Содержание к диссертации
Введение
Глава первая. Обзор литературы 6-45
1.1. Сравнительное изучение окисления индолил-3-уксусной кислоты пероксидазой и ауксин-оксидазой 6 - 17
1.2. Окисление фенольных соединений пероксидазой и полифенолоксидазой 17-25
1.3. Фенольные соединения как субстрат и регуляторний фактор в системе пёроксидаза-фенольное вещество 25-36
1.4. Влияние фенольных соединёшйгй продуктов их окисления на ростовые процессы 36-45
Глава вторая. Материал и методика 46-59
2.1. Определение активности оксидазы индолилук-сусной кислоты и ауксиноксидазной активности пероксидаэы хрена 46 - 53
2.2. Получение продуктов окисления фенольных соединений при действии системы пероксида-за- перкись водорода и безклеточных экстрактов гороха 53- 55
2.3. Определение биологической активности фенольных соединений и продуктов их окисления при помощи биотеста на растяжение отрезков ко-леоптилей пшеницы 55 - 56
2.4. Оценка биологической активности фенольных соединений и продуктов их окисления при помощи биотеста на прорастание семян редиса 56 - 56
2.5. Определение физико-химических характеристик продуктов окисления фенольных соединений 57-58
2.6. Приготовление реактивов 58-59
Глава третья. Результаты и обсуждение 60-132
3.1. Влияние индолил-3-уксусной кислоты и фенольних соединений на рост 60-71
3.2. Влияние продуктов окисления фенольных соединений и ионов металлов на процессы роста 71-82
3.3. Окисление индолилуксусной кислоты препаратами ауксиноксидазы из растений гороха и пероксидазой 82- 88
3.4. Фенольные соединения как факторы, регулирующие окисление ИУК и рост растений 88-99
3.5. Регуляция действия фенольных соединений ионами меди и железа при разрушении индолилуксусной кислоты 99 -115
3.6. Исследование спектральных и хроматографических характеристик продуктов окисления... 115- 132
Заключение 133-137
Выводы 138-138
Литература 139-180
Приложения 181 - 194
- Фенольные соединения как субстрат и регуляторний фактор в системе пёроксидаза-фенольное вещество
- Определение активности оксидазы индолилук-сусной кислоты и ауксиноксидазной активности пероксидаэы хрена
- Влияние продуктов окисления фенольных соединений и ионов металлов на процессы роста
- Фенольные соединения как факторы, регулирующие окисление ИУК и рост растений
Введение к работе
Фенольные соединения широко распространены в растительном мире и играют значительную роль в жизни растений. Они участвуют в процессах дыхания и фотосинтеза, влияют на процессы роста и развития, могут служить энергетическим материалом растительной клетки и также участвуют в окислительно-восстановительных процессах клетки, являясь компонентами фенол-оксидазных систем /Опарин, 1928; Сцент-Дьерди, 1937; Курсанов, 1952; Harborne 1967; Кефали, 1976; Дурмишидзе, 1976; Запрометов, 1961/.
Еще в 1908 году В.И.Палладии высказал предположение, что дыхание растений связано с обратимым окислением и восстановлением некоторых фенольных соединений, в частности флавоноидов. По гипотезе Палладина фенольные соединения, окисляясь кислородом воздуха при участии фермента полифенолоксидазы превращаются в соответствующие хиноны. Последние восстанавливаются за счет атомов водорода дыхательного субстрата и вновь становятся доступными для действия полифенолоксидазы. Таким образом система полифенол-полифенолоксидаза, по представлению Палладина служит переносчиком атомов водопровода на конечных этапах дыхания.
В начале 20-х годов А.И.Опарин /1922/ показал, что система хлорогеновая кислота - полифенолоксидаза при участии кислорода воздуха способна окислять аминокислоты и ряд пептидов. Способность фенольных соединений взаимодействовать с белками объясняется наличием функциональных групп с высокой активностью, способствующих этому взаимодействию путем образования ковалентних и водородных связей с молекулами белков, а также хелатов с металлами, входящими в состав активного центра ферментов.
Механизм воздействия фенольных соединений на ростовые процессы связывают с их влиянием на гормональный обмен и систему окисления ауксинов.
В 1934 году Тиманн / Thimann ,1934/ заметил способность растительных тканей инактивировать ауксины, а ферментативный характер окисления индолилуксусной кислоты /ИУК/ показал в 1935 году в своих работах Ларсен / ьагзеп ,1935/. Танг и Боннер / 2&ng , Bonner 1947,1948/ выделили из проростков гороха фермент, разрушающий ИУК, который в настоящее время называют оксидазой ИУК или ауксиноксидазой. Ауксиноксидазную активность проявляют многие растения, разрушая ИУК при инкубировании ее растворов с ферментными вытяжками.
Рост растений неразрывно связан с балансом нативных стимуляторов и ингибиторов роста, в частности индолилуксусной кислоты и фенольных соединений, вследствие чего изучение их взаимодействия имеет важное не только теоретическое, но и практическое значение. Одной из основных систем регуляции ИУК в растении является система ее ферментативного окисления, регулятором которой являются фенольные соединения. В свою очередь, феноль-ные соединения могут окисляться теми же ферментами, которые окисляют ауксины и давать при этом продукты окисления, регуляторная роль которых в процессе роста и окисления ИУК практически не изучена.
В связи с этим целью настоящей работы было изучение ростовых процессов и ферментативной системы окисления ИУК при влиянии на них ряда фенольных соединений и продуктов их окисления, а также ионов меди и железа, как металлов, входящих в состав ферментов окисления.
Фенольные соединения как субстрат и регуляторний фактор в системе пёроксидаза-фенольное вещество
В растениях отдельные группы фенольных соединений выполняют в зависимости от состояния /строение, степень окисленности, концентрация/ различные функции, причем одни соединения, такие как флавоноиды и производные коричной кислоты, обнаруживаются почти во всех исследуемых растениях, другие же являются типичными лишь для определенных родов и видов. Простые фенольные соединения участвуют в регулировании клеточного метаболизма и синтетических процессов растения. При нарушении равновесного состояния редокс-системы начинают преобладать окислительные процессы и ферменты принимают участие в процессах окисления различных субстратов /ришаегег ІІ922; Колесников, 1968; Стом, 1969, 1975; Р у-бин, Ладыгина, 1974/.
Впоследствии продукты распада флавоноидов и фенолкарбонових кислот могут превращаться в разнообразные вещества первичного и вторичного метаболизма, участвовать в процессах роста, транскрипции, фотосинтеза /Дурмишидзе, Шалашвили, 1968; Дурмишидзе и др., 1976; Кефели, 1971,1974,1976; Джохадзе, Панелишвили, 1976; Акулова и др., 1972; Krogman,stiller ,1962/.
По мнению Кефели /1974/, в регуляции роста растений участвуют взаимосвязанные системы фитогормонов и природных ингибиторов, причем фенольные ингибиторы, как выяснилось на ростовых моделях, действуют преимущественно на рост растяжением, не затрагивая процессов морфогенеза /Кефели, 1976/. Однако на примере семяпочек масличного мака показано, что фенолы способны регулировать эмбриогенез /іїонтович, 1981/.
Отдельные исследователи считают вероятным их действие на рост через образование хелатных соединений с металлами просте-тической группы ферментов, связанных с процессами роста /Burs- rom 1963/.
Томашевским / Tomaschewski ,1959,1964/, а затем другими авторами /Стом, 1969/ было высказано предположение о том, что действие фенолов может быть опосредовано через продукты их окисления. Результаты работ по исследованию влияния продуктов окисления фенолов указывают на то, что ингибиторы роста скорее активны в хиноидной, чем в фенольной форме, при этом их действие распространяется не только на растяжение отрезков колеоптилей, но и на другие ростовые процессы, такие как прорастание семян, рост каллусов тканей, рост клубней и т.д. /Гродзинский, 1965; Бардинская, 1964; Harborne,Simmons ,1968; Phillips ,1961; Wolf е.а. ,1977/.
В большинстве работ изучение ингибиторного эффекта фенольных соединений проводили в присутствии гибберелловой кислоты /ГК/ или ШК, Чаще всего при совместном использовании наблюдали "взаимоослабление" действия ингибиторов и стимуляторов на ростовые процессы / Barlow,Hancock,Lacey ,1965; Shibaoka,Imaseki , 1957; Бардинская, Прусакова, Шуберт, 1962; Nitsh е.а. ,1962; Зиновьев, 1965; Леопольд, 1968/.
Механизм действия фенольных соединений на рост до сих пор неясен, однако преобладает предположение о влиянии их на гормональную систему ИУК - ауксиноксидаза. При определении активности ауксиноксидазы in vitro часто обнаруживалось, что различные фенольные соединения, а иногда одни и те же, но использованные в разных концентрациях способны как активировать, так и тормозить разрушение ИУК этой ферментной системой, причем применяемые в высокой концентрации они подавляют, а в низкой - стимулируют процессы роста одних и тех же биотестов.
Активность ауксиноксидазы тормозили как простые фенолы, такие как пирокатехин, гваякол, гидрохинон / Wada Д96І/, так и более сложные - хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты, скополетин / Witham,Gentile Д96І/, что являлось подтверждением гипотезы об изменении активности ауксиноксидазы в зависимости от строения вещества, которое определяет их свойства как кофакторов и ингибиторов этого фермента / Furuya,Galston ,1961; Mumford e.a. 1961 Furuya,Galston,Stowe 1962/.
В последнее время было выдвинуто предположение о протекторной роли фенолов при окислении ИУК / stonier ,1967; Кефели, ,1968/. Суть его в том, что при одновременном присутствии ИУК и фенолов в среде, содержащей окислительные ферменты, в первую очередь начинают разрушаться фенолы и лишь затем окисляется ИУК. Способность фенольных соединений воздействовать на оксидазные свойства пероксидазы была показана многими авторами /Воронков, 1970; Кефели с сотр., 1974; Machachkova е.а. , 1976 -Gaiston ,1961; Mumford ,I96l/, но с другой стороны была также показана способность пероксидазы и ферментных вытяжек растительных тканей окислять ряд фенолов / Pierpont ,1966; Ле-Тхи-Муой, 1974; Минаева, 1978; Сарапуу, 1971; Кунаева, Бал-табаева, 1978; Баранов, 1979/ с образованием ряда промежуточных продуктов, способных к дальнейшему окислению или конденсации. Помимо окисления фенолов до хинонов, растительные ферментные вытяжки способны осуществлять превращение одних фенольних соединений в другие, в частности йшикава и Оки / ishikawa,Oki 1961/ показали, что при действии пероксидазы протокатеховая кислота может переходить в галловую, а силибин образовываться из таксифолина и кониферилового спирта / Schrall.Bekker 1977/.
Размеры молекул соединений, защищающих ИУК от окисления, могут быть разными - от низкомолекулярных соединений типа хлоро-геновой кислоты до высокомолекулярного "протектора" ауксинов. Стониер / Stonier Д967/ предположил, что протекторы ауксинов могут действовать как антиокислители, которые взаимодействуют с перекисью водорода и восстанавливают ионы марганца. При введении ИУК в побеги сливы скорость исчезновения ИУК увеличивалась с повышением активности полифенолоксидазы и с ростом уровня фенолов, что противоречит точке зрения о роли фенолов как ингибиторов окисления ИУК / Tomaschewski Д959/. в опытах Томашевско-го инфильтрация водных растворов ИУК в листья вместе с ингибиторами полифенолоксидазы приводила к ослаблению инактивации ИУК по сравнению с введением в листья растворов ИУК без ингибиторов полифенолоксидазы, причем ни полифенолоксидаза в отсутствие фенольних соединений, ни конечные продукты окисления кофейной и кумарилхинной кислот не вызывали инактивации ИУК, в связи с чем Томашевским был сделан вывод, что исчезновение ИУК связано с действием промежуточных продуктов окисления фенолов, феноль-ные же соединения выступали в роли протекторов ИУК.
Определение активности оксидазы индолилук-сусной кислоты и ауксиноксидазной активности пероксидаэы хрена
Объектом исследования были 10-дневные этиолированные приростки двух сортов гороха и их химические мутанты, различающиеся по скорости зацветания: у мутантов цветочные узлы закладываются быстрее, чем у исходных сортов. Для анализов были выбраны пищевой сорт Торсдаг и его мутант К - 578, а также кормовой сорт Фален-ский - 42 и его мутант К - 398. Мутанты получены действием 0,15 % этилметансульфоната /Сидорова, 1973; Сидорова, 1975/. Исходные сорта и мутанты были любезно предоставлены К.К.Сидоровой. Растения гороха выращивались в факторостатных камерах в темноте, в перлите или песке при температуре 26С и 70 % влажности. Исходные сорта и мутанты выращивались также до фазы зацветания в садовой почве в сосудах Митчерлиха. Как показали результаты опыта, исходные сорта и мутанты не отличались по скорости роста /Рис. 2/.
Навеску свежей ткани этиолированных проростков гороха или их корней весом I грамм растирали в охлажденной ступке с добавлением охлажденного 0,02 М фосфатного буфера рН 6,1. Общий объем гомогената доводили тем же буфером до 10 мл. После 30 минутного стояния в холодильнике гомогенат центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин. Оупернатант использовали для дальнейшего определения ИУК - оксидазы. Для отделения фермента от ингибитора использовали Сефадекс Г-25 /грубый/. Колонку Сефадекса готовили по Гамбургу /1976/. Перед началом работы кран бюретки открывали для удаления жидкости над поверхностью Сефадекса. Затем осторожно по стенке шшеткой наносили 5 мл вытяжки. После того, как вытяжка впиталась в колонку, производили элюирование вытяжки тем же буфером со скоростью I капля за 3-4 секунды. Первые 12 мл элюата, представляющие холостой объем, отбрасывали. Следующие порции собирали по 3 мл в пробирки для определения кривой элюции белка. Содержание белка в пробах определяли на спектрофотометре Сі - 4 при длине волны 280 нм, одновременно проверяли пробы на активность ИУК - оксидазы по Гамбургу /1976/. Кривая элюции белка с колонки Сефадекса представлена на рисунке 3, она совпадает с активностью ИУК - оксидазы. После отбора раствора, содержащего ИУК - оксидазу, через колонку пропускали 10-кратный объем буфера для вымывания ингибитора фермента. После этого колонка вновь использовалась для работы.
Активность ИУК-оксидазы определяли колометрически по методу Гамбурга /1976/, по убыли ИУК в реакционной смеси. Для колометри-ческого определения активности ИУК-оксидазы использовались еле-дующие реактивы: 2,4-дихлорфенол; MnCIg; ИУК - все в концентрации а также реактив Сальковского /I мл 0,5 М FeCI3 на 50 мл 35 % нсго4/.
Перед началом определения разливали в пробирки реактив Сальковского /по 2 мл на пробирку/. Затем переходили к составлению реакционной смеси. Для этого в колбочку Эрленмейера /50 мл/ вносили I мл раствора 2,4 - дихлорфенола, I мл раствора Mn&g, 2 мл раствора ИУК, 4 мл 0,02 М раствора фосфатного буфера рН 6,1 и 2 мл ферментной вытяжки. Сразу же после добавления ферментной вытяжки из колбочек пипеткой отбирали по I мл реакционной среды и переносили в пробирку с реактивом Сальковского. Это необходимо, чтобы знать значальную концентрацию ИУК в реакционной среде, так как вследствие сорбции на белках вытяжки начальная концентрация ИУК в разных вариантах может быть несколько различной.
Через 10,20,30,40 и 60 минут после добавления ферментной вытяжки из реакционной среды отбирали пробы в I мл и переносили в пробирки с реактивом Садьковского. Реактив Сальковского прекращал ферментную реакцию и окрашивал оставщуюся неразрушенной ИУК в малиновый цвет. Окраска развивалась в течение часа, а затем в течение 3-4 часов почти не менялась. турированный белок. Колориметрирование проводили на спектрофотометре при длине волны 530 нм. По полученным отсчетам строили кривую динамики разрушения ИУК. Для расчета активности фермента использовали весь прямолинейный участок полученной кривой, то есть тот отрезок времени, в течение которого разрушение шло с постоянной скоростью. Полученную оптическую плотность оставшейся неразрушенной ИУК сравнивали с предварительно построенной концентрационной кривой ИУК, причем ИУК бралась в концентрациях от 10- до 0,5 10 М /Рис. 4/. Затем зная начальную концентрацию ИУК в смеси отнимали количество оставшейся неразрушенной ИУК и получали количество разрушенной ИУК за определенный отрезок времени.
Как известно, пероксидаза может обладать ауксиноксидазной активностью, поэтому в наших исследованиях в качестве модели действия нативной ауксиноксидазы был взят препарат пероксидазы хрена /Реанал, Бенгрия/. Предварительно было проведено несколько серий опытов по подбору концентрации пероксидазы, наиболее равномерно разрушающей данную концентрацию ИУК в течение часа. Готовили ряд растворов пероксидазы известной концентрации - от 500 мкг/мл до 0,5 мкг/мл. Определение ауксиноксидазной активности пероксидазы проводилось при замене ауксиноксидазы из гороха перо-ксидазой хрена в разных концентрациях.
Влияние продуктов окисления фенольных соединений и ионов металлов на процессы роста
Как видно из результатов таблицы 2 при последовательном введении исследуемых веществ прирост отрезков колеоптилей зависит от наличия фенольного соединения в инкубационной среде /ткани/ и от вида фенольного соединения. Так при предварительном обогащении ткани феруловой кислотой и затем инкубации в растворе ИУК прирост колеоптилей был выше, чем при обогащении ткани пара-ку-маровой кислотой. Обратный вариант - обогащение ткани ИУК с паледующей инкубацией в растворах фенольних соединений положительного действия на рост не обнаруживал - наблюдалось снижение прироста.
Возвращаясь к работам Ж /bee ,1980/ необходимо отметить, что при введении в отрезки стебля кукурузы С -ИУК через три часа только 7,6 % ее оставалось в виде свободной ИУК, тогда как предобработка ткани феруловой кислотой увеличивала содержание свободной ИУК до 30%, однако, что странно предобработка пара-кумаровой кислотой также увеличивала содержание свободной ИУК, возможно за счет уменьшения уровня связанной ИУК, в частности за счет амидов ИУК.
Показательны в этом отношении работы по влиянию фенольных веществ на процесс корнеобразования у растений. Басу /Basu лі.а., 1969/ показал, что фенолкарбоновые кислоты в концентрациях до 1000 мг/л практически не стимулировали корнеобразования, но стимулировали активность ИУК в три раза. В работах ряда авторов /Pingel Uwe ,1976; Jones Natfield ,1976; Moselia e.a. ,1979; Bhaboacnarya e.aI980;Dnawan Rupa е.,a. ,1981/ и других было показано, что предварительная предобработка растений фенольными соединениями усиливала активность ИУК и повышала процент укоренения черенков. С другой стороны Мендес /Mendes ела. ,1968/ обнаружил, что у шести легкоукореняемых пород присутствует пара-кума-ровая кислота, тогда как в четырех исследуемых трудноукореняемых породах отсутствовала. Кажущийся парадокс - кофактор разрушения ИУК обнаруживается в легкоукореняемых породах и не обнаруживается в трудноукореняемых - легко объяснить, если учесть тот факт, что при укоренении содержание ИУК снижается, что подтверждается данными литературы /Турецкая и др., 1966; Saito ,0sagawara , I960/, то есть роль пара-кумаровой кислоты тут становится очевид. Наиболее вероятно, что такие изменения в содержании ИУК регулируются системой окисления ИУК, поэтому в дальнейшем, наряду с изучением процессов роста, было изучено окисление ИУК и действие на эти процессы кофакторов.
Подводя итог данной главе, необходимо отметить следующее -при совместном действии ИУК и фенольных соединений прирост отрезков колеоптилей изменяется по сравнению с действием таких же концентраций ИУК. Увеличение или уменьшение прироста отрезков колеоптилей пшеницы - тест на рост растяжением - при совместном применении фенола и ИУК зависит от концентрации ИУК - при малом количестве ИУК фенол может стимулировать прирост, при большом ин-гибировать его, что обусловлено вероятно изменением количественного содержания ИУК в ткани и тем самым изменением ее физиологического действия.
В предыдущем разделе было показано, что фенольные соединения влияют на процесс роста растяжением, на примере роста отрезков колеоптилей пшеницы - прирост может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от вида фенольного соединения и от количества ИУК, вводимой совместно с фенольными соединениями.
Известно, что содержание ИУК регулируется системами ее биосинтеза и разрушения, кроме того ферменты окислительных систем могут в свою очередь окислять и фенольные соединения, с образованием продуктов окисления. В состав этих ферментов - пероксидазы и полифенолоксидазы - входят ионы железа и меди, которые могут влиять на активность ферментных систем и процессы роста. Поэтому было необходимо проверить действие как продуктов окисления фенольных соединений, так и ионов меди и железа, с одной стороны как возможных кофакторов или ингибиторов роста и окисления ИУК и с другой стороны как модификаторов действия фенольных соединений на эти процессы. Для этого предварительно окисляли феноль-ные соединения и испытывали действие новообразованных продуктов окисления на процессы роста.
При действии продуктов окисления фенольных веществ на натив-ный /без дополнительного обеспечения экзогенной ИУК/ рост было обнаружено, что продукты окисления в отличие от исходных форм могут стимулировать рост отрезков колеоптилей пшеницы /рис.Ю/. Так если кофейная, пара-кумаровая и синаповая кислоты действовали как ингибиторы роста, то продукты их окисления проявили себя синергистами роста. Особенно сильный эффект показали окисленные формы кофейной и синаповой кислот, которые в этом опыте обнаружили почти ауксиновую активность - прирост при действии этих форм составил 346 и 352 % от прироста контроля, прирост при действии ИУК составил 384$. Окисленная форма феруловой кислоты сильнее стимулировала рост, чем исходная форма. Кверцетин и рутин по действию почти не отличались действия окисленных форм, хотя прирост у этих веществ был разным. Щциственным веществом, которое дало больший прирост колеоптилей, чем его окисленный продукт, была хлорогеновая кислота.
Влияние фенольных соединений и их окисленных форм на прирост колеоптилей было проверено в разных молярных концентрациях. В качестве фенольного соединения была взята феруловая кислота /рис. II/. Оказалось, что и в разных концентрациях окисленные формы несколько увеличивали прирост колеоптилей по сравнению с исходной формой.
Фенольные соединения как факторы, регулирующие окисление ИУК и рост растений
При добавлении в инкубационную среду продуктов окисления кверцетина и феруловой кислоты в концентрациях Ю - 10- они слабее ингибировали окисление ИУК /Ю Ч4 - Ю_4М/ и не влияли в концентрации 10- в отличие от исходных продуктов. При дальнейшем снижении концентрации продуктов окисления они не изменяли ауксиноксидазную активность пероксидазы.
Таким образом, действие продуктов окисления фенольных соединений в концентрациях Ю"3 - 10- противоположно действию исходных фенольных веществ. На основании полученных данных можно утверждать, что активность ферментных систем окисления ИУК зависит не столько от соотношения ИУК /фенол, сколько от соотношения всех трех компонентов - индолилуксусной кислоты, фенольного соединения и продукта его окисления. Продукты окисления фенолов в высоких концентрациях могут влиять на активность фермента окисляющего ИУК, в низких не действуют на него, однако можно предположить, что они могут служить регуляторами синтеза ИУК или же разных форм активности ферментов фенольного обмена, как это было показано в работе Пруидзе, Кинцурашвили /1982/.
Сопоставляя результаты действия фенольных соединений и продуктов их окисления на разрушение ИУК пероксидазой и рост отрезков колеоптилей пшеницы индуцированной ИУК можно отметить обратную зависимость окисления ИУК и процессов роста при действии этих веществ. При усилении разрушения ИУК продуктами окисления кверцетина, кофейной, п-кумаровой, синаповой, хлорогеновой, фе-руловой кислот прирост отрезков колеоптилей уменьшался, а при действии исходных фенольных веществ, ингибирующих разрушение ИУК, прирост колеоптилей увеличивался.
Более сильный прирост отрезков колеоптилей пшеницы, индуцированный ИУК, на среде, содержащей фенольные соединения, по сравнению с приростом колеоптилей на среде содержащей их окисленные формы, косвенно подтверждает гипотезу о двухступенчатом разрушении индольных и фенольных соединений. При наличии индольных и фенольных соединений первичными субстратами для окисления ферментами служат фенольные соединения, которые таким образом служат протекторами /защитными веществами/ окисления индолов, в частности ИУК, и лишь после их окисления начинают разрушаться индоль-ные соединения, что четко отражается в процессах роста растяжением, лимитируемых содержанием индолилуксусной кислоты. Наше предположение подтверждается данными литературы. При действии хлорогеновой кислоты на разрушение /2 - С / - ИУК французскими исследователями Думенджой и Мариго / Doumen i,M arigo » 1978/ было обнаружено, что хлорогеновая кислота окисляясь вначале как более доступный субстрат для ИУК-оксидазы, вызывает при этом длительную лаг-фазу, и лишь затем происходит окисление самой индолилуксусной кислоты, то есть в этой работе хорошо прослеживается роль фенольных соединений в качестве протекторов окисления ИУК.
Для проверки двухступенчатой реакции окисления ИУК в присутствии фенольных соединений, которые выполняют роль протекторов косиления ИУК, был проделан следующий опыт. В инкубационную среду, содержащую кверцетин /в концентрации 0,1 мг/мл/ в соотношении 1:20 и ИУК /Юті/ в соотношении 1:5 добавляли пероксидазу и перекись водорода, из расчета 1:5 и 1:10 соответственно. В течение часа через каждые 10 минут одновременно определяли содержание ИУК по реакции с реактивом Сальковского / SalTcowsTci ,1885/ и содержание кверцетина по реакции с белым стрептоцидом /Коренман, 1975/. При этом разрушение кверцетина происходило очень быстро - в течение нескольких минут, однако до определенных пределов, затем при отборе проб через каждые 10 минут содержание кверцетина то увеличивалось, то уменьшалось, очевидно происходили какие-то окислительно-восстановительные процессы - ИУК при этом оставалась неразрушенной /рис. 20/ и далее в течение 2-го часа, но данные на рисунке не приведены /чтобы не загружать его/, поэтому был проделан следующий опыт. По прошествии первого часа в ту же инкубационную среду добавляли или перекись водорода, или пероксидазу, или одновременно перекись водорода и пероксидазу.
При добавлении дополнительного количества пероксидазы наблюдалось незначительное усиление разрушения как кверцетина, так и индолилуксусной кислоты. При дополнительном добавлении перекиси водорода наблюдалось более сильное разрушение кверцетина и ИУК. И наконец, при добавлении и перекиси водорода и пероксидазы со-держание кверцетина резко уменьшалось, на 90 минуте кверцетин не обнаруживался, а ИУК разрушалась до полного исчезновения к 120 минуте опыта.
Таким образом данные опыта свидетельствует о зависимости скорости разрушения ИУК от наличия фенольного соединения, в данном случае кверцетина и окисляющих агентов /пероксидазы и перекиси водорода/. Причем очевидно, что пероксидаза, в меньшей степени, а перекись водорода в большей ускоряют разрушение фенольного вещества более интенсивно, чем разрушение ИУК. Когда фенол полностью и наиболее быстро окисляется системой пероксидаза -перекись водорода, только тогда ИУК начинает окисляться с наибольшей скоростью. Эти данные прямо свидетельствуют о протекторной роли фенольних соединений при окислении ИУК, при котором в присутствии фенольных соединений ИУК разрушается только после того, как разрушатся фенольные соединения.
