Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ПОНЯТИЕ ОБ ИММУНИТЕТЕ РАСТЕНИЙ И ВЕЩЕСТВАХ, ЕГО ИЛДУЦИРУЮЩИХ 10
1.1. Иммунитет растений 10
1.2. Индукторы иммунного ответа растений олигосахаридной природы 16
1.3. Хитозан как индуктор иммунного ответа растений 20
1.4. Роль веществ различной природы в формировании иммунитета растений 38
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЙ 52
2.1. Объекты исследования 52
2.2. Методы выделения и получения хитозансодержащих препаратов 53
2.3. Методы исследования образцов 54
2.4. Анализ биологической активности хитозансодержащих препаратов 62
Глава 3. АНАЛИЗ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ХИТОЗАНА И ХИТОЗАНСОДЕРЖАЩИХ ПРЕПАРАТОВ ИЗ СЫРЬЯ АЛТАЙСКОГО КРАЯ 76
3.1. Получение хитозана и его солей с рядом ароматических кислот 76
3.2. Физико-химические свойства 79
3.3. Инфракрасная спектроскопия 89
3.4. Структура поверхности 102
3.5. Безотходная схема переработки некондиционных цист Artemia species 114
3.6. Стабильность органо-минерального удобрения «Артемия» в процессе хранения 118
Глава 4. ВЛИЯНИЕ ОРГАНО-МИНЕРАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ «АРТЕМИЯ» НА РАСТЕНИЯ 122
4.1. Регуляция активности растений 122
4.1.1. Плодово-ягодные культуры 123
4.1.2. Овощные культуры 137
4.1.3. Зерновые культуры 140
4.2. Инсектицидное действие 144
4.2.1. Плодово-ягодные культуры 147
4.2.2. Овощные культуры 150
Глава 5. ДЕЙСТВИЕ СОЛЕЙ ХИТОЗАНА С РЯДОМ АРОМАТИЧЕСКИХ КИСЛОТ НА ОВОЩНЫЕ КУЛЬТУРЫ 153
5.1. Томаты 153
5.2. Картофель 165
ВЫВОДЫ 175
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 177
Приложения 207
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса, поскольку страдают от болезней, вредителей, бесконтрольного применения пестицидов и недостатка удобрений (Озерецковская, Ильинская и др., 1994).
Среди известных методов борьбы с вредителями и болезнями сельскохозяйственных культур химический, основанный на применении пестицидов, занимает ведущее место. Но пестициды являются активными источниками загрязнения окружающей среды: попадая в организм человека, они разрушают иммунную систему и могут стать причиной наследственных и онкологических заболеваний; накапливаясь в растениях, вызывают мутации вплоть до вырождения сорта, а так же изменяют содержание микроэлементов и биологически активных соединений в сельскохозяйственных продуктах. Одним их отрицательных моментов является и то, что у популяций вредителей вырабатывается резистентность к новым пестицидам {Шаманская, 2006).
Поэтому одним из наиболее многообещающих способов защиты растений, является индуцирование их устойчивости с помощью элиситоров (хитин, хитозан, салициловая, арахидоновая кислота и т.д.). Способ основан не на прямом подавлении фитопатогенов, а на активации естественного потенциала растительной ткани, как это происходит в природе (Озерецковская, 2002).
Большой интерес в связи с этим вызывает хитозан, который способен индуцировать у растений болезнеустойчивость широкого спектра действия и может быть использован, как экологически безопасная субстанция для защиты растений от вредителей и заболеваний различной этиологии (Озерецковская, Васюкова и др., 2002). Использование хитозановых препаратов для защиты растений в качестве экологически чистых разрешено в США Агенством по охране окружающей среды (Куликов, Алимова и др., 2003).
Основным сырьём для получения хитина и хитозана являются
5 панцирьсодержащие отходы вылова представителей Arthropoda (Верходанов,
Полякова, 1999). Однако, панцири ракообразных — это дорогостоящее сырье,
цена которого зависит от вида, возраста и сезонного вылова. К тому же
загрязнение мирового океана приводит к повышению массовой доли тяжелых
металлов и радиоактивных элементов в панцирях ракообразных, делает
выделяемый из них хитин непригодным к использованию (Феофилова, Немцев
и др., 1996).
Поэтому в настоящее время всё большее значение приобретает поиск альтернативных источников для получения хитина и хитозана. Аквабиоресурсы Алтайского края богаты рачком Artemia species, который ежегодно добывается в объемах 5-10 тыс. т. в год. Благодаря высокой скорости воспроизводства Artemia species (рачок размножается, давая четыре приплода за сезон), при соблюдении всех правил отлова можно, без ущерба для природы, обеспечить производство хитина и хитозана, используя некондиционное сырье. Применение цист Artemia species в производстве стартовых кормов для скармливания молоди рыб предусматривает использование только полноценного сырья, а поврежденные оболочки цист Artemia species с проклевываемостью ниже 15... 80% в настоящее время не имеют промышленного применения.
Существующая технология переработки некондиционной цисты (Патент RU № 2255924) имеет ряд недостатков: хитозановый препарат не стабилен в процессе хранения (происходит коагуляция компонентов); в процессе производства остается твердая фаза из нерастворившихся остатков цист Artemia species
В связи с изложенным выше, является целесообразным разработка и усовершенствование технологии переработки некондиционных цист Artemia species с целью получения из них производных хитозана для нужд сельского хозяйства.
Цели и задачи исследования.
Цель исследования — получение хитозансодержащих препаратов на
основе безотходной схемы переработки некондиционных цист Artemia species и изучение их влияния на растения.
В задачи исследований входило:
Получить и проанализировать физико-химические свойства хитозансодержащих препаратов из сырья Алтайского края.
Усовершенствовать методику получения хитозансодержащих препаратов из отходов цист Artemia species.
Исследовать стабильность препаратов в процессе хранения в зависимости от рН и от температуры хранения,
Изучить влияние хитозансодержащих препаратов на рост, развитие и урожайность овощных, плодово-ягодных и зерновых культур с оценкой качества выращенной продукции.
Оценить инсектицидное действие хитозансодержащего препарата на овощных и плодово-ягодных культурах.
Установить влияние обработки солями хитозана с ароматическими кислотами на рост и развитие овощных культур.
Научная новизна. Впервые разработана экологически безопасная безотходная схема получения хитозансодержащих препаратов из цист Artemia species, исследован состав жирных кислот цист. Изучены физико-химические свойства, биологическая, инсектицидная и фунгицидная активность хитозансодержащих препаратов, Установлено, что состав, состоящий из смеси калийного мыла и органоминерального удобрения «Артемия» (хитозансодержащий препарат из цист Artemia species), обладает высокими инсектицидными свойствами против различных видов тлей, личинок щитовки и гусениц боярышницы на овощных и плодово-ягодных культурах.
Практическая значимость. Разработанный метод получения хитозана и хитозансодержащих препаратов может быть положен в основу промышленного производства экологически безопасного инсектицидного препарата. Способ не требует значительных производственных затрат, полученные препараты обладают высокими инсектицидными и фунгицидными свойствами при
7 сохранении высокой биологической активности по отношению к овощным,
плодово-ягодным и зерновым культурам. Некорневая подкормка
органоминеральным удобрением «Артемия» способствует повышению
урожайности исследуемых культур и улучшению биохимических показателей
выращенной продукции. Орган оминеральное удобрение «Артемия» обладает
фунгицидной и инсектицидной активностью при обработке исследуемых
культур, Обработка хитозана рядом ароматических кислот (ЇЇАБК,
сульфаниловой, салициловой) позволяет перевести его в водорастворимую
солевую форму, обладающую хорошей пленкообразующей способностью.
Обработка солями ароматических кислот (ПАБК, сульфаниловой, салициловой)
хитозана способствует увеличению всхожести и энергии прорастания,
повышению урожайности овощных культур и улучшению биохимических
показателей выращенной продукции.
Положения, выносимые на защиту.
Безотходная схема получения хитозансодержащих препаратов из цист Artemia species.
Обработка хитозансодержащими препаратами из цист Artemia species повышает биологическую продуктивность растений.
Хитозансодержащие препараты из цист Artemia species обладают инсектицидной и фунгицидной активностью.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 3-ей межрегион, науч.-прак. конф. «Производные хитозана и стимуляторы роста в сельском хозяйстве» (Бийск, 2005); Межд. науч.-практ. конф. «Вузовская наука - сельскому хозяйству» (Барнаул, 2005); 6-ой Межд. конф. молодых учёных и студентов «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005); 11-ой Межд. науч.-практ. конф. «Природные и интеллектуальные ресурсы Сибири» (Барнаул, 2005); Всерос. науч.-прак. конф. «Проблемы безопасности технологического процесса, качества реализуемой продукции и биологически активных добавок» (Архангельск, 2005); регион, науч.-практ. конф. «Современные проблемы и достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и эко-
8 номике» (Томск, 2005); 4-ой Всерос. науч. конф. «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006); 4-ой межрегион, науч.-практ. конф. «Производные хитозана и стимуляторы роста в сельском хозяйстве» (Бийск, 2006); 8-ой Межд. конф. «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Казань, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе заявка на патент Российской Федерации Регистрационный № 2006119379 от 02.06.2006 «Средство борьбы с сосущими вредителями и способ его получения».
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 216 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методик исследования, 3 глав результатов собственных исследований, выводов, библиографического списка литературы (238 ссылок), содержит 70 таблиц и 42 рисунка.
9 УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
ПНЖК — полиненасыщенные жирные кислоты;
ФА — фитоалексины;
СД — степень деацетилирования;
Мм. — молекулярная масса;
ПСС — панцирьсодержащее сырье;
ЛГП-комплекс — липогликопротеидный комплекс;
АК — арахидоновая кислота;
ЭПК — эйкозапентаеновая кислота;
ЛОГ — липоксигеназы;
Ж — линоленовая кислота;
ЖАК — жасмоновая кислота;
Ме-ЖАК — метилжасмоновая кислота;
СК — салициловая кислота;
ПАБК — пара-аминобензойная кислота;
МКХ — микрокристаллический хитозан;
ДСК — дифференциальная сканирующая калориметрия;
К эфф — константа эффективной скорости реакции;
Kv — коэффициент ускорения;
СВ — сухое вещество;
Иммунитет растений
Согласно современным представлениям, иммунитет следует рассматривать как систему, защищающую структурную и функциональную целостность организма, основанную на его способности распознавать и отторгать чужеродные ткани, клетки или вещества. Специфичность фитоиммунитета определяется взаимодействием определенных генов паразита с генами растения-хозяина. Иммунитет обеспечивает надзор за биохимической чистотой организма (растения), стоит на страже их внутреннего постоянства. Никакие пестициды не могут заменить иммунную систему, а в ряде случаев, наоборот, способны ее подавить. В настоящее время химическое и инфекционное давление на растения часто превышают порог возможностей их адаптации (Озерецковская, 2002).
Фитопатогены неспособны существовать, не подавив иммунные ответы своих растений-хозяев. Некротрофы супрессируют защитный потенциал растительной клетки ее умертвлением. Биотрофы, питающиеся содержимым живых клеток, применяют более тонкие механизмы супрессии: не убивая клетки хозяина, а лишь в той или иной степени повреждая их и нейтрализуя при этом иммунную систему растения-хозяина (Озерецковская, Васюкова и др., 2001). В виде ответной реакции в ходе эволюции в растениях выработались механизмы использования разнообразных продуктов катаболизма в качестве эндогенных регуляторов, функционирующих в тех клетках, где они образовались, либо транспортируемых по растению (Ильинская, Озерецковская, 1998).
Предполагается, что в растениях функционирует интегральная система передачи сигналов, регулирующая индукцию защитных генов. Ее первой ступенью является распознавание элиситора специфическим рецептором, присутствующим в плазматических мембранах растений. В результате их взаимодействия в растении индуцируется каскад защитных реакций (индуцирование устойчивости) против возбудителей болезней и стрессов (Озерецковская, Васю-коваи др., 2001; Тарчевский, Максютова и др., 2001).
Работы по изучению индуцирования устойчивости растений начались еще в конце XIX. Гойман определил иммунизацию как повышение устойчивости растительной ткани в результате ее предварительного инфицирования или обработки метаболитами патогена (Озерецковская, 1994). В процессах индуцирования первичным сигналом, приводящим в действие сложнейшую сеть процессов индукции и регуляции фитоиммунитета, являются различные элиситоры — это вещества, индуцирующие защитные ответы у растений. На заре исследования их еще называли индукторами (Тарчевский, Чернов, 2000). Элиситоры распознаются растением, в результате чего реализуется фитоиммуниый эффект (Озерецковская, Ильинская и др., 1994). Поэтому одним из наиболее многообещающих способов защиты растений, является индуцирование их устойчивости. Способ основан не на прямом подавлении фитопатогенов, а иа индуцировании естественного потенциала растительной ткани, как это происходит в природе (Озерецковская, 2002).
Индуцировать устойчивость растений становится необходимым по причине сложнейшей экологической обстановки, сложившейся на нашей планете. Сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса, поскольку страдают от болезней и вредителей, бесконтрольного применения пестицидов, переизбытка удобрений. В таком состоянии растения просто не могут не быть иммуиодефицитными.
К настоящему времени элиситоры используются для защиты от болезней многих овощных, зерновых и технических культур. Индуцирование устойчивости растений элиситорами широко используется во всем мире. Метод защиты растений с помощью элиситоров в известной мере является альтернативным использованию пестицидов, которые совсем недавно были единственным средством защиты восприимчивых к болезням растений (Озерецковская, Ильинская и др., 1994).
Индуцированная устойчивость служит примером фенотипической имму нокоррекции растительной ткани, поскольку в результате обработки биотическими элиситорами изменяется не геном растений, а лишь его функционирование, связанное с уровнем экспрессии защитных генов. Индукция биотическими элиситорами системной устойчивости связана с функциональной активностью метаболитов, обеспечивающих системный защитный эффект растительной ткани, а именно — салициловой кислоты и ее производных, жасмоновой кислоты и ее метилового эфира, системина и этилена, а возможно, также некоторых оли-госахаридов (Озерецковская, Роменская и др., 1996; Озерецковская, 2002).
При любом вмешательстве в природу следует учитывать не только видимый эффект, но и его возможные отрицательные последствия. Есть мнение, что бесконтрольное применение элиситоров на биологических объектах часто имеет свою оборотную сторону, особенно при массовом их использовании (Ильинская, Озерецковская, 1998; Васюкова, Герасимова и др., 1999).
Объекты исследования
Выделение хитина и хитозана традиционным «жестким» способом деацетилироваиия
Для получения хитина и хитозана использовали местное сырьё Алтайского края. Схема получения хитозана складывалась из методики, предложенной Гартман (1998) и исследований Голицина В.П., Цветкова В.Г., Иванова А.В., Гартман О.Р. (Патент RU № 2065447), Гамзазаде А.И., Скляр А.И, Рогожина B.C. (Гамзазаде, Скляр и др., 1985).
Схема выделения хитозана выглядела следующим образом: сухое измельченное сырье кипятили в воде в течение 2 часов, охлаждали и обрабатывали 5%-ным раствором соляной кислоты (деминерализация). Затем комплекс хитина с белком разрушали кипячением в 5%-ном растворе щелочи (депротеияи-рование). Твердый осадок (хитин) отфильтровывали от темно окрашенного щелочного раствора и промывали водой. Выделенный хитин обесцвечивали этанолом и получали рыхлую массу, нерастворимую в органических растворителях, воде и щелочах. Продукт растворим только в концентрированных минеральных кислотах с образованием вязкого, прозрачного сиропа.
После чего проводили реакцию деацетилироваиия хитина кипячением в растворе едкого натра с массовой долей 50% с выделением хитозана. Полученный хитозан представляет собой хлопья.
Получение микрокристаллического хитозана (МКХ) (Struszczyk, Kivekas, 1990)
Для этого образец хитозана, массой 5 г растворяли в 250 см3 1%-ного раствора соляной кислоты в течение 12 часов. Нерастворимые частицы удаляли фильтрацией через фильтр Шотта № 100. Из полученного фильтрата хитозан переосаждали добавлением 2%-ного раствора гидроксида натрия до рН=9,0. Затем полученную гелеобразную дисперсию быстро доводили до рН=8,0 1%-ным раствором соляной кислоты. Полученную суспензию микрокристаллического хитозана фильтровали через фильтр Шотта № 100 и промывали дистиллированной водой до рН =7,0. Обезвоживания достигали двукратной обработкой 150 см3 95%-иого этилового спирта при постоянном перемешивании. На последнем этапе микрокристаллический хитозан высушивается при 60С в течении 2...4 часов. Получение солей органических кислот с хитозаиом
Соли получали из 0,25%-ного раствора хитозана в 0,25%-ном растворе соответствующей кислоты, Полученный раствор перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре, затем нерастворившиеся частицы удаляли фильтрацией через фильтр Шотта № 100. Далее для формирования пленок, 50 см" полученного раствора, отливали в чашки Петри и ввісушивали в сушильном шкафу при температуре 105С в течение 6 часов (Урьяш, Маслова и др., 1999).
Полученные образцы хитина и его производных охарактеризовывали по средней молекулярной массе и степени деацетилирования. Все результаты количественных измерений, представленные в работе, получены в сериях из трех опытов. Определение степени деацетилирования хитозана
Степень деацетилирования определяли потенциометрическим титрованием в безводной среде: ледяной уксусной кислоте с 1,4-диоксаном (Bough, 1978; Bodek, 1995).
Получение хитозана и его солей с рядом ароматических кислот
Получение хитозана и МКХ. Получение осуществлялось по методике, описанной в пункте 2.2. Выход и характеристика полученных образцов хитозана и микрокристалического хитозана (МКХ) представлены в таблице 15.
Как видно из таблицы 15, наиболее предпочтительным сырьем для получения хитозана можно считать Arteraia species и Gammarus lacustris, поскольку из данного сырья получается наибольший выход хитозана, а так же наибольший выход МКХ, что говорит о более полном протекании реакции деацетили-рования. Хитозан из Artemia species имеет минимальное содержание золы.
Получение солей хитозана. Хитозан не растворим в воде, поэтому получение водорастворимых форм хитозана является перспективным направлением, востребованным в сельском хозяйстве. Получить водорастворимый хитозан можно, модифицируя его химически или используя свойство хитозана растворяться в водных растворах кислот (получая соли хитозаиа). Соли хитозана обладают пленкообразующими свойствами, что позволяет так же использовать водорастворимые препараты для предпосевной обработки и инкапсулирования семян растений.
Обычно хитозановые плёнки формируют из уксуснокислых растворов полимера по сухому способу, удаляя растворитель испарением при комнатной температуре или при 50,..60С (Зоткин, Вихорева и др., 2003). Полученная таким способом пленка, находится в виде солевой формы (С-форма), содержит протонированные №їз+ — группы и растворяется в воде (Вихорева, Зоткин и др., 2001). Ограниченные сведения об использовании других органических кислот для получения хитозановых водорастворимых пленок с одной стороны, и научный и практический интерес данного вопроса — с другой, в частности для нанесения защитной пленки на семяна, послужили основанием проведения сравнительного исследования свойств пленок, сформированных из растворов хитозана в бензойной, салициловой, л-аминобензойной и сульфаниловой кислотах. Выбор кислот обусловлен тем, что они сами обладают биологической активностью (Смирнов, 1974; Мецлер, 1980; Васюкова, Герасимова и др., 1999; Эйгес, 2000; Пентелькина, 2001; Панина, Васюкова и др., 2005).
Для изучения физико-химических свойств солей из растворов были приготовлены пленки в соответствии с методикой, изложенной в пункте 2.2.
С учетом того, что в литературе чаще всего даются ссылки, что биологической активностью обладают следующие ароматические кислоты: ПАБК, салициловая, сульфаниловая и бензойная; то первым этапом работы стал анализ физико-химических постоянных выбранного ряда кислот (табл. 16) (Кнунянц, 1965; Зонис, 1973; Моррисон, Бойд 1974).
Для получения солей был использован образец хитозана из Artemia species с молекулярной массой 34,1 кДа, степенью деацетилирования 75%, содержанием золы 5,7% и влаги 1,8%. Для сравнения был взят хитозан из краба (Paralithodes camtscaticus) производства ЗАО «Восток - бор»
Основные физико-химические характеристики исследуемых образцов солей хитозана с ароматическими кислотами представлены в таблице 17.
Как видно из данных таблицы 17 наибольшей солеобразующей способностью обладают сульфаниловая, салициловая кислоты и ПАБК, что можно связать со значением рКа в изучаемом ряде кислот.
