного влияния на хемилюминесценцию в исследуемой системе.
Стрелкой указан момент введения окисленного глутатиона. Далее были проведены опыты с дитиотреитолом - соединением, содержащим две сульфгидрильные группы, проникающим в клеточные структуры. Дитиотреитол в конечной концентрации 0,1 мМ вводили в клетки до ФМА и люминола без инкубации, либо клетки инкубировали с дитиотреитолом при 37С без перемешивания в течение 3 минут, а затем вводили ФМА и люминол. Введение дитиотреитола в суспензию клеток до ФМА без инкубации вызывало уменьшение интенсивности хемилюминесценции люминола, наиболее сильно тушение выражено в максимуме, где интенсивность снижается на 55±3 % (рис. 25). На рис. 26 представлена зависимость эффективности тушения хемилюминесценции изучаемой системы, измеренная в максимуме, от концентрации дитиотреитола. Получено, что введение в нейтрофилы, непосредственно перед ФМА, дитиотреитола, в диапазоне конечных концентрациях от 0,05 до 0,2 мМ, вызывает уменьшение интенсивности хемилюминесценции на 40-50 %. В случае предварительной трехминутной инкубации клеток с дитиотреитолом (0,1 мМ) в максимуме хемилюминесценции интенсивность снижается примерно на 65-70 % (рис. 27). Кроме того, уже в момент введения люминола (нулевые точки на графике) наблюдается статистически достоверная разница между контролем и опытом (р 0,01).
Надо отметить, что наблюдаемое тушение хемилюминесценции не является результатом влияния дитиотреитола на активацию нейтрофилов, так как введение дитиотреитола в максимуме хемилюминесценции (после активации клеток ФМА) также снижает интенсивность свечения. При добавлении к клеткам дитиотреитола в конечной концентрации 0,1 мМ, интенсивность хемилюминесценции в течение следующей за введением минуты снижается примерно на 60 %. Зависимость эффективности тушения хемилюминесценции от концентрации дитиотреитола, вводимого в максимуме, представлена на рис. 28.
Таким образом, предварительная инкубация нейтрофилов с дитиотреитолом вызывает более сильное тушение хемилюминесценции, чем введение этого сульфгидрильного соединения в клетки непосредственно перед их активацией ФМА, но максимальное тушение интенсивности свечения не превышает 70 %.
Зависимость интенсивности хемилюминесценции в системе стимулированные ФМА нейтрофилы - люминол от концентрации дитиотреитола (1). Дитиотреитол введен в суспензию нейтрофилов: в максимуме хемилюминесценции; значение интенсивности хемилюминесценции регистрировали спустя 1 минуту после введения дитиотреитола. На вставке: хемилюминесценция люминола, вызванная нейтрофилами до (3) и после (2) введения дитиотреитола (ОД мМ). Стрелкой указан момент введения дитиотреитола. С - концентрация дитиотреитола. Для сравнения было изучено действие другого проникающего внутрь клеток соединения, содержащего одну сульфгидрильную группу - ацетилцистеина. Надо отметить, что это лекарственное соединение применяется в медицине. Ацетилцистеин добавляли в клетки до ФМА и люминола без инкубации, либо клетки инкубировали с ацетилцистеином при 37 С без перемешивания в течение 3 минут, а затем вводили ФМА и люминол. Введение ацетилцистеина (0,2 мМ) в суспензию нейтрофилов непосредственно перед ФМА вызывает значительное ингибирование хемилюминесценции люминола. Интенсивность хемилюминесценции в максимуме снижалась примерно на 60 % (рис. 29а). После предварительной инкубации ацетилцистеина с клетками тушение интенсивности хемилюминесценции в максимуме достигает, как и в случае с дитиотреитолом, примерно 70 % (рис. 296). Не наблюдается усиления тушения интенсивности хемилюминесценции в исследуемой системе при повышении концентрации ацетилцистеина с 0,2 до 0,6 мМ.
Возможно, способность ацетилцистеина ингибировать окислительные процессы в активированных нейтрофилах имеет определенное значение в его терапевтическом действии. Тушение хемилюминесценции в системе нейтрофилы - люминол в присутствии ацетилцистеина не является результатом влияния этого соединения на активацию клеток, так как введение ацетилцистеина в нейтрофилы после стимуляции ФМА также вызывает сильное тушение интенсивности хемилюминесценции люминола. Ацетилцистеин (0,2-0,6 мМ), введенный через 2 или 5 минут после ФМА и люминола, вызывает снижение интенсивности хемилюминесценции примерно на 35 % (рис. 30а). Увеличение концентрации ацетилцистеина до 10 мМ и его введение в нейтрофилы через 2 или через 5 минут после люминола, вызывает снижение интенсивности хемилюминесценции люминола примерно на 50 % (рис. 306). Уменьшение интенсивности свечения нельзя объяснить эффектом разведения, т.к. при добавлении буферного раствора на 2 и 5 минутах регистрации кинетики интенсивность снижалась примерно на 3 и 1 %, соответственно.
