Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. CLASS Обзор литературы CLASS
2.1. Современные представления о химической нейромедиации 10
2.1.1. Нейромедиаторы 10
2.1.2. Ко-медиаторы 12
2.1.3. Нейромодуляторы 14
2.1.4. Глия в аспекте синапгической функции 15
2.2. Роль глутамата в нервной системе 16
2.2.1. Внутриклеточное и экстраклеточное содержание глутамата в нервной ткани 17
2.2.2. Метаболизм глутамата 18
2.2.3. Глутамат как нейромедиатор 20
2.2.4. Глутаматные рецепторы 21
2.2.4.1. Ионотропные рецепторы 21
2.2.4.1.1. AMPА-рецепторы 21
2.2.4.1.2. Каинатные рецепторы 23
2.2.4.1.3. NMDA-рецепторы 24
2.2.4.2. Метаботропные рецепторы 27
2.2.5. Глутамат как модулятор неглутаматергической нейромедиации 28
2.3. Секреция ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе 31
2.3.1. Квантовая секреция ацетилхолина 31
2.3.2. Неквантовая секреция ацетилхолина 33
2.4. Предпосылки для обсуждения роли глутамата в нервно-мышечном синапсе позвоночных 38
2.4.1. Некоторые эволюционные аспекты сосуществования ацетилхолина и глутамата 38
2.4.2. Глутамат в двигательных нервных окончаниях позвоночных 39
2.5. Оксид азота II (N0) и фермент NO-синтаза в нервно-мышечном синапсе 42
2.5.1. Физиологические функции N0 в мышце и нервно-мышечном синапсе 46
3. Объект и методы исследования
3.1. Объект исследования 49
3.2. Растворы 49
3.3. Электрофизиологические исследования 51
3.4. Анализ квантовой секреции ацетилхолина 51
3.5. Оценка интенсивности неквантовой секреции ацетилхолина 52
3.6. Статистическая обработка экспериментальных данных 53
4. Результаты исследования и их обсуждение
4.1. Влияние глутамата на квантовую секрецию ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе крысы 54
4.1.1. Влияние глутамата на спонтанную квантовую секрецию ацетилхолина 54
4.1.2. Влияние глутамата на вызванную квантовую секрецию ацетилхолина 60
4.2. Влияние глутамата на неквантовое освобождение ацетилхолина 64
4.2.1. Изучение рецепторного механизма действия глутамата на неквантовую секрецию 68
4.2.1.1. Влияние антагонистов и специфического агониста NMDA-рецепторов на неквантовую секрецию ацетилхолина 69
4.2.1.2. Эффект глутамата на неквантовую секрецию ацетилхолина в бескальциевой среде 74
4.2.2. Изучение роли NO-синтазы в механизме действия глутамата 77
4.2.2.1. Влияние блокады NO-синтазы на эффект глутамата 77
4.2.2.2. Влияние гемоглобина на эффект глутамата 82
4.2.3. Изучение механизма действия N0, синтезируемого под влиянием глутамата 85
4.2.3.1. Влияние блокады гуанилатциклазы на эффект глутамата 85
5. CLASS Заключени CLASS е 88
6. Выводы 97
7. Список литературы 98
- Метаболизм глутамата
- Оксид азота II (N0) и фермент NO-синтаза в нервно-мышечном синапсе
- Влияние глутамата на неквантовое освобождение ацетилхолина
- Влияние гемоглобина на эффект глутамата
Введение к работе
Актуальность исследования
Начиная с середины 1970-х годов принцип Г. Дейла, согласно которому каждый нейрон содержит единственное медиаторное вещество, стал подвергаться сомнению, поскольку постепенно накапливались данные о выделении из нейрона более одного нейромедиатора (Burnstock, 1976). На сегодняшний день этот феномен ко-медиации можно трактовать скорее, как правило, нежели как исключение для всей нервной системы (Lundberg, Hokfelt, 1983; Kupfermann, 1991). Литературные данные свидетельствуют, что в большинстве своем один из ко-секретируемых синаптических посредников модулирует эффект основного медиатора, влияя на процессы высвобождения последнего из нервного окончания или регулируя физиологический ответ на воздействие основного медиатора в воспринимающей клетке (Vanhatalo, Soinila, 1998).
Исследования последних лет демонстрируют, что глутамат (анион глутаминовой кислоты), являясь основным возбуждающим медиатором в синапсах ЦНС млекопитающих (Аишарин, Стукалов, 1996; Watkins, Evans, 1981; Fonnum 1984; Headley, Grillner, 1990) и в нервно-мышечных синапсах беспозвоночных (Lunt, Olsen, 1988), в достаточно высоких концентрациях присутствует и в нервно-мышечных соединениях позвоночных животных, локализуясь вместе с ацетилхолином (Meister et al, 1993; Waerhaug, Ottersen, 1993; Fu et al., 1998). На препаратах синаптосом электрического органа Torpedo показано совместное освобождение глутамата и ацетилхолина из холинергических нервных окончаний (Vyas, Bradford, 1981; Israel et al, 1993). В то же время на терминали развивающихся мотонейронов Xenopus обнаружены глутаматные AMP А, каинатные и NMDA-рецепторы (Xie et al, 1993; Fu et al, 1995; Liou et al, 1996; Fu, Lin, 1997; Fu et al, 1998), тогда как в нервно-мышечном синапсе крысы на сегодняшний день идентифицированы только постсинаптические NMDA-рецепторы (Berger et al, 1995; Urazaev et al, 1995; Grozdanovic, Gossrau, 1998). Эти рецепторы
6 пространственно связаны с ферментом NO-синтазой (Grozdanovic, Gossrau, 1998; Luck et ah, 2000), аналогично тому, как это имеет место в нейронах ЦНС (Kornau et ah, 1995; Кіт et ah, 1999; Sattler et ah, 1999). Между тем, о возможной физиологической роли глутамата в нервно-мышечной передаче позвоночных известно крайне мало. Так, в уже упомянутых работах (Xie et ah, 1993; Fu et ah, 1995; Liou et ah, 1996; Fu, Liu, 1997; Fu et ah, 1998), осуществленных на эмбриональном материале Xenopus, показано, что глутамат увеличивает как частоту, так и амплитуду спонтанных миниатюрных токов и потенциалов концевой пластинки (МПКП и МТКП). В то же время на нервно-мышечном синапсе половозрелой лягушки продемонстрировано только угнетающее спонтанную квантовую секрецию влияние глутамата, при этом влияния аминокислоты на вызванное квантовое освобождение отмечено не было {Матюшкин, 1975). Сведений же о влиянии глутамата на квантовую и неквантовую секрецию ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе млекопитающих на сегодняшний день нет. Изучению возможного модулирующего влияния глутамата на процессы секреции ацетилхолина в концевой пластинке теплокровных и посвящено настоящее исследование. Несомненно, что выявление молекулярных механизмов модуляции освобождения медиатора позволяет глубже понять процессы регуляции и саморегуляции синаптической передачи, а также ближе подойти к пониманию путей обеспечения синаптической пластичности.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы явилось изучение механизмов влияния глутамата на процессы секреции ацетилхолина в нервно-мышечном соединении млекопитающего. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Исследовать влияние глутамата на спонтанную и вызванную квантовую секрецию ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе крысы.
2. Исследовать влияние глутамата на неквантовое освобождение ацетилхолина из двигательных нервных окончаний крысы.
3. Исследовать возможную роль NMDA-рецепторов и фермента NO-синтазы в механизме модуляторного действия глутамата на процессы секреции ацетилхолина из двигательных нервных окончаний крысы.
Положения, выносимые на защиту:
В нервно-мышечном синапсе крысы глутамат снижает интенсивность неквантовой секреции ацетилхолина, не влияя на его спонтанное и вызванное квантовое освобождение.
Влияние глутамата на неквантовую секрецию ацетилхолина реализуется посредством активации глутаматных NMDA-рецепторов с последующим Са2+-зависимым синтезом оксида азота, который ретроградно активирует гуанилатциклазу нервных окончаний.
Научная новизна
В настоящем исследовании впервые показано, что глутамат, способный выделяться совместно с ацетилхолином из двигательных нервных окончаний, не влияя на процессы квантового освобождения медиатора, модулирует неквантовую секрецию ацетилхолина в нервно-мышечном соединении теплокровных. Данный модуляторный механизм реализуется посредством активации постсинаптических глутаматных NMDA-рецепторов, приводящей к входу ионов кальция внутрь мышечного волокна и увеличению кальций-зависимой активности фермента NO-синтазы. Образованные в саркоплазме молекулы N0 диффундируют через синаптическую щель и приводят к активации гуанилатциклазы нервных окончаний. Такое взаимодействие холинергической и глутаматергическои медиаторных систем в нервно-мышечном синапсе млекопитающих показано впервые. Особый интерес представляет тот факт, что в регуляции секреции медиатора
8 задействованы не пресинаптические, а постсинаптические глутаматные NMDA- рецепторы. Впервые в периферическом синапсе продемонстрирована необходимость функциональной связи NMDA-рецепторно-канальных комплексов и фермента N0- синтазы, активность которой зависит от ионов кальция, для реализации угнетающего неквантовую секрецию эффекта глутамата.
Научно-практическая ценность
Полученные данные расширяют наши представления о молекулярных механизмах регуляции процессов секреции нейромедиатора из двигательных нервных окончаний. Установление факта избирательной модуляции неквантового освобождения ацетилхолина глутаматом позволяет ближе подойти к пониманию физиологической роли данного вида секреции медиатора и последствий его нарушения.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях КИББ КНЦ РАН (Казань, 2001, 2002), 5-ой Пущинской конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2001), XVIII Съезде физиологов России (Казань 2001), VIII Всероссийской школе молодых ученых "Актуальные проблемы нейробиологии" (Казань, 2001), 5-ом Симпозиуме "Исследования в области нейронаук в Университете Восточной Каролины: сегодня и завтра" (Гринвилл, США, 2001), IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Республики Татарстан (Казань, 2001), IV Всероссийском симпозиуме "Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке" (Казань, 2002), международной школе-конференции "Фармакология синаптической трансмиссии в нервной системе" (Киев 2002) и на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002).
9 Структура и объем диссертации
Диссертация объемом 122 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 248 источников, из них 226 - иностранных авторов. Диссертация содержит 13 рисунков и 4 таблицы.
10 2.0БЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Метаболизм глутамата
В отличие от большинства аминокислот, глутамат может активно синтезироваться нервными клетками с высокой скоростью, соизмеримой с их метаболической потребностью.
Принято считать, что основной запас глутамата пополняется за счет обмена глюкозы и глутамина, который образуется в цитоплазме и митохондриях нейронов, однако подавляющая часть глутамина образуется в глиальных клетках. Захватывая молекулы глутамата из экстраклеточного пространства, астроциты, посредством АТФ-зависимой глутамин-синтетазы, синтезируют глутамин (Ottersen et al, 1992; Laake et al, 1995). Последний выделяется из глиальных клеток при помощи глутаминовых переносчиков в экстраклеточное пространство, откуда другим переносчиком закачивается внутрь нейрона. В норме концентрация глутамина в экстраклеточной жидкости составляет 200-500 мкмоль/л (Gjessing et al, 1972; Hamberger et al, 1983). В нервной клетке глутамат образуется либо посредством реакции дезаминирования при участии фермента глутаминазы, либо через промежуточные метаболические реакции и депонируется внутри синаптических везикул при помощи везикулярного глутаматного переносчика. Данная концепция глутамат-глутаминового цикла была предложена еще в начале 70-х (Van den Berg, Garjinkel, 1971) и по сей день получает все больше подтверждений (Westergaard et al, 1995). Несмотря на то, что значительная роль глутамина, как предшественника медиаторного глутамата, была продемонстрирована in vitro еще в конце 70-х (Hamberger et al, 1979a,b), тем не менее, работы последних лет свидетельствуют о том, что способность глутаматергических нейронов поддерживать выделение глутамата может и не зависеть от глутамина, а обеспечиваться иным метаболическим путем (Hassel, Brathe, 2000).
Особенностью метаболизма глутамата в нервной ткани является его тесная связь с интенсивно функционирующим в этой ткани циклом трикарбоновых кислот. В данном случае непосредственным предшественником для синтеза глутамата в нейроне является а-кетоглутаровая кислота, которая может превращаться в глутамат путем прямого восстановительного аминирования с участием глутаматдегидрогеназы, или путем переаминирования.
Глутамат является ключевым субстратом для многих реакций, происходящих сопряженно с циклом трикарбоновых кислот. В клетке имеется множество ферментных систем (глутаматдегидрогеназа, глутаматгрансаминаза, глутаминаза, глутаматдекарбоксилаза, и др.), способствующих его накоплению и утилизации (Meister, 1979; Ашмарин, Стукалов, 1996). 2.2.3. Глутамат как нейромедиатор
Первые предположения о медиаторной роли глутамата были выдвинуты в конце 50-х - начале 60-х гг. (Hayashi, 1954; Curtis et al, I960). Однако убедительные доказательства его медиаторной функции в ЦНС были получены лишь к концу 70-х (De Feudis, 1975; Hamberger et al, 1979a,b). На сегодняшний день общепризнанно, что глутамат занимает центральное место среди нейромедиаторных аминокислот нервной системы и является основным возбуждающим медиатором в ЦНС позвоночных (Watkins, Evans, 1981; Fonnum, 1984; Headley, Grillner, 1990). Глутаматергические синапсы распространены в коре головного мозга, гиппокампе, полосатом теле, в миндалине, стриатуме, мозжечке, сетчатке и гипоталамусе. Нисходящие глутаматергические пути обнаружены практически во всех структурах головного мозга, проекции которых идут от коры к подкорковым структурам. В спинном мозге глутамат сосредоточен в первичных афферентных волокнах дорсальных корешков (Ашмарин, Стукалов, 1996).
Большое количество исследований, посвященных выявлению физиологической роли глутаматергической медиации, позволяет говорить, что глутамат может участвовать в реализации различных физиологических процессов в ЦНС, включая процессы обучения и памяти (Fonnum, 1984; Collingridge, Lester, 1989; Headley and Grillner, 1990). Помимо этого, установлено, что глутамат играет большую роль и в процессах развития нервной системы, а именно, в механизмах установления и элиминации синаптических контактов, миграции, дифференциации и смерти нервных клеток (McDonald, Johnston, 1990; Komuro, Rakic, 1993; Johnston, 1995; LaMantia, 1995; Rajan, Cline, 1998; Rabacchi et al, 1992; Kurihara et al, 1997; Ozawa et al, 1998). Мембранные рецепторы к глутамату обнаружены не только на нейронах, но и на поверхности глиальных клеток (Hbsli and Hosli, 1993; Steinhauser, Gallo, 1996; Shelton, McCarthy, 1999).
Оксид азота II (N0) и фермент NO-синтаза в нервно-мышечном синапсе
Оксид азота II (N0) представляет собой свободнорадикальный короткоживущий (время полужизни 4-6 с) газ, молекулы которого способны выполнять разнообразные сигнальные функции в центральной и в периферической нервной системах, при этом он может выступать в роли как внутриклеточного, так и межклеточного посредника (см обзоры: Реутов и соавт., 1997; Уразаев, Зефиров, 1999; Schuman, Madison, 1994;Kobzik et al, 1994; Nathan, Xie, 1994; Garthwaite, Boulton, 1995; Reid, 1998; Stamler, Meissner, 2001). Во многом это обусловлено отсутствием специального секреторного аппарата и способностью N0 беспрепятственно проникать через клеточные мембраны, в связи с чем данная сигнальная молекула может образовываться и выделяться как из нервного окончания, так и из мышечного волокна, включая зону межклеточного контакта. Ключевым источником выработки N0 является фермент NO-синтаза. В организме позвоночных идентифицировано три формы фермента NO-синтазы, являющиеся продуктами трех генов (Nathan, Xie, 1994; Stamler, Meissner, 2001): нейрональная (тип I), индуцибельная (макрофагальная/"кальций-кальмодулин независимая", тип II) и эндотелиальная (тип III). Наличие альтернативного сплайсинга в процессе экспрессии NO-синтазы еще больше увеличивает спектр изоформ фермента. Так, в частности, нейрональная форма NO-синтазы в зрелой скелетной мышце содержит вставку из 34-х аминокислот между экзонами 16 и 17. Эта мышечная изоформа была названа ju нейрональной NO-синтазой (Stamler, Meissner, 2001). В здоровой скелетной мышечной ткани идентифицировано наличие двух изоформ NO-синтазы: нейрональной и эндотелиальной.
Нейрональная изоформа NO-синтазы обнаружена в широком спектре скелетных мышц у грызунов, птиц и человека (Уразаев, Зефиров, 1999; Reid, 1998; Stamler, Meissner, 2001). В литературе имеется ряд работ, свидетельствующий в пользу того, что этот фермент в большинстве своем локализован в волокнах быстрых мышц (Kobzik et al, 1994; Карт et al, 1997; El-Swairi et al, 1998), однако некоторые авторы сообщают о более или менее равномерной экспрессии и активности фермента, как в быстрых, так и в медленных волокнах (Grozdanovic et al, 1996; Tews et al, 1997; Gossrau, 1998). В мышечном волокне NO-синтаза сконцентрирована в районе нервно-мышечного синапса {Brenman et al, 1996;
Kusner, Kaminski, 1996; Chao et al, 1997; Christova et al, 1997; Grozdanovic, Gossrau, 1998). Показано, что такое "заякоривание" фермента обеспечивается связью с xi-синтрофином, дистрофин-ассоциированным белком {Brenman et al, 1996). В то же время в мембране нейронов нейрональная NO-синтаза способна непосредственно взаимодействовать с NMDA-рецептором через белок PSD-95 {Kornau et al, 1995), что, по-видимому, может иметь место и в постсинаптической мембране мышечного волокна {Luck et al, 2000; Stamler, Meissner, 2001).
Экспрессия эндотелиалъной NO-синтазы выявлена в камбаловидной мышце, в длинном разгибателе пальцев крысы (Kapur et al, 1997), а также в культурах дифференциированных миобластов мыши и зрелой мышечной ткани крысы {Blottner, Luck, 1998). Хотя уровень экспрессии относительно невысок, тем не менее, иммунологическими методами установлено, что эта изоформа со-локализована с митохондриями скелетных мышечных волокон {Kobzik et al, 1995; El-Swairi et al, 1998) и может иметь определенное физиологическое значение {Kobzik et al, 1995; Reid, 1998; Stamler, Meissner, 2001).
Активность индупибелъной NO-синтазы в мышцах теплокровных варьирует в зависимости от вида и состояния здоровья особи. Так, установлено, что экспрессия этой формы фермента сильно увеличивается в скелетных мышечных волокнах пациентов с хроническими заболеваниями сердца {Riede et al, 1998), а у животных после воздействия бактериальными липополисахаридами или воспалительными цитокинами {Boczkowski et al, 1996; El-Swairi et al, 1998). В нормальной же мышце здоровых грызунов и человека экспрессия NO-синтазы отсутствует или представлена крайне слабо {Thompson et al, 1996; Boczkowski et al, 1996; Park et al, 1996; Kapur et al, 1997; Stamler, Meissner, 2001).
Активность NO-синтаз регулируется на уровне транскрипции, трансляции и на посттрансляционном уровне. В частности, экспрессия нейрональной NO-синтазы увеличивается при травме (Rubinstein et al, 1998), во время мышечной активности {Baton, Nadler, 1997) и снижается после денервации (Tews et al, 1997).
Влияние глутамата на неквантовое освобождение ацетилхолина
Как было указано в обзоре литературы, неквантовая секреция медиатора является наименее изученным видом освобождения ацетилхолина. Поскольку данных о влиянии глутамата на неквантовую секрецию ацетилхолина в нервно-мышечном соединении позвоночных на настоящий момент нет, то этот раздел работы представляет особый интерес.
В экспериментах на френико-диафрагмальном препарате крысы в стандартном растворе Рингера-Кребса величина МПП в синаптической области мышечных волокон после ингибирования ацетилхолинэстеразы составляла-72.7±0.3 мВ (п=108). Добавление в раствор d-тубокурарина приводило к смещению потенциала покоя в сторону гиперполяризации до -77.8±0.3 мВ (п=108). Таким образом, контрольное значение Н-эффекта составляло 5.1±0.3 мВ (рис. 4.5), что соответствует литературным данным (Vyskocil et al, 1983; Mukhtarov et al, 2000). Добавление глутамата концентрационно-зависимо снижало величину Н-эффекта (рис. 4.5). Так, в концентрации 10 мкмоль/л аминокислота не оказывала заметного влияния на Н-эффект, значение которого при этом составляло 4.9±0.2 мВ (п=108;/ 0.05), тогда как глутамат в концентрации 20 мкмоль/л снижал величину Н-эффекта до 4.1±0.3 мВ (п=108; р 0.05). Увеличение концентрации глутамата до 50 мкмоль/л приводило к дальнейшему снижению величины Н-эффекта, которая составила 3.3±0.4 мВ (п=108 и jp 0.05). При использовании 100 мкмоль/л или 1 ммоль/л глутамата не отмечалось дальнейшего снижения Н-эффекта, который в этих экспериментах составлял 3.2±0.3 и 3.0±0.2 мВ, соответственно (в обоих случаях п=108). Из анализа кривой "концентрация-эффект" следует, что значение ЕС50 (50% эффективной концентрации) для глутамата в данной серии экспериментов составляло 21.3 мкмоль/л.
Результаты данной серии экспериментов позволяют заключить, что добавление глутамата приводит к концентрационно-зависимому угнетению неквантовой секреции ацетилхолина из двигательных нервных окончаний крысы. Данный эффект аминокислоты может реализовываться как через ионотропные, так и метаботропные глутаматные рецепторы. В отличие от эмбрионального нервно-мышечного синапса Xenopus, где продемонстрирован весь спектр глутаматных рецепторов (Хге et al, 1993; Fu et al, 1995; Liou et al, 1996; Fu, Liu, 1997; Fu et al, 1998), в концевой пластинке крысы на сегодняшний день выявлены лишь ионотропные NMDA-рецепторы (Berger et al, 1995; Urazaev et al, 1995; Grozdanovic, Gossrau 1998; Urazaev et al, 1998). Возможно, что и в нашем случае угнетение неквантовой секреции ацетилхолина глутаматом может быть опосредовано NMDA-рецепторами, однако пока нет оснований отрицать возможность участия в изучаемых процессах и других видов глутаматных рецепторов. В этой связи представляют интерес данные, полученные в растворе Рингера-Кребса, содержащем глицин, необходимый для активации NMDA-рецепторов глутаматом.
При изучении влияния глутамата на интенсивность неквантового освобождения медиатора в содержащем глицин растворе Рингера-Кребса, оказалось, что само присутствие в среде глицина, без глутамата, снижало Н-эффект до 3.1±0.3 мВ (п=108; р 0.05; рис. 4.5). Глутамат, добавленный в раствор с глицином, также оказывал концентрационно-зависимое угнетающее влияние на величину Н-эффекта, как это наблюдалось в стандартном растворе Рингера-Кребса. При этом действие глутамата в присутствии глицина было выражено значительно сильнее, и его максимальный эффект достигался при более низких концентрациях (рис. 4.5). Так, при концентрации глутамата в 1 мкмоль/л величина Н-эффекта составляла 3.0±0.3 мВ (п=108), что не отличалось от контрольного значения, полученного в растворе с глицином (р 0.05). Увеличение концентрации глутамата до 5 и 10 мкмоль/л приводило к снижению Н-эффекта до 2.0±0.3 и 1.5±0.3 мВ, соответственно (в обоих случаях п=108 и р 0.05). Максимальный эффект глутамата достигался в концентрации 50 мкмоль/л: величина Н-эффекта при этом составляла 1.3±0.4 мВ (п=108; р 0.05). Увеличение концентрации до 100 мкмоль/л и 1 ммоль/л не приводило к дальнейшему снижению Н-эффекта (1.3±0.3 мВ, n=108). ЕС50 для эффекта глутамата в растворе Рингера-Кребса, содержащем глицин, составляла 4.2 мкмоль/л, что в 5 раз меньше подобного значения, определенного для глутамата в растворе стандартного состава.
Полученные данные свидетельствуют о том, что глутамат способен концентрационно-зависимо угнетать интенсивность неквантовой секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе крысы. Поскольку показана роль неквантово выделяемого ацетилхолина в процессах установления и развития нервно-мышечного контакта (Young, Роо, 1983; Sun, Роо 1985; Vyskocil, Vrbova, 1993), в нервном контроле ионных транспортных систем постсинаптической мембраны, определяющих уровень МПП мышечных волокон {Urazaev et ah, 1997, 1999, 2000) и в процессах десенситизации ацетилхолиновых рецепторов (Thesleff, 1990), то есть основания думать, что выявленное нами угнетающее действие глутамата может иметь физиологическое значение.
Усиление угнетающего Н-эффект действия глутамата в присутствии глицина, свидетельствует в пользу того, что это влияние на неквантовую секрецию ацетилхолина опосредуется скорее всего активацией NMDA-рецепторов. А тот факт, что сам глицин приводит к значительному снижению интенсивности неквантовой секреции, можно интерпретировать как косвенное доказательство наличия в синаптической щели эндогенного глутамата.
Поскольку максимальное угнетающее Н-эффект влияние глутамата в стандартном растворе Рингера-Кребса достигалось в концентрации 1 ммоль/л, а в растворе с добавлением глицина - 50 мкмоль/л, то в дальнейших экспериментах глутамат использовали в концентрации 100 мкмоль/л.
Влияние гемоглобина на эффект глутамата
Установлено, что в нервно-мышечном синапсе млекопитающих NO-синтаза локализуется на постсинаптическом уровне, и ассоциирована с синаптическими образованиями сарколеммы (Brenman et al, 1996; Christova et al, 1997; Grozdanovic, Gossrau, 1998; Luck et al, 2000; Stamler, Meissner, 2001). Показано, что как экзогенное увеличение концентрации молекул N0 (с помощью доноров NO), так и эндогенное (путем повышения концентрации субстрата для синтеза N0 L-аргинина) приводит к угнетению неквантовой секреции ацетилхолина (Mukhtarov et al., 2000). Логично было предположить, что и в нашем случае постсинаптический эффект глутамата, опосредованный активацией NO-синтазы в саркоплазме мышечного волокна, реализуется через ретроградное действие молекул N0, угнетающих неквантовую секрецию ацетилхолина. Это предположение было проверено в экспериментах с добавлением в перфузионную среду гемоглобина. Данное вещество широко используется при изучении N0 как межклеточного переносчика информации, поскольку молекулы гемоглобина не проникают в клетки, но способны улавливать и прочно связывать N0 в межклеточном пространстве (Meller, Gebhart 1993). Добавление в раствор Рингера-Кребса стандартного состава гемоглобина (10 мкмоль/л) приводило к увеличению контрольного значения Н-эффекта до 6.2±0.3 мВ (п=108; рис. 4.11а). Эффект глутамата, апплицированного на фоне гемоглобина, отсутствовал, и величина Н-эффекта не изменялась, составляя 6.3±0.2 мВ (п=108;/? 0.05; рис. 4.11 а). Увеличение интенсивности неквантовой секреции ацетилхолина в присутствии гемоглобина может служить очередным доказательством наличия эндогенной активности NO-синтазы (Nakane et ah, 1993; Kobzik et al.,1994; Balon, Nadler, 1997; Stamler, Meissner, 2001) и ее непрерывного контроля неквантового освобождения медиатора (Mukhtarov et ah, 2000). Полное устранение эффекта глутамата гемоглобином, в свою очередь, свидетельствует о необходимости пересечения молекулами N0, синтезированными в мышечном волокне под действием аминокислоты, синаптической щели для дальнейшей реализации эффекта в нервном окончании. Результаты, полученные в растворе с добавлением глицина, подтверждают этот вывод. Контрольное значение величины Н-эффекта в глицин-содержащем растворе при добавлении гемоглобина не отличалось от значения, полученного в безглициновом растворе Рингера-Кребса, и составляло 6.0±0.3 мВ (п=108; рис. 4.116). Добавление глутамата в присутствии гемоглобина, как и в предыдущей серии экспериментов, не оказало влияния на величину Н-эффекта (5.9±0.3 мВ, п=108; р 0.05; рис. 4.116). 85 Таким образом, акцептор молекул N0, находящихся в синаптической щели, гемоглобин полностью устраняет эффекты как глутамата, глицина, так и эффект глутамата, потенциированный глицином. Полученные данные позволяют заключить, что угнетающее неквантовую секрецию ацетилхолина действие глутамата, опосредованное активацией NMDA-рецепторов и увеличением активности NO-синтазы, осуществляется при участии молекул N0, синтезированных в мышечном волокне, диффундирующих через синаптическую щель и действующих на двигательную нервную терминаль. 4.2.3. Изучение механизма действия N0, синтезируемого под влиянием глутамата Установлено, что механизм физиологического действия N0 базируется на взаимодействии молекул оксида с тиоловыми группами и/или переходными металлами в составе белков (Stamler, 1994; Stamler et al, 1997). При этом показано, что одной из важнейших мишеней для N0 в большинстве тканей является растворимая гуанилатциклаза {Murad, 1994, 1996). Связывание N0 с Fe2+ в простетической группе молекулы фермента приводит к активации последнего, в результате чего повышается уровень цГМФ (Wolin et al, 1982; Murad, 1996).
В связи с этим представляло интерес выяснить, как молекулы N0 приводят к снижению интенсивности неквантовой секреции ацетилхолина: действуют ли они непосредственно на механизм неквантового освобождения или же опосредовано - через систему внутриклеточных посредников, и в частности через систему цГМФ.
Для выяснения того, участвует ли гуанилатциклаза нервного окончания в модулирующем механизме действия глутамата, были проведены эксперименты со специфическим блокатором NO-чувствительной гуанилатциклазы - ODQ.
