Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1. Роль водорослей и макрофитов в гидроэкосистеме 9
1.2. Водоросли и макрофиты как биотесты 13
1.3. Механизмы реагирования продуцентов на действие химических веществ. 17
1.4. Мутагенное действие (генотоксичность) некоторых ароматических соединений на продуценты 33
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ 38
2.1. Характеристика исследуемых веществ 38
2.2. Характеристика тест-объектов 40
2.3. Методики исследования токсичности исследуемых веществ 42
2.3.1. Водоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb 42
2.3.2. Макрофиты Lemna minor Linne 44
2.3.3. Высшие растения Tradescantia viridis Linne 46
2.3.4. Высшие растения Allium сера Linne 47
2.3.5. Методика исследования генотоксичности 47
2.3.6. Методы статистической обработки данных 49
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51
3.1. Токсическое и мутагенное действие бензойной кислоты на продуценты 51
3.1.1. Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb 51
3.1.2. Lemna minor Linne 56
3.1.3. Tradescantia viridis Linne 62
3.2. Токсическое и мутагенное действие пара-толуиловой кислоты на продуценты 69
3.2.1. Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb 69
3.2.2. Lemna minor Linne 77
3.2.3. Allium сера Linne 84
3.3. Токсическое и мутагенное действие параксилола на продуценты 91
3.3.1. Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb 91
3.3.2. Lemna minor Linne 96
3.4. Токсическое и мутагенное действие 2-метил-1,3-Диоксолана на продуценты 104
3.4.1. Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb 104
3.4.2. Lemna minor Linne 111
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 115
5. ВЫВОДЫ 150
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 152
- Роль водорослей и макрофитов в гидроэкосистеме
- Методика исследования генотоксичности
- Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb
Введение к работе
Актуальность проблемы
Антропогенное воздействие на биосферу - одна из первостепенных глобальных экологических проблем. Интенсивное развитие нефтяной, нефтеперерабатывающей и химической промышленности привело к тому, что популяции живых организмов вынуждены длительное время находиться в условиях поликомпонентного загрязнения и приспосабливаться к хроническому действию токсических веществ.
Среди веществ, попадающих в поверхностные водные объекты со стоками предприятий, одно из первых мест по разнообразию биологической активности занимают ароматические и гетероциклические соединения с двумя гетероатомами в цикле, особенно азот-, и кислородсодержащие (Ровинский и др., 1988; Елин, 2001; Левина, 2002). В эту группу входят бензол и его производные, а также диоксоланы. Некоторые из этих веществ являются исходными (2-метил-1,3-диоксолан и параксилол) и побочными (бензойная и пара-толуиловая кислоты) продуктами синтеза полиэфирных волокон (Благовещенский химический комбинат «Полиэф»), которые со сточными водами будут поступать в р. Белую - водоем высшей рыбохозяйственной категории и источник питьевого водоснабжения городов и населенных мест Башкортостана.
Анализ литературных источников свидетельствует о весьма ограниченной информации, позволяющей составить представление об экологической опасности этих веществ (Benville, 1977; Кондратьева, 2000). Хотя известно, что родоначальник класса ароматических соединений - бензол обладает выраженным токсическим и мутагенным действием как на теплокровных животных и человека, так и на водные организмы (Фельд, 1985; Peilak-Walker et. al., 1985; Тульчинская, 1986; Luce et. al., 1988; Вредные химические вещества, 1998).
5 В этой связи, актуальным является выявление количественной зависимости между уровнями загрязнения среды некоторыми малоизученными производными бензола и диоксолана и биологическими эффектами на разных уровнях организации (молекулярном, клеточном, организменном, попу-ляционном) продуцентов, являющихся ключевым звеном экосистемы.
Цель исследований
Оценить токсичность и генетическую опасность п-ксилола, бензойной и пара-толуиловой кислот, а также 2-метил-1,3-диоксолана для водорослей {Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb.), макрофитов {Lemna minor Linne) и высших наземных растений {Tradescantia viridis Linne, Allium сера Linne).
Задачи исследований
1. Изучить влияние производных бензола и 2-метил-1,3-диоксолана на:
а) водоросли Scenedesmus quadricauda по показателям выживаемости,
продукции и деструкции, соотношению живых и мертвых клеток в культуре,
скорости размножения и темпу прироста культуры;
б) ряску Lemna minor по показателям выживаемости 7 поколений, при
росту листецов, фотосинтезу, хромосомным аберрациям и гибели клеток
корней растения;
в) традесканцию Tradescantia viridis по показателям изменения роста
листьев, стеблей и корней, частоте хромосомных аберраций и гибели клеток
в корнях, выживаемости всего растения;
г) лук Allium сера по показателям роста листьев и корней, фотосинтети
ческой активности, частоте хромосомных аберраций и гибели клеток корней.
Сравнить водные и наземные растительные тест-объекты по чувствительности и устойчивости по отношению к исследуемым веществам.
Сравнить токсичность исследуемых веществ по отношению к растительным тест-объектам.
Определить токсикометрические параметры исследуемых веществ для водорослей, ряски, традесканции и лука как тест-объектов при установлении ПДК.
Определить возможные уровни воздействия исследуемых веществ, до которых растения могут адаптироваться.
Разработать метод определения стабильности веществ с помощью Scenedesmus quadricauda.
Научная новизна и теоретическое значение
Впервые установлено, что исследуемые вещества обладают мутагенным и токсическим действием на водоросли и высшие растения на всех уровнях организации: молекулярном, клеточном, тканевом, организменном, популяционном.
На 7 поколениях ряски показан характер кумулятивного токсикоза и определены пределы токсического воздействия исследуемых веществ, к которым могут адаптироваться растения.
Показана различная устойчивость и чувствительность водных и наземных растений к исследуемым веществам.
Разработан метод определения стабильности химических веществ с помощью Scenedesmus quadricauda, который более чувствительный, чем традиционный дафниевый.
Практическое значение работы
Установлены токсикометрические параметры и дозоэффективные зависимости воздействия представителей двух классов химических веществ (ароматические и гетероциклические) на представителей водных и наземных растений.
Значительная часть полученных материалов вошла в научные отчеты по установлению ПДК параксилола, бензойной кислоты, пара-толуиловой кислоты и 2-метил-1,3-диоксолана для рыбохозяйственных водоемов.
Разработанные и утвержденные нормативы внедрены на предприятии «Полиэф» г. Благовещенск (Башкортостан), который впервые начинает выпускать полиэфирные волокна на основе терефталевой кислоты.
Установлена эколого-генетическая опасность стоков предприятия для поверхностных водоемов.
Материалы работы вошли в лекционный курс и спецпрактикум по водной токсикологии, прикладной экологии и прикладной гидробиологии для студентов Тюменской государственной сельскохозяйственной академии.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Исследуемые вещества обладают токсическим действием на все
уровни организации растений: молекулярный, клеточный, тканевый, орга-
низменный, популяционный.
Исследуемые вещества обладают мутагенным действием.
Растительные тест-объекты обладают различной устойчивостью и чувствительностью по отношению к данным веществам.
Особенностью действия исследуемых веществ является кумулятивный токсикоз, что показано на примере 7 поколений ряски малой. v
Растения обладают адаптивными возможностями по отношению к разным уровням воздействия исследуемых веществ.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Научно-практической конференции молодых ученых «Молодые ученые в решении проблем АПК» (Тюмень, 2003), на Международной конференции «Контроль и реабилитация окружающей среды» (Томск, 2004), на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы экологии и охраны окружающей среды» (Уфа, 2004), на Международной конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Бо-рок, 2005).
8 Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 работ, 2 находятся в печати.
Структура и объем работы
Материал изложен на 179 страницах машинописного текста, содержит
40 таблиц, 42 рисунка.
Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), материала и методов исследования (глава 2), изложения полученных результатов (главы 3), обсуждения результатов (глава 4), выводов, списка используемых источников (230 отечественных и 45 иностранных источников) и 4 приложений.
Роль водорослей и макрофитов в гидроэкосистеме
Участие растений во внутриводоемных процессах сводится к двум основным функциям: во-первых, синтез органического вещества и выделение в среду в процессе фотосинтеза кислорода и усиление окислительной минерализации, во-вторых, поглощение из среды большого количества минеральных элементов, используемых в конструктивном и энергетическом метаболизме (Ткаченко, 1988; Мироненко, Егоров, 2002).
Развитие гидрофитов тесно связано с содержанием соединений фосфора и азота в воде: снижение концентрации фосфатов с сотых до тысячных, нитратов - с десятых до сотых долей единиц в воде водоемов сопровождается существенным снижением численности водорослей (Лысенко, 1990).
Когда начинается массовое отмирание синезеленых водорослей и оседание их на дно наблюдается интенсивное размножение микроорганизмов, а вслед за ними - мелких инфузорий - бактериофагов и крупных хищников (Лиепа и др., 1984). Максимальные показатели общей численности бактерий соответствуют максимальному уровню концентрации минеральных форм азота и фосфора, напротив, быстрый рост численности водорослей влечет за собой значительное потребление биогенных веществ (Александрова и др., 1984). Так, интенсивное развитие диатомовых водорослей сопровождается резким уменьшением содержания минерального фосфора и азота (Клоченко и др., 2002). Диатомовые потребляют нитраты при любой их концентрации в окружающей среде. Зеленые водоросли чрезвычайно требовательны к содержанию в воде соединений азота, преимущественно нитратного (Трифонова, 1980; Александрова и др., 1984; Лиепа и др., 1984; Тимофеева, Сигарева, 2004).
Таким образом, в загрязненных водоемах за пиком численности бактерий следует увеличение биомассы фитопланктона, а после отмирания последнего - снова пик биомассы бактерий. Такие взаимоотношения бактерий и фитопланктона характерны для водных объектов, независимо от состояния исходной воды (Телитченко, Федоров, 1961; Ленова, Шевченко, 1969; Александрова и др., 1984).
Водоросли являются важным звеном в пищевой цепи. Даже в довольно простых установках культура простейших Paramecium caudatum может многократно делиться, питаясь преимущественно хлореллой (Кокова, Лесовский, 1976).
Некоторые представители фитопланктона защищают себя от выедания зоопланктоном. Так, Coenocystis, Scenedesmus и Oscillatoria образовывают слизевой чехол, что затрудняет их выедание (Лысенко, 1990). Дафнии Daph-nia longispina не используют в пищу клетки синезеленых водорослей Apha-nizomenon flos-aquae (L) Ralfs, Microcystis aeruginosa Kutz em. Elenk., но при фильтрации дробят их крупные колонии антеннами и постабдоменом.
Повышение доли крупных водорослей в общей массе, прежде всего синезеленых и динофлагелят, учащение пиков биомассы и увеличение роли летнего максимума в сезонной динамике, повышение биомассы и продукции фитопланктона, можно считать основными признаками процесса эвтрофиро-вания (Трифонова, 1980). Очевидно, что в отличие от наземных растений и животных водные организмы осуществляют весьма значительный обмен с водной средой, получая из нее непосредственно многие минеральные вещества. Водоросли обладают высокой кумулятивной способностью, снижая степень загрязнения воды токсическими веществами. При наличии водорослей (эвглены, сценедесмуса) и дрожжей токсичность растворов резорцина, ман-нита, солей кадмия в острых опытах для дафний была меньшей, чем в их отсутствие (Стом, Гиль, 2000). Но в передаче радиоактивных веществ водоросли имеют ничтожное значение. Из 12 видов морских одноклеточных водорослей только два имеют высокие коэффициенты накопления стронция-90 (Поликарпов, 1964). В формировании водных экосистем немаловажная роль принадлежит макрофитам (Козловская, 2000). Это наиболее устойчивое звено гидробиоценоза, особенно к кратковременным вспышкам загрязнения. В то же время они являются хорошим индикатором хронического загрязнения, поскольку концентрируют минимальные примеси токсических веществ из среды обитания, в связи с чем их используют для доочистки сточных вод (Фрейндлинг, 1975). К макрофитам относят высшие цветковые растения, произрастающие в воде и имеющие специфические особенности морфологии, связанные с обитанием в водной среде, а также крупные по размерам водоросли, такие например, как фукусы, ламинарии, хара, а также водные мхи, плауны, хвощи (Жданов, 1981; Алимов, 1989).
В мелководных озерах, где повышенная мутность воды или ее цветность неблагоприятным образом сказываются на жизнедеятельности фитопланктона, макрофиты могут вносить значительный вклад в суммарную первичную продукцию (Бульон, 1985). Разрастаясь, макрофиты образуют биологическое плато, освобождающее поверхностный сток от механических примесей, в том числе и хлопьев малорастворимых в воде токсических компонентов сточных вод, а также избытка биогенов, предотвращая эвтрофирова-ние водоемов (Якубовский, Мережко, 1982; Фрейндлинг, 1975; Иванова и др., 1985; Глухова, 1988; Распопов, 2001). Установлено, что прибрежная и водная растительность играют немаловажную роль в ликвидации нефтяной пленки (Петров, 1968). В присутствии растений разложение нефти протекает в 2-5 раз быстрее, чем без них. Например, при концентрации 10 г/л нефтяная пленка в присутствии растений исчезала на 50 % площади на 28-36 день, а без растений - на 56-62 день. При прохождении через заросли макрофитов концентрация нефти в толще воды снижается на 20 % и больше.
Методика исследования генотоксичности
Эксперименты с ряской проводили в течение 28 дней. Ряску содержали в закрытых чашках Петри, в которые был помещены тестируемые растворы бензойной кислоты в концентрациях 1000,0, 100,0, 10,0, 1,0, 0,1 и 0,01 мг/л; пара-толуиловой кислоты - в концентрациях 1000,0, 100,0, 10,0, 1,0, 0,1 и 0,01 мг/л; п-ксилола - в концентрациях 860,0, 86,0, 8,6, 0,86, 0,09 и 0,009 мг/л; 2-метил-1,3-диоксолана в концентрациях 1000,0, 100,0, 10,0, 1,0, 0,1 и 0,01 мг/л. Смену растворов проводили через день. В каждой чашке в начале эксперимента находилось по 10 одновозрастных колоний ряски. В каждом варианте опыта было по 100 одновозрастных растений. В контроле использовали отстоянную водопроводную воду. В каждом поколении на 1, 4 и 8 дни регистрировали выживаемость растений и размер листецов.
В конце эксперимента изучали концентрацию пигментов фотосинтеза в зеленой части растений, количество мертвых клеток в корнях, частоту разного рода перестроек хромосом в клетках корней растений.
В начале и конце опытов измеряли размеры листецов с помощью оку-лярмикрометра. В конце эксперимента исследовали гибель клеток в корнях ряски, а также концентрацию пигментов (хлорофиллы «а» и «б» и кароти-ноиды) в растениях.
Методика учета живых и мертвых клеток разработана в применении к культуре водорослей (Хоботьев и др., 1971). Данная методика модифицирована для учета погибших клеток в корнях высших растений. В качестве красителя использовали раствор метиленового синего в фосфатном буфере: 200 мг красителя на 1 л буферного раствора. Состав фосфатного буфера: на 1 л дистиллированной воды 27,2 г КН2РО4 и 0,07 г Na2 НРО4. При этом рН раствора 4,6. Следует учитывать, что у высших растений в корнях имеются проводящие пучки, состоящие из мертвых клеток. На препаратах данные пучки выглядят как вертикальные одно-, двухслойные ряды темно-синих клеток, которые обычно не учитываются. В ходе эксперимента регистрировали мертвые клетки как одиночные темно-синие клетки, заключенные между не прокрашенными светлыми живыми клетками. Бледно-голубая окраска клеток свидетельствует об увеличении проницаемости мембран в результате серьезных нарушений в функционировании клеток (т. е. это погибающие клетки).
Для анализа использовали фрагменты корешков размером не более 1 см, которые помещали в каплю красителя. Окрашивание проводили в течение 30 мин, затем готовили временный препарат, который микроскопировали при увеличении 8 40.
Для определения концентрации пигментов навеску до 0,5 г зеленой части растений растирали в фарфоровой ступке с добавлением безводного сульфата натрия Na2SC 4 до образования однообразного зеленоватого порошка. В ступку приливали 8 мл 96% этилового спирта. Экстракт центрифугировали при 3000 об/мин 5 минут. В надосадочной жидкости определяли концентрацию пигментов фотосинтеза на приборе «Specol» при длинах волн 662, 644, 440 нм (Методические указания..., 1989). Концентрацию хлорофил-лов «а», «б» и каротиноидов Эксперимент с традесканцией проводили в течение 28 дней. Традесканцию содержали в стаканах объёмом 200 мл, в которых был помещён тестируемый раствор бензойной кислоты в концентрациях 1000,0; 100,0; 10,0; 1,0; 0,1 и 0,01 мг/л. Смену растворов проводили через день. В каждом стакане в начале эксперимента находилось по 5 черенков традесканции. В каждом варианте опыта было по 15 черенков традесканции. В контроле использовали отстоянную водопроводную воду.
В ходе эксперимента на 7, 14, 21, 28 сутки изучали морфометрические показатели: отмирание листьев и стебля, прирост длины стебля, изменение количества и длины корней, количество мёртвых клеток в корнях, частоту перестроек хромосом в клетках корней растений. Длину черенка, длину верхнего концевого листа, расстояние междоузлий, количество и длину корней, которые измеряли с помощью линейки. В конце эксперимента определяли концентрацию пигментов фотосинтеза в зелёной части растений согласно «Временному методическому руководству...,2002».
Scenedesmus quadricauda (Тиф.) Breb
Темп размножения клеток во всех опытных концентрациях был ускорен против К к 4 сут (в 1,25-2,5 раза), особенно в максимальной концентрации. Аналогичная направленность сохранялась до концентрации 62,5 мг/л к 14 сут. В конце опыта (21-28 сут) темп размножения опытных культур водорослей замедлился в концентрациях 15,6 и 62,5 мг/л. В более высоких концентрациях к этому сроку водоросли погибли. В минимальной концентрации разница с К была не существенной (за исключением 7 сут).
Фазное изменение темпа размножения клеток определило и динамику коэффициента прироста численности водорослей (рис. 5).
Ускорение темпа размножения клеток Scenedesmus quadricauda в больших концентрациях не привело к увеличению численности.
Коэффициент прироста численности водорослей в максимальной концентрации плавно снижался с 4 по 7 сут и резко - к 14 сут опыта. В концентрации 250 мг/л с 4 по 14 сут К„ возрастал и достигал контрольного уровня, а к 21 сут культура погибла (Приложение А, табл. А.З).
В остальных концентрациях наблюдались фазные изменения показателя Кп в соответствии с показателями темпа размножения. В минимальной концентрации коэффициент прироста численности к концу эксперимента превысил контрольный уровень, что, вероятно, связано с растормаживанием покоящихся клеток и переходу к размножению, поскольку темп размножения клеток в опыте был незначительно выше контроля.
Таким образом, снижение численности в растворах бензойной кислоты, начиная с концентрации 15,6 мг/л, было обусловлено гибелью низкорезистентных клеток.
Основной функцией растения является фотосинтез. От того, как воздействует вещество на процесс продуцирования и деструкцию органического вещества, можно судить о степени его токсичности.
Из данных таблицы видно, что фотосинтез подавлялся бензойной кислотой, начиная с концентрации 0,2 мг/л. Здесь и до концентрации 50,0 мг/л валовая продукция была ниже, чем в К, на 40-90 % (исключая концентрацию 1,0 мг/л), а чистая продукция - на 59-67 % (в концентрациях от 0,2 до 1,0 a мг/л). В вариантах с высокими концентрациями величины валовой продук ции (500,0 мг/л) и чистой продукции (5,0-500,0 мг/л) имели отрицательные значения в связи с интенсивно идущими деструктивными процессами. Са-профиты потребляли кислород быстрее, чем его продуцировали фотосинтетики.
Таким образом, длительное воздействие бензойной кислоты (28 сут) сопровождалось угнетением функциональной активности культуры водорослей в более низких концентрациях, чем их выживаемость и темп роста.
