Пикосекундная спектроскопия процессов деления и рекомбинации зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rps. sphaeroides и ФС I высших растений Аврамов Лъчезар Аспарухов

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы

1. Фотосинтетические реакционные центры пурпурныхбактерий 9

1.1 Структура и состав реакционных центров 9

1.2 Последовательность фотохимических процессов переноса электрона в РЦ 10

1.3 Рекомбинация зарядов в радикальной паре реакциг :: онного центра 22

2. Реакционные центры фотосистемы I 31

Глава 2. Методы исследования и приготовления образцов

1. Лазерный стенд для получения перестраеваемых по частоте пикосекундных импульсов света 41

1.1 Генератор пикосекундных импульсов света 41

1.2 Выделение одиночного импульса и его усиление 45

1.3 Получение перестраеваемых по частоте импульсов света с помощью ПГС и генерация континуума 48

2. Автоматизированная система регистрации и управ ления абсорбционным спектрометром 52

2.1 Оптическая схема регистрирующей части и фотоприемники 52

2.2 Апаратурное обеспечение системы регистрации и управления спектрометром 54

2.3 Програмное обеспечение 56

2.4 Исследование статистических характеристик пи-косекундной лазерной установки 60

3. Методика спектрально-кинетических измерении и обработки результатов 64

4. Методика приготовления образцов 71

Глава 3. Экспериментальные результаты

1. Математическая обработка результатов 74

2. Кинетика первичного разделения зарядов в реак ционных центрах бактерии . 81

3. Исследование рекомбинации зарядов в РЦ 92

4. Исследование переноса энергии и электрона в ПБК фотосистемы I 101

5. Рекомбинация зарядов в РЦ фотосистемы I 114

Заключение 121

Литература 126

• Последовательность фотохимических процессов переноса электрона в РЦ
• Генератор пикосекундных импульсов света
• Получение перестраеваемых по частоте импульсов света с помощью ПГС и генерация континуума
• Кинетика первичного разделения зарядов в реак ционных центрах бактерии

Введение к работе

Фотосинтез - это, пожалуй,самый важный процесс на Земле, ибо благодаря ему возникла и поддерживается в настоящее время жизнь на планете. Суть процесса заключается в его наименовании: за счет энергии света в результате многоступенчатых биохимических реакций синтезируются органические соединения. Кроме того, зеленые растения и водоросли в процессе фотосинтеза разлагают воду и выделяют свободный молекулярный кислород - активнейший природный окислитель.

Исследованием фотосинтеза занимаются люди самых различных специальностей - как представители фундаментальной науки: физики, химики, биологи, так и ученые прикладного профиля - технологи, конструкторы электронных устройств, ученые - агрономы и другие. И несмотря на то, что сегодня мы знаем довольно много о механизмах отдельных стадий фотосинтеза, цельного и полного представления об этом природном процессе у нас нет. Соответственно,

человек пока еще не может влиять на протекание процесса в целом или эффективность тех или иных его частных реакций и, тем самым, использовать этот уникальный природный механизм или его детали в своей деятельности. Именно стремление разобраться во всех тонкостях фотосинтетического процесса и привлечь основополагающие принципы его организации для решения практических задач и определяет неизменный и глубокий интерес ученых разных специальностей к его изучению.

Как известно, из всей совокупности фотосинтетических реакций условно выделяют первичные. К ним относятся: поглощение света молекулами-светосборшиками, миграция энергии в светособираю-щих пигмент-белковых комплексах, захват возбуждения фотоактивными

молекулами реакционных центров /РЦ/, деление зарядов и перенос электрона в пределах РЦ. При этом, квантовый выход первичного фотоокисления донора электрона РЦ близок к I /I/, а величина запасенной в РЦ энергии составляет 33% от энергии света, поглощенной фотоактивным пигментом РЦ /2/. Очевидно, использование явления фотосинтетического преобразования световой энергии в электрическую в искусственных фотопреобразователях сулит человечеству огромную выгоду, ибо в такой "электростанции" используются возобновляющиеся компоненты.

Перечисленные выше первичные стадии фотосинтеза протекают

в широком интервале времен: миграция энергии электронного воз-

ТТ -Q -12 -ТТ

буждения за 10 ^х - 10 ^с; деление зарядов в РЦ за 10 ^х - 10 ^хс;

перенос электрона по акцепторной цепи реакционного центра за Ю"*-*- - 10~с, перенос электрона от вторичного донора к фотоактивному РЦ за 10 -10~с /3-Ю/. Соответственно, нужны экспериментальные методы исследования первичных процессов фотосинтеза необходимого временного разрешения.

Традиционными экспериментальными подходами к изучению первичных процессов фотосинтеза являются импульсная флуорометрия и абсорбционная спектроскопия. Каждый из этих методов имеет определеннее преимущества и присущие только ему недостатки. Поэтому, информация, получаемая в независимых опытах с использованием флуоресцентной и абсорбционной техники, не всегда согласуется. К сожалению, до настоящего времени ни одна Лаборатория не выполнила одновременного исследования совокупности первичных процессов фотосинтеза методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии. Однако только совмещение этих методов в одном эксперименте в определенных случаях может дать достоверную информацию об исследуемых процессах. Например, комплекс РЦ фотосистемы I высших растений в чистом виде не изолируется, поэтому каждый выделегшыи комплекс содержит несколько десятков светособирающего

хлорофилла на один РЦ. Поэтому ни с помощью абсорбционной, ни флуоресцентной спектроскопии нельзя получить точную количественную информацию о скорости деления зарядов в РЦ, тогда как измерение кинетик флуоресценции и изменений поглощения в соответствующих областях спектра позволяет решить эту пробшему.

Кроме того, несмотря на относительно длительное /==-10 лет/ время применения пикосекундной техники в гоотобиологическюг исследованиях, не все проблемы методического характера, включающие особенности получения экспериментальных кривых и их математической обработки решены. Например, пока не реализована методика отбора импульсов света по длительности, нет единой методики обсчета кривых. Следовательно, совершенствование экспериментальных методов и математических подходов к извлечению содержащихся в экспериментальных зависимостях результатов имеет большое значение как для истолкования полученных данных, так и для развития пикосекундной спектроскопии вообще.

Наконец, в литературе имеется недостаточно данных по нано-секундной рекомбинации радикальной пары, возникшей в РЦ в результате разделения зарядов. Вместе с тем, получение полной информации по флуоресцентной и абсорбционной методикам может дать исключительно важную информацию о состояниях, через которые про-ходитРЦ в процессе деления зарядов и переноса электрона.

Исходя из вышесказанного, целью данной работы являлось: исследование последовательности первичных процессов фотосинтеза

то о

во временном диапазоне КГ¹ - 10~с. методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии в одном эксперименте, для получения более полной.информации о состояниях реакционного центра, реализуемых в процессе переноса электрона, исследовать рекомбинацию зарядов в РЦ пурпурных бактерий и фотосистемы І. В качестве объектов использовались препараты реакционных центров пурпурных

бактерий и комплексы реакционных центров фотосистемы I.

В результате работы над диссертацией собран автоматизированный пикосекундный абсорбционный спектрометр, имеющий временное разрешение +3 пс. Разработана методика контроля и отбора импульсов возбуждающего и зондирующего света по длительности. Предложена методика обработки экспериментальных данных, позволяющая достигнуть разрешения + 3 пс при точности измерения кинетик -Я

3*10 единиц оптической плотности.

В одновременном эксперименте на пикосекундном импульсном флуорометре, работающем в режиме накопления и тлеющем временное разрешение 1,5 - 2,0 пс, и абсорбционном спектрометре исследованы кинетики разделения зарядов в РЦ Rps. ^Wvoides,. Установлено, что реакция деления зарядов в РЦ осуществляется за 6-7 пс, причем кинетика деления зарядов - моноэкспоненциальна.

Исследована кинетика рекомбинации зарядов в РЦ Rps. spUaeroicUs в восстановительных условиях /Q*"j в темноте/ а также в образцах, лишенных хинонных акцепторов. Обнаружены два рекомбинационных компонента с временами ~1 не и~10 не, начальные амплитуды этих компонентов примерно одинаковы. Установлено, что магнитное поле не влияет на кинетику рекомбинации зарядов каротиноид-содержа-щих РЦ. Предложена модельная схема состояний РЦ, удовлетворяющая экспериментальным результатам.

Изучены миграция энергии, деление зарядов и перенос электрона на первичный акцептор /железо-серный белок/ в комплексе РЦ фотосистемы I. Составлена математическая модель, описывающая совокупность перечисленных процессов. Определены константы исследованных реакций.

Измерена скорость рекомбинации зарядов в РЦ фотосистемы I в условиях, когда первичный акцептор '/ Ре -в белок/ восстановлен в темноте или удален при выделении препарата. В пределах точности измерения магнитное поле не оказывает влияния на кинетику

наносекундной рекомбинации радикальной пары в РЦ фотосистемы I. Полученные результаты расширяют и углубляют наши представления о последовательности и скоростях первичных реакций в РЦ пурпурных бактерий- и фотосистемы I высших растений. Они могут быть использованы для дальнейшего изучения первичных реакций фотосинтеза, а также иметь прикладное значение для создания искусственных фютопреобразователей. Методические достижения данной работы могут оказаться полезными для дальнейшего совершенствования метода пикосекундной абсорбционной спектроскопии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ I. Фотосинтетические реакционные центры пурпурных бактерий.

I.I. Структура и состав реакционных центров.

Реакционные центры /РЦ/ входят в состав фотосинтетических мембран бактерий и представляют собой пигмент-белковые комплексы, в которых происходит первичное разделение и стабилизация разделенных зарядов. Разработка методики препаративного выделения чистых РЦ, свободных от пигментов антенны и других компонентов фотосинтетического аппарата /11-13/, способствовала успехам в изучении первичных процессов фотосинтеза. К настоящему времени чистые РЦ выделены из многих видов фотосинтезирутощих бактерий /14/, но наибольшей простотой выделения и устойнивостью обладают РЦ, выделенные из бескаротиноидного штамма бактерий Rhoclop-seudomonas sptaenn'cUs и поэтому наиболее изучены.

Препараты реакционных центров, выделенных из хроматофоров, представляют собой пигмент-белковые комплексы с молекулярной массой~ 80*10 /15/. По данным электрофореза в полиакриламид-ном геле с додецилсульфатом натрия, в состав отдельного комплекса РЦ входят три гидрофобных белковых субъединицы - Н,Ы и L с молекулярной массой 28*10 , 24'10^ и 21*10 . Частицы М и L включают в себя 4 молекулы бактериофилла /Е&я/ и 2 молекулы бак-териофеофитина /Бф/, а также 1-2 молекулы убихинона и один атюм железа /13,16/

По данным электронной спектроскопии, комплексы реакционных центров Rips. <,ркаетоіДе<ь при удалении детергента представляют собой палочковидные структуры размером 80 А _х 200 $. /13/.

Исследования с помощью поляризованного света показали, что РЦ имеют удлиненную форму и расположены в мембране примерно пер-

пеыдикулярно плоскости мембраны /17/. В состав РЦ входят четыре молекулы Бхл, две из которых образуют димер - специальную пару, обозначаемую Р870 и имеющую полосы поглощения при 870 нм /CL -переход/ и 605 нм /Q_x -переход/. Две другие /Р800/ имеют полосы поглощения в полосах 760 нм и 535 нм /18,19/.

Данные по круговому дихроизму дают основание предполагать, что порфириновые кольца молекул пигментов входящих в состав РЦ, фиксированы параллельно друг другу или близки к этой ориентации /20/. Наличие в спектре кругового дихроизма РЦ двух полос противоположного знака- при 715 и 810 нм и положительной полосы с , максимумом при 860 нм указывает на то, что молекулы пигментов находятся в сильном взаимодействии, аотоокисление Р870 приводит к нарушению экситонного взаимодействия пигментов, что приводит к сильному изменению спектра кругового дихроизма /21/. В работе /20/ были предприняты попытки нахождения детальной конфигурации относительного расположения пигментов. Основываясь на

спектрально-кинетических данных были рассчитаны расстояния меж-

о ду Р700 и Бф 6 А и Бф и первичным акцептором хинонной природы

/q з/** 7 А.

В последнее время был выполнен рентгеноструктурный анализ мембранных белковых комплексов РЦ из ^. vriucUs и дана трехмерная модель РЦ /22/. В целом результаты /22/ подтверждают основные выводы о структуре и составе РЦ, полученные другими методами.

1.2. Последовательность фотохимических процессов переноса электрона в реакционном'^чцентре.

Согласно современным представлениям в РЦ происходит преобразование энергии электронного возбуждения, возникшего в результате поглощения кванта света в энергию разделенных зарядов. Этот процесс осуществляется путем переноса электрона от фотовозбужденного бактериохлорофильного димера Р870 на первичный стабиль-

- II -

ный акцептор Q j /первичный хинон/. Электрон от Qj затем переносится на вторичный хинон Q 2' ^а Р^^⁺ восстанавливается цито-хромом типа с.

Разработка лазерных спектрометров и спектрофлуориметров с пикосекундным временным разрешением позволила исследовать кинетику процесса фотовыцветания Р870 и последующего переноса электрона на Q j. Оказалось, что перенос электрона происходит через ряд промежуточных состояний /19,23/. Кроме коротких времен, особенностью функционирования РЦ является независимость от температуры квантового выхода фотоокисления Р870, который достигает 100% и остается неизменным вплоть до I К/ 5/.

Первичный донор электрона. Существует ряд фактов, которые указывают на то, что Р870 является первичным донором электронов в РЦ. Окисление Р870 приводит к потере фотохимической активности РЦ /25/. После этого происходит окисление цитохрома, который отдает свой электрон на Р870⁺ /26/.

Освещение РЦ или химическое окисление приводит к выцветанию полос поглощения 870 нм и 600 нм, сдвигу полосы при 370 нм и появлению новых полос при 425 їж и 1245 нм /18/, наблюдается также сдвиг полосы 800 нм в коротковолновую сторону. Окислителнно-восстановительное титрование показало, что Р870 является одно-электронным переносчиком с окислительно-восстановительным потенциалом 450 мВ /27/.

Однеэлектронное окисление Р сопровождается появлением сигнала ЭПР с -фактором 2,0026 /28/, имеющего гауссову форму, причем кинетика появления и затухания сигнала ЭПР совпадает с таковой, измеренной по оптическим абсорбционным изменениям /29/. Сигнал ЭПР катион-радикала Бхл ш \r(tvo имеет такой же & -фактор, но ширина его линии/приблизительно в (2* больше, чем ширина сигнала ЭПР Р870⁺. Приведенные факты свидетельствуют о делокализации

неспаренного электрона по двум молекулам Бхл в Р870. Дополнительным подтверждением этому являются данные, полученные с помощью измерения спектров двойного электронно-ядерного резонанса. Было найдено, что величина сверхтонких расщеплений в спектре Р870⁺ в 2 раза меньше соответствующих величин для катион-радикала Бхл Ы /30/.

Бремя жизни синглетного возбужденного сосояния Р870, рассчитанное из измерений квантового выхода флуоресценции изолирован-ныхРЦ согласно данным работы /31/, оказалось равным 7 пс. Близкие значения были получены путем прямого измерения времени жизни флуоресценции РЦ с помощью пикосекундного флуорометра. Кинетика затухания флуоресценции препаратов с активным РЦ при комнатной температуре имеет две компоненты. Быстрый компонент имеет длительность 5 + 2 пс и исчезает при окислении Р870 и характеризует время жизни Р870. Медленный - длительностью I - 2 не связан либо с флуоресценцией солюбилизированного бактериохлорофилла, либо с рекомбинационным свечением /4/.

Первичный акцептор электрона. Основным доказательством существования промежуточных акцепторов электрона послужил тот факт, что разделение зарядов происходит в том случае, когда акцептор электрона хинонной природы химически восстановлен. Действительно, с развитием лазерной пикосекундной техники в работах /32-35/, при возбуждении образца пикосекундным импульсом с длиной волны 530 нм было обнаружено новое состояние /Р /, которое включает в себя выцветание полос Бф при 545 нм и 760 нм и полис Бхл при 600 нм, 800 нм и 870 нм.

Нужно отметить, что возможность существования промежуточ-ныхакцепторов была предсказана в работе /36/ на основании анализа флуоресцентных данных по миграции энергии электронного возбуждения от Бхл антенны к реакционному центру. Было показано, что для обеспечения высокого квантового выхода разделения зарядов

- ІЗ -

и достаточно медленной их стабилизации, необходимо существование короткокивущих промежуточных стадий.

Последующие исследования с помощью пикосекундных абсорбционных спектрометров дали информацию о кинетике образования и дезактивации состояния Р в условиях, когда акцептор электрона Q, j не восстановлен. Как показано в работах / 32,37/, разделение зарядов в порфириновом комплексе РЦ происходит за время меньшее 10 пс, а образующееся в результате состояние Р живет в течение 150-240 пс и его исчезновение сопровождается переносом электрона на акцептор Q j /32,35,38,39/. При этом увеличение поглощения

в полосе 1250 нм, возникающее вследствие окисления первичного

р донора Р870, возникает одновременно с образованием состояния Р

и затем сохраняется в течение десятков миллисекунд/34/.

Изучение природы промежуточного акцептора /I / проводилось с помощью анализа спектральных изменений как в пикосекундном диапазоне времен, так и(стационарных услових. Последнее возможно благодаря тому, что длительное освещение реакционных центров ряда пурпурных бактерий в условиях низкого редокс. потенциала среды приводит к накоплению промежуточного акцептора І в восстановительном состоянии /40-42/.Если РЦ освещать в восстановительных условиях в присутствии донора электрона /низкопотенциальных цитохромов/, то перенос электрона может конкурировать с внутренними процессами, протекающими в РЦ. Поскольку состояние Р870 I~Qj стабильно в течение многих минут, то происходит постепенное накопление такого состояния

РЩ~_Г-» P*l"Q"_I— P⁺I~Q7—> Р I~Gf х

Цит —» Цит⁺ Индуцируемое светом накопление РЦ с восстановленным: промежуточным акцептором было получено впоследствие и для

RbS. <&ілдесеі<1е при добавлении цитохрома с в сочетании с дитиони-том натрия /43/. Дифференциальный спектр фотовосстановления I характеризуется, переходными изменениями полосы Бхл при 800 нм и выцветанием полос Бф при 543 нм и 760 нм /41/. Эти данные, а также результаты работы /44/, в которой показано соответствие дифференциального спектра поглощения состояния Р и спектра образования ион-радикальной пары Р870⁺Бф"" показывают, что промежуточным акцептором электрона I является бактериофеофитин.

Характер спектра ЭПР восстановленного переносчика Бф~ /узкая линия с -фактором 2,0025 и шириной полосы 12,5 Гс/ указывает на то, что неспаренный электрон локализован только на одной молекуле Бф /41/. При низких температурах спектральная полоса ЭПР-сигнала расщепляется на две и зависит от мощности СВЧ-из-лучения и температуры /45/. Анализ фотовосстановления Бф при низкой температуре показал, что этот процесс сопровождается окислением только одного цитохрома и представляет собой одноэлектрон-ный перенос. При исследовании формирования сигнала ЭПР Бф~ авторы работы /43/ объяснили расщепление сигнала ЭПР магнитным взаимодействием неспаренного % -электрона Бф" с восстановленным Gj7.

Данные по исследованию окислительно-восстановительного потенциала пары Бф/Бф" существенно различаются. Так, авторы /46/, анализируя светоиндуцированный сигнал ЭПР триплетного состояния бактериохлорофилла РЦ, получили среднеточечный потенциал, равный -400 мВ, в то время как в работе /40/, исследуя величину абсорбционных изменений у бактерий Ц%. , получили потенциал, равный -620 мВ. Химически восстановить бактериофеофитин удалось лишь у одного вида бактерии - Rp$, vriruUs

Таким образом, реакцию переноса электрона от бактериохлорофилла реакционного центра можно записать в виде

PIQ_IQ₂J2^ p*I G^Qg— p+I-QjG^KS p+I Q-Q₂_^ p+I Q^

Возникает вопрос, каковы функции двух других молекул бакте-риохлорофилла и одной молекулы бактериофеофитина в реакционном центре. Б работе /47/ на основании изучения изменения поглощения в полосе 8С0 нм с помощью пикосекундного абсорбционного спектрометра было выдвинуто предположение, что одна из молекул бакте-риохлорофилла, поглощающая в области 800 нм функционирует как дополнительная промежуточная ступень при разделении зарядов между Р870 и Бф. Зто предположение в дальнейшем было усилено данными по изменению спектра кругового дихроизма РЦ, происходящего на начальном этапе разделения зарядов между PS70 и Еф. Было показано, что экситонное взаимодействие между Р870 и Бф отсутствует, в то не время Р870 взаимодействует с бактериохлорофиллом, поглощающим в области 810 нм. Бактериохлорофилл, поглощающий при 800нм взаимодействует с Бф, поэтому он, вероятно, расположен между Р870 и Еф и может участвовать в переносе электрона между ними /48/, его обозначают обычно как В.

В дальнейшем было обнаружено, что спектры состояний Р и Р изменяются с понижением температуры /49,50/. В области 800 нм наблюдалось заметное выцветание полосы при 293К по сравнению с 77К. Это позволило сделать авторам вывод, что Р состоит из двух состояний, одно из которых представляет собой синглетное состояние радикальной пары [Р870⁺Бф~], а другое - синглетное состояние комплекса с переносом заряда ^t[P870⁺B~].

Расположение в энергетической шкале уровня состояния ^Гр870⁺В""1 ^наиД^{ено из} температурной зависимости примеси состояния [^870^- ""] к состоянию [p870"^»"l при измерениях состояния P . Было найдено, что уровень состояния ^870⁺ В"]расположен на 0,025 эВ выше, чем уровень ¹[р870+Бф-]_# Измерение энергетического зазора между ^ [Р870+БФ"] и P870 в РЦ R^s. «ь^а^го ides дало значение 0,05 эВ /51/. Это означает, что состояние )1^870^--^

лежит ниже на 0,025 эВ уровня Р870 .

В этом случае можно полагать, что в спектре длинноволнового поглощения Р870 будут наблюдаться два перехода, разделенных расстоянием 0,025 эВ. Действительно, в работах /39,52/ было обнаружено два таких перехода в спектре поглощения Щ R... isxYicUs при 4,2 К в полосах 1000 нм и 1014 нм. При этом при восстановлении Бф один переход при 1014 нм выцветает, тогда как при 1000 нм смещается в коротковолновую сторону. Этот факт указывает на отсутствие дополнительных молекул между молекулами В и Бф, так как восстановление Бф должно существенным образом изменять энергию состояния ¹[Р870⁺В~]. Характерно, что расщепление длинноволновой полосы РЦ наблюдается только при температуре 4К и не обнаруживается в спектре поглощения и в спектре флуоресценции при 77К/53/

Приведенные выше данные свидетельствуют в пользу того, что перенос электрона на Бф происходит через промежуточное состояние ^Р870⁺В"1.Однако на основе измерений динамики изменений поглощения РЦ в полосе 800 нм, авторы /54/ пришли к заключению, что стадия локализации электрона на В при разделении зарядов в РЦ отсутствует.

Результаты пикосекундной флуорометрии /55/, а также пикосе-кундной спектроскопии РЦ в состоянии Р870 1~также не внесли ясность в представления о промежуточных переносчиках электрона. В условиях, когда Бф был заранее восстановлен, разделение зарядов с образованием -*-[Р870⁺В~] у бактерий R.. vriricUs при возбуждении пикосекундннм импульсом света в работе /56/ не обнаружено. У R. vnvtolis в этих, условиях было зарегистрировано возбужденное состояние первичного донора с временем жизни 20 пс /57/, а у fys.^UeirotcUs зарегестрировано не индентифицированное состояние РЦ с временем жизни 340 пс /58/.

новлен, электрон с Бф" за время** 200 пс переходит на акцептор непорфириновой природы 6(j, представляющий собой комплекс хинона

и железа, /19,59/. Изменения поглощения , отражающие переход Q-r—*Q сопровождаются выцветанием полосы при 290 ни и появлением структурированной полосы в области 300-450 нм. Эти изменения сходны с абсорбционными изменениями при образовании анион-радикала хинона ("и viiro /7/. Процесс восстановления Qj сопровождается также сдвигами полос Бф, что указывает на пространственную .близость бактериофеофитина и первичного хинона /60/. В работе /61/ сделано предположение, что эти изменения отражают электрохромный сд&иг полос поглощения Бф в ответ на образование локального электрического поля при восстановлении хинона.

При низких температурах освещение РЦ приводит к появлению как узкого сигнала ЭПР Р870⁺, так и широкого сигнала /~ 600 гаусс/ с б =1,82, которые имеют идентичные кинетики /62/. Так как появление широких сигналов ЭПР обычно связано с ионами металлов, естественно было приписать сигнал^ = 1,82 атому железа, присутствующему в РЦ. Однако, было обнаружено, что атвм железа может быть замещен атомом марганца путем выращивания бактерий в среде, обогащенной марганцем. В этом случае кинетики ЭПР сигнала примерно одинаковы как для полосы Fe , так и Мп ; что указывает на функциональное замещение лее леза марганцем /63/.

В препаратах, лишенных железа, фотохимическая активность сохраняется, при этом регистрируется сигнал ЭПР убисемихинона с 0"-фактором 2,005 и дН = 8 Гс /64/. Была применена мессбауэров-ская спектроскопия для решения вопроса о валентности железа в исходном и восстановленном состоянии РЦ. С этой целью были выделены РЦ из бактерий, выращенных на среде с ⁵⁷Fe. Было найдено, что при восстановлении РЦ дитионитом появляется сигналЭПР с

мало измененными. Эти данные показали, что железо в реакционном центре сохраняет валентность Fe независимо от того окислен Q j или восстановлен /65/.

Полная экст|>*кция убихинона приводит к потере фотохимической активности РЦ и к исчезновению ЭПР сигнала с (f -фактором 1,82. При добавлении убихинона происходит восстановление фотохимической активности РЦ и появление сигнала ЗЇЇР /66/. Кроме того, удаление убихинона приводит к исчезновению, а добавление его к появлению быстрой кинетики с *Ъ~ 200 пс переноса электрона от Бф"* на Q т/64/.

Таким образом, из приведенных выше данных следует, что главная роль в акцептировании электрона в Щ бактерий принадлежит молекуле уби- или менахинона. Спектр ЭПР акцептора бГ-гИзменяет-ся в результате магнитного, а не электронного взаимодействия с атомом железа /9/.

Окислительно- восстановительное титрование показало, что Е-/2 для Q j зависит от рН в хроматофорах и равен - 50 мВ при рН=7,0./67/. Зависимость среднеточечного потенциала от |ЗН среды указывает на то, что в случае равновесного титрования, когда (^ -г находится при фиксированном окислительно-восстановительном потенциале среды, восстановленная форма Q~-r способна взаимодействовать с протонами. При рН< 8-9,5 протонирование пренебрежимо мало, а величина Ej/₂ для пары Qj/Qj составляет - 180 мВ и не зависит от рН /68/. Значения стандартного потенциала пары Qt/Qj» измеренные в хроматофорах при высоких рН, близки у всех пурпурных бактерий и, видимо, эта величина Ет/р соответствует истинному значению потенциала полувосстановления Q-r в функционирующих реакционных центрах, в хроматофорах. .

В изолированных РЦ величина Ej / для пары 9j/GJt составляет - 50 мВ и не зависит от рН в диапазоне 6-9 /69/. Это указывает на то, что в изолированных препаратах РЦ Н⁺ не имеет доступа к

QJ в масштабе времен равновесного титрования. Причины такого отличия препаратов РЦ от хроматофоров пока не ясны.

Если реакционные центры освещать в восстановительных условиях в присутствии донора электронов /цитохрома С/, то возможно двух-электронное восстановление Qp При этом перенос электрона с Бф" на Qj происходит медленнее и составляет 10 мс. По всей видимости это вызвано влиянием электростатического поля, образуемого Qy. Замедляется та.кже скорость восстановления Бф в присутствии Qt~/ 70/. Температурная зависимость переноса электрона между Бф и Qj имеет вид кривой, которая с понижением температуры вначале возрастает в 2-3 раза, а затем уменьшается в диапазоне температур 70 -ї- 4 К /71/.

Как известно, в бактериях окисленный Р870⁺ в течение 1-4 мкс восстанавливается мембранно-связанньш цитохромом С. Было найдено /72/, что первая короткая вспышка света вызывает окисление Р870, а через короткий промежуток времени вторая вспышка света уже не вызывает окисления Р870. Происходит увеличение квантового выхода флуоресценции в 4 раза, т.е. так же как при восстановлении Qj. Было предложено, что это связано с тем, что после первой вспышки Qj восстанавливается до QJ , вызывая прекращение фотохимической реакции. Оказалось, что приувеличении временного промежутка между первой и второй вспышками, фотохимическая активность Р870 на вторую вспышку восстанавливается с ^^60 мкс в t. їлиязчгч Эта реакция температурно-зависимая с энергией активации 6,89 кДж/ моль /73/.

В хроматофорах Ц. ігї\ґіоіі$ кинетика восстановления фотохимической активности имеет Vy = б мкс /74/. Было предположено, что эта кинетика отражает перенос электрона на вторичный акцептор.

После экстракции убихинонов из хроматофоров с помощью пет-

ролейного эфира хроматофоры оказываются полностью неспособными к фотохимии на вторую вспышку света /75/. Однако, при добавлении чистого убихинона или витамина Kj, активность на вторую вспышку света восстанавливается. Другие искусственные хиноны, такие как манадиан или другие акцепторы электрона также способны восстанавливать активность на вторую вспышку света, при этом, время переноса электрона получается значительно больше.

Таким образом, было показано, что убихинон является вторичным акцептором электрона /Qg/» Перенос электрона с Q-r на Q? ин-гибируется при добавлении о-фенантролина, нигерицина А и ряда хинолин-хинолинов с алкальными боковыми цепями /74,75/. Действие о-фенантролина может быть связано с образованием хелатного ком-плекса Fe , однако измерение спектров эффекта Мессбауэра для ге показало, что квадрупольное расщепление и сдвиг центра мало зависит как от состояния хинонов, так и присутствия о-фенантролина, что говорит о том, что хиноны и о-фенантролин не входят в первую координационную сферу высокоспинового состояния Fe /65/.

В работе /64/ авторам удалось показать, что при удалении железа, переноса электрона от Q_T на Q_? не происходит. Добавление

2+

Fe приводит к восстановлению реакции переноса, что указывает на участие ге в переносе электрона между хинонами. Однако воздействие, использованное для удаления железа, вызывает также диссоциацию белковых субъединиц РЦ /76/, что затрудняет интерпретацию роли иона железа в электронном транспорте.

Qg так же как и Qj, в спектре ЭПР дает широкий сигнал с їґ-фактором 1,82, свидетельствующий о взаимодействии с атомом железа. Для Q2 этот сигнал более широкий, с большей температурной зависимостью и меньшей насыщаемостью /77/. Можно предполагать что атом ге. расположен между Qj и Qg при большем сближении с

-2+

(^вызывающем большее обменное взаимодействие между Fe и Qo

чем Q"* /78/.

2+-

Измерение статической магнитной восприимчивости ге в РЦ Rps. Siplv&ejfovdeb с окисленными и восстановленными хинонами показало /79/, _Что магнитный момент Ре" во всех образцах составляет 5,35 _± 0,15

магнетонов Бора и не зависит от восстановленности хинонов. Это

t ²⁺ означает, что ге не меняет свою валентность, что согласуется

с результатами, полученными ранее.

2+

Таким образом, атом ге находится в слабом магнитном обменном взаимодействии с Qf и Q^, что является причиной возникновения сигнала ЭПР с (J* = 1,82, в. также способствует переносу электрона от QJ на Qo, разделенных достаточно большим расстоянием, увеличивая перекрытие орбиталей Qf и Qo . Недавние исследования показали /80/, что при замене атома Ре на Ми в РЦ RjpS.sbtamicles /при выращивании хроматофоров в среде, обогащенной Мп происходит замещение 58% атомов Fe на Mia /, не происходит каких-либо заметных изменений в кинетике переноса электрона в QJ на Qg. Не наблюдается также изменение энергии активации переноса электрона.

г ²⁺ Это указывает на то, что незаполненные орбитали ге не принимают

участия в процессе переноса электрона между хинонами, т.к. потенциал ионизации Мп на 24500 см"*¹ больше,чем у ге , а такая большая разница должна была бы привести к изменениям в кинетике переноса электрона.

Окислительно-восстановительное титрование 0г> показывает, что Ej/r) зависит от рН (-60 мВ/рН )/81/. Это означает, что на один электрон происходит присоединение одного протона. Как показано в работе /82/, связывание протона может происходить с помощью групп белка, имеющих рК, который сдвигается при образовании Q5

Спектральные измерения показали, что изменения поглощения в области полосы Бф 750 нм отличаются для образования Qj и Qo /83/. В этом случае можно найти такую точку в дифференциальном

спектре, при которой можно регистрировать образование и исчезновение Qt. Были измереныДА полос 450 нм и 750 нм у РЦ Rps.spitaewicfes на одиночные вспышки света. Первая вспншйаі света дает образование Р870⁺ и Qp Катион-радикал Р870⁺ быстро восстанавливается от вторичного донора, a Qf передавал электрон на Q₂ с образованием

QJ в течение 300 мкс при рН=7. Скорость переноса незначительно зависит от рй.

Скорость переноса электрона между Q-r и Q₂ уменьшается при понижении температуры от 20 до -80С, а также при удалении воды из хроматофоров и реакционных центров бактерий /84/. Уменьшение относительной влажности с 33% до 18-20% приводит к резкому уменьшению эффективности переноса электрона. Можно сказать, что такое замедление переноса электрона с QJ на Qp вызвано уменьшением конформационной подвижности /85,86/.

Таким образом, в качестве вторичного акцептора электрона в бактериальных РЦ функционирует также молекула убихинона, перенос электрона на которую от первичного хинона происходит при участии атомов железа и происходит за время 50-350 мкс у различных пурпурных бактерий.

1.3. Рекомбинация зарядов в радикальной паре реакционного центра.

Б фотосинтетических РЦ окисление шотоакивного пигмента Р /Р870, Р700, Р680/ сопровождается быстрым переносом электрона от Р к I, в результате чего возникает радикальная пара Р I . Следующий этап переноса электрона от промежуточного акцептора I к первичному акцептору нехлорофильной природы Qj /хиноны, железо-серные белки/ происходит за времена, существенно большие времени деления зарядов в РЦ /~ 200 пс /32-35,38,39/, в результате в РЦ возникает относительно долгоиивущее состояние Р⁺ IQj /^10""с/ /7,19,58,59/.Дальнейшие прямые реакции в РЦ более медленные и

связаны с переносом электрона по ансамблю вторичных акцепторов.

Для обеспечения высокой эффективности фотосинтетических реакций в РЦ реализуются определенные соотношения прямых и об-ратных реакций /66,72/. Обычно, обратные скорости в 10 -10 раз медленнее прямых, поэтому в условиях нормального фотосинтеза обратные реакции малоэффективны. Совсем иная ситуация возникает при блокировании цепи прямого переноса электрона в РЦ фотосинте-зирующих организмов. Оказывается, в зависимости от места блокирования цепи, в РЦ возможна рекомбинация зарядов за счет обратного переноса электрона от I~jQj, Qна Р⁺» Скорости рекомбинации радикальных пар F*¹" I", F*IQj и P⁺IQjQg сильно отличаются, составляя по порядку 10, 10 , 10 с соответственно.

В данной работе будет исследована наносекундная рекомбинация зарядов в фотосинтетических РЦ пурпурной бактерии Rips. $кЬде~ yoidles и комплекс РЦ фотосистемы I зеленых растений. Поэтому, обзор литературы будет посвящен, главньш образом, процессу реком-бинационного распада первичной радикальной пары /Р⁴!"/ соответствующих РЦ.

Рекомбинация зарядов в первичной радикальной паре РЦ фото-синтезирующих бактерий. Наносекундная рекомбинация в РЦ пурпурных бактерий возникает в условиях, когда первичный железо-хинон-ный комплекс Qj восстановлен в темноте до состояния Qj или вовсе удален из РЦ. При этом образовавшаяся радикальная пара Р⁺1"" распадается за счет нескольких типов обратных рекций за 10-20 не /89,87/. Одновременно с ростом времени жизни РЦ наблюдается также 2^х -3^х-кратный рост интенсивности флуоресценции РЦ /89,90-92/,

а также регистрируется образование триплетного состояния /Р / / 50,87,93,94/, которое имеетЬремя жизни 10-100 мке и которое, по-видимому является смесью триплетного состояния Р /³Р/ и три-

плетного состояния с переносом зарядов 'у⁴!"']/ 50/.

Очевидно, уже исходя из первых опытов по регистрации нано-секунднок рекомбинации в РЦ пурпурных бактерий, можно отметить три пути распада радикальной пары Р⁺1"/31,50,87- 96/:

а/ рекомбинация с образованием синглетного возбужденного состояния РП —> Р I;

б/ образование основного синглетного состояния РД: P⁺I~-* PI;

в/ образование триплетного состояния РЦ или триплетного состояния с переносом заряда.

Первым указанием на то, что в восстановительных условиях /состояние PIQj / возможен обратный перенос электрона на Р⁺ с образованием Р явились данные по увеличению квантового выхода флуоресценции РЦ /89,90-92/. Действительно, несмотря на то, что в присутствии дитионита и стационарном освещении не наблюдаются изменения поглощения Р870 /97,98/, разделение зарядов в РЦ происходит и в этом случае с высокой эффективностью /99/. Для объяснения роста выхода флуоресцуенции при восстановлении Q-j- было предположено, что увеличение ее интенсивности связано с репо-популяцией Р за счет рекомбинации зарядов мезду Р⁺ и I~/I9,4I, 100/. К аналогичному выводу пришли и авторы /89/ при исследовании флуоресценции клеток пурпурных бактерий при низких редокс-потенциалах.

Если принять, что рост флуоресценции РЦ, хроматофоров и клеток при восстановлении первичного хинонного акцептора связан с рекомбинацией первичной радикальной пары Р⁺17 то, очевидно, должна проявляться температурная зависимость интенсивности дополнительной флуоресценции. Действительно, как показано в ряде ра-

* бот, например /89,100/, переход Р⁺1"—» р I связан с преодолением энергетического барьера, и, поэтому, с понижением температуры интенсивность дополнительной флуоресценции должна падать.

Действительно, было установлено /89/, что в восстановительных условиях с понижением температуры от 300 до 150 К выход флуоресценции клеток R. *чаВгіа*ии Rips. -5j?Kaеyoides падал, из чего авторы нашли, что энергия активации перехода Р I —* Р I составляет 0,11-0,15 эВ. С другой стороны, интенсивность флуоресценции клеток /89/ и препаратов РЦ /4/ в состоянии PIQ не зависит от температуры. Важно подчеркнуть, что параллельно с падением выхода триплетов специальной пары ^/102/,и каротиноидов /89/, что по мнению авторов свидетельствует, что реакция Р"*Т —* Р I конкурирует с реакцией Р^Т"—*гр⁺1~—* ^1 —»» jKap. Отметим,

что с понижением температуры должен увеличиваться также и выход

+ -

реакции рекомбинации в основное состояние Р I —* PI.

Очевидно, если рекомбинационная флуоресценция является одним из каналов дезактивации первичной радикальной пары Р⁺1~, ее кинетика должна совпадать с кинетикой распада Р⁺І~. Уже в ранних работах по измерению длительности рекомбинационной флуоресценции Шуваловым к Климовым /41/ было установлено, что кинетика флуоресценции препаратов РЦ из С, U4v\osum содержит компонент с длительностью 6 не, амплитуда которого уменьшалась с

понижением температуры. Авторы /41/ сопоставили этот компонент

у рекомбинационной наносекундной флуоресценции и изтемпературной

зависимости определили энергетический зазор между Р и Р равный 0,12 эВ. Компонент длительностью 2,5 -2,9 не был зарегистрирован в работах Годик и Борисова /91,103/ методом фозовой флу-орометрии в хроматофорах ряда пурпурных бактерий. Более тонкий анализ кинетики флуоресценции, выполненный в последующих работах этих же авторов /91,104,105/ показал, что в восстановительных условиях значительную долю флуоресценции хроматофоров составляет рекомбинационное свечение длительностью 4-6 не. Наконец, недавно Ван Бохов и др. /109/ обнаружили, что переменная флуорес-

ценция хроматофоров содержит два компонента длительностями 5 и 12 не, начальные амплитуды которых примерно одинаковы.

Еще раз подчеркнем, что замедленное свечение наносекундной длительности возникает при химическом восстановлении Qj, при фотохимическом восстановлении Qj за счет переноса электрона от экзогенного донора и блокирования реакции окисления Q"J в анаэробных или аэробных условиях при добавлении о-фенантролина /104, 107,108/, при избирательной экстракции хинонов из хроматофоров или РЦ /26,42,96,108/. Наиболее полно различные вопросы, связанные с рекомбинационной люминесценцией в РЦ пурпурных бактерий рассмотрены в недавем обзоре Борисовым и др. /НО/.

Ранее мы отметили, что понижение температуры долшю уменьшать интенсивность рекомбинационной флуоресценции и, по всей видимости, увеличивать время }кизни радикальной пары Р⁺1"". Очевидно, исследование температур/ной зависимости интенсивности рекомбинационной флуоресценции является одним из путей определения энергетического зазора ДЕ ме)нду Р и Р . Действительно, подобные измерения позволили авторам /89,41/ установить, что Л Е=0,12эВ Радемейкер и Хофф /102/, сопоставив собственную теорию прямых и обратных реакций в бактериальных РЦ с экспериментальными резз^ль-татами /89/ нашли, чтодЕ = 0,05 эВ, что совпадает с более ранними данными Годик и Борисова /91/. Совершенно противоположные данные получил Клейтон /101/, который обнаружил увеличение общего выхода флуоресценции от РЦ R^.bbU**Wes при понижении температуры до 200 ^;К. При дальнейшем понижении выход флуоресценции не зависел от температуры. Эти данные противоречат представлениям о рекомбинационной природе переменной флуоресценции. Отметим, что по нашему мнению большой массив данных по изучению природы замедленной флуоресценции в РЦ пурпурных бактерий свидетельствует о ее рекомбинационной природе. Систематическое и безуко-

ризненное доказательство рекомбиыационной природы наносекундной флуоресценции в РЦ пурпурных бактерий дано также в /НО/.

Очевидно, в восстановительных условиях одним из путей распада радикальной пары Р⁺1" должен быть переход РЦ в триплетное состояние /50,87-89,93-94/. Поэтому, исследование влияния магнитного поля на различные каналы дезактивации первичной радикальной пары должно стать вес>ьма информативным средством изучения прямых и обратных реакций в РЦ. Действительно, в отсутствии магнитного поля все триплетные подуровни ^⁺1" вырождены, и в реакции ^jp+i"!-—> ^⁺1~]должны заселяться все подуровни. Приложение магнитного поля должно вызвать расщепление триплетных подуровней по энергии, таким образом, что заселяться будет лишь один подуровень, способный смешиваться с синглетным уровнем /51,96, II2-II6/. При этом уменьшается выход образования триплетной радикальной пары и увеличивается выход флуоресценции /102,117/.

Вместе с тем, оказывается, что в литературе до сих пор не получены однозначные результаты по влиянию температуры и магнитного поля на эффективность различных каналов дезактивации первичной радикальной пары. Особенно значительные расхождения получены при исследовании изолированных реакционных центров. Мы уже отмечали, что Клейтон /IOI/наблюдал рост выхода флуоресценции при понижении температуры до 200 К, что дало ему основание заключить, что переменная флуоресценция в РЦ в состоянии РЩ~ не является рекомбинационной. В более поздней работе Шенк и др.

/51/ детально последовали влияние температуры, а также изотоп-

т о р

ного замещения ^ХН на Н на кинетику распада Р , квантовый выход

Р , а также интенсивность и кинетику замедленной флуоресценции очищенных РЦ из Rps. sj^wides и К. ги1г\л\лл . Как и в ранных работах /41,91,104,105/ в работе /51/ обнаружили, что длительность замедленной флуоресценции составляет б не и не зависит от

температуры. При понижении температури-от 270 до 215 К выход флуоресценции РЦ с восстановленным Qj растет в~2 раза, а затем падает до исходного уровня при температуре 130 К. Эти данные позволили авторам высказать предположение о наличии у РЦ дополнительного температурнозависимого канала потерь энергии, что подтверждает более раннее предположение Хоффа /118/. Кроме того, авторы /51/ нашли, что время лизни радикальной пары /^12 не/ вдвое болше длительности замедленной люминесценции, а магнитное поле почти не влияет на флуоресценцию РЦ.

Исследование влияния магнитного поля на квантовий выход образования рроказали, что при наложении магнитного поля I кГс выход ЧР монотонно падает вдвое /115,119/. При наложении интен-сивного магнитного поля / 50 кГс / выход Р возрастает до величины, равной выходу ^Т в нулевом магнитном поле /120/. Как уже отмечалось влияние слабого /до I кГ/ магнитного поля связано с расщеплением уровней Т , Т , Т_ и снятием вырождения /115,119/. Рост выхода 'Т в сильном магнитном поле может быть следствием увеличения энергии Зеемановского взаимодействия /120/ двух радикальных пар, вследствие чего уровни S и Т₀в сильном магнитном поле приходят в равновесие до рекомбинации.

Такой характер влияния магнитного поля разной интенсивности может,служить указанием на то, что Р"*Т~* является слабосвязанной радикальной парой, т.е. электрон- электронное обменное взаимо-

о т

действие в паре очень мало /*/I0~^ocm"V /115/. Для того, чтобы объяснить быструю скорость образования-^Р⁺1~] из Р и это очень слабое взаимодействие Хаберкорн и др. /121/, Шувалов и Парсон /50/, Годик и др. /105/ предположили, что тР⁺1~] может представлять собой смесь -^Р^Б^и -^Бф"], где Б и Щмолекулы бактериохло-рофилла Е800 и бактериофеофетина РЦ. Подтверждением этого предположения служат экспериментальные результаты / 122,123/, из

которых следует, что Б800 является промежуточным акцептором

электрона между Р и Бф.

Одним из интереснейших результатов, полученных Шенком и др.

/51/ является то, что в присутствии поля 650 Гс время жизни Р⁺1" увеличивается значительно больше, нежели можно было бы ожидать

из наблюдаемого уменьшения выхода Ч?. Для объяснения полученного результата авторы /51/ предложили еще один канал дезактивации РЦ в основное состояние - из триплетного состояния радикальной пары. Другими словами, значительная часть триплетных состояний радикальной пары переходит прямо в основное состояние без

образования Р. Вопрос о путях дезактивации первичной радикальной пары в препаратах РЦ с удаленным первичным и вторичным хи-нонами во многом был прояснен в работе /96/. Авторы /96/ установи ли, что в безхинонных РЦ Rb$. splvdexoides R-^6 радикальная пара живет 13 не в нулевом магнитном поле, 17 не в поле I кГс и 9 в поле 50 кГс. Они предположили, что распад радикальной пары по триплетному каналу должен осуществляться как с переходом в основное состояние РІ, так и в триплетное состояние РЦ %[. Кроме того предполагается, что триплетная радикальная пара распадается в триплетное состояние спереносом зарядов, которое сильно связано с основным состоянием посредством спин-орбитальных взаимодействий. Одна из рабочих моделей, следующая из статьи /96/, изображена ниже:

^ІР Б Бф

I Зр Б Б»

³[Р⁺Б~Бф]-^ ^L -¹

Р Б Бф Предложенная схема /96/ наиболее полно учитывает накопленные к 1984 г. экспериментальные данные, однако многие вопросы, возникающие при сопоставлении данных разных авторов, остаются открытыми. Так, до сих пор осталось неясным различие во вре-

_{- зо -}

менах жизни радикальной пары и замедленной флуоресценции, величины эффекта магнитного поля на скорости различных каналов дезактивации, наличия нескольких компонентов в кинетике восстановления поглощения Р870 и другие. Решению этих вопросов и посвящена данная работа.

- ЗІ -

2. Реакционные центрі фотосистемы І.

Шотосинтетический аппарат содержит определенный набор функционально детерминированных пигмент-белковых комплексов ДШК/, роль которых- состоит в поглощении и переносе энергии возбуждения к реакционным центрам /РЦ/, в которых осуществляется равделение электрических зарядов. Энергия разделенных зарядов используется затем в последовательной цепи окислительно-восстановительных реакций, в результате которых образуются стабильные продукты фотосинтеза.

Основным пигментом зеленых растений является хлорофилл Дл/, который включен во все ПБК и участвует в поглощении и переносе энергии и делении зарядов в Щ. В настоящее время первичные процессы фотосинтеза рассматривают на основе трехчастной модели Батлера /124/. Согласно этой модели пигментный аппарат высших растений и зеленых бактерий можно представить в виде трех основ^- .-ных комплексов: светособирающего пигмент-белкового комплекса /ШСР/, комплекса фотосистемы ^/ШЖІ/ и комплекса фотосистемы II /ПЕКИ/. Последние два содержат соответствующие РЦ и собственные антенные хлорофилл-содержащие белки. Экспериментальное и теоретическое рассмотрение модели Батлера дано в обзорах /125, 126/.

В данной диссертации выполнено исследование переноса энергии, деления зарядов, переноса электрона и рекомбинации зарядов в ПБК и РЦ фотосистемы I. Поэтому в этом разделе будут рассмотрены структура и первичные реакции в ПБК фотосистемы I. 2.1. Структура комплекса ФСІ.

В литературе имеется большое количество статей, описывающих процедуру выделения очищенных комплексов реакционных центров фотосистемы I, среди которых мы отметим лишь некоторые / І27-І4І/.

По данным /142/ ПЕК ФСІ представляет собой эллипсоид вращения с большой осью, параллельной плоскости тилакоидной мембраны. В комплексе обнаруживается несколько форм Хл а, различающихся положением максимума поглощения в красной области спектра. Различные методы выделения ПЕК 5Ш позволяют получить комплексы с отличающимся содержанием белков /130,143/ и пигментов / 134,135,137,144/. При гель электрофорезе обработанных детергентом ПЕК <Ю1 проявляются шесть полос /І -УІ/ отличающихся элек-трофоретической подвижностью. Молекулярные веса этих шести белковых субъединиц, составляющих полный комплекс ПЕК ЗЮІ, в порядке увеличения нумерации составляют 70, 25, 20, 18, 16 и 8 кД, рис.1

Субъединица I с молекулярным весом полипептида 70 кД содержит в своем составе хлорофилл и проявляет светоиндуцированные изменения поглощения, что свидетельствует о присутствии в этой субъединице первичного донора электрона Р700 и первичного акцептора Aj. С другой стороны, по данным ЭПР-спектроскопии субъединица I лишена Fe-S центров / 145/. Отсутствие Fe- S центров приводит к тому, что этот препарат не окисляет пластоцианин, и не восстанавливает НАДФ после введения в реакционную среду необходимых компонентов. Возможно, что первая субъединица является полипептидным димером /146/.

По данным /130/ наиболее близко к субъединице I расположены субъединицы II и III, которые, в свою очередь, слабо ассоциированы друг с другом. Как считают Бенджис и Нельсон /130/, вторая субъединица к структуре комплекса не имеет прямого отношения, роль ее в первичном фотосинтезе не ясна. Третья субъединица с молекулярным весом 20 кД оказывает влияние на способность комплекса окислять пластоцианин. Так, в отсутствие субъединицы III в комплексе I вообще не происходит окисления пластоцианина /147/,

однако введение в среду катионов способствует переносу электрона между пластоцианином и Р700.

Очевидно, основная функция субъединицы III заключается в понижении активационного барьера для переноса электрона между пластоцианином и Р700 / 148/.

Оставшиеся субъединицы ІУ-УГ определяют способность ПБК I восстанавливать НАДІ в присутствии пластоцианина или искусственных доноров электронов. Эти субъединицы не содержат доноров электронов и хлорофилл / 144/, возможно, они являются местом локализации Fe-S центров. Отметим, что по данным низкотемпературоной спектроскопии ЭПР железо-серные центры А и В расположены на одной из трех белковых субъединиц /149/.

Как уже отмечалось, содержание пигментов в ПЕК ФСІ сильно зависит от способа выделения комплекса. Имеющиеся в настоящее время сведения о содержании хлорофилла в ФСІ и .<ЮП довольно сильно отличаются. Так, по данным Андерсон / 133/ ФСІ включает в себя 120 молекул Хл а, ФСІІ - НО молекул Хл в и 170 молекул Хл а. В более поздей работе Мелиса и Андерсон /141/ показано, что ФСІ содержит 210 молекул хлорофилла, причем отношение Хл аДл в=б. Из этих 210 молекул хлорофилла 40 молекул Хл а включено в ядро Щ комплекса ІСІ, 140 молекул Хл а и 30 молекул Хл в образуют светособирающий Хл а/в белковый, комплекс. По данным этой же работы /141/ на долю $СП приходится около 330 молекул хлорофилла, из которых - 230 относятся к ІСІІ, 100 - ФСІ .

Антенна <ЕС1 представлена несколькими спектральными формами хлорофилла. В зависимости от степени очистки получают ПБК ФСІ с разным содержанием хлорофилла. Так, из комплекса ФСІ, описанного в /141/, последующей обработкой можно получить функционально активные ПБК ШСІ с все болшим отношением Р700Дл а. Например, в работе /134/ описана процедура получения и спектральные харак-

теристики ПЕК $СЇ, в которых количество молекул, приходящихся на один РЦ, составляет НО, 65 и 40. Наиболее обогащенные реакционными центрами фрагменты получаются при обработке диэтиловым эфиром выделенных с помощью дитионита пигмент-белковых комплексов. Такие комплексы содержат 5-9 молекул антенного хлорофилла на Щ /150,151/.

2.2. Перенос электрона в РЦ фотосистемы I Первичный донор электрона. Фотохимический донор электрона для фотосистемы I был открыт в исследованиях Кока /152/. По своим свойствам он близок к первичному донору электрона пурпурных бактерий. Дифференциальный спетр поглощения, препаратов, обогащенных фотосистемой I, характеризуется выцветанием полос хлорофилла в при 430 нм и 700 нм /Р700/. При химическом окислении образца, наблюдаются аналогичные абсорбционные изменения, как и при освещении. Это явилось причиной для утверждения об окислительном характере наблюдаемого явления /153,154/. Данные, полученные при изучении окислительно-восстановительно потенциала для окисления Р700, свидетельствуют, что это одноэлектронная реакция с сред-неточечным потенциалом Е_т = 0,4 - 0,5 В /155,156/. Было показано, что квантовый выход окисления Р700 составляет I/I57/. Од-ноэлектронное окисление Р700 соответствует появлению сигнала ЭПР в районе ^= 2,0025, с полушириной полосы 7-8 Гс /158,159/. Сигнал ЭПР в РЦ фотосистемы I возникает как при световом, так и при химическом окислении /153/. В работе /159/ показано, что образование сигналаЭПР и оптические изменения спектра Р700 характеризуются одинаковой кинетикой, а квантовый выход образования парамагнитных центров тоже достигает I /160,161/. Во многих экспериментах была исследована форма и ширина линии ЭПР / Нрр/ для Р700 /162,163/. На основании этих данных можно сделать предполо-

жение о количестве протонов участвующих во взаимодействии с не-спаренным электроном. Было найдено, что по сравнению с Хл⁺ в растворе, Р700 имеет ширину сигнала ЭПР с 1,4 раз уже, а величину электрон-протонного сверхтонкого расщепления в 2 раза меньше /162,164/. Отсюда следует, что электронная плотность делокали-зована между двумя молекулами хлорофилла, входящими в Р700, т.е. Р700 является димером /164/. Коэффициент экстинкции Р700 для полосы 703 нм был определен при использовании сопряженной реакции окисления цитохрома, и составил 120 мМ ^хсм ^х для ШСІ, выделенных из хлоропластов шпината /165,166/. Многими авторами было исследовано время фотоокисления Р700. Измеряемый предел сдвигался при совершенствовании сверхбыстрой абсорбционной методики: 100 не /167/, 20 не /169/. Измерения в пикосекундном временном интервале показали, что время фотоокисления первичного донора электрона ШСІ составляет 10-50 пс /168/.

Первичные и вторичные акцепторы электрона. Первичные электронные акцепторы ШСІ обнаружены и охарактеризованы в экспериментах с использованием дифференциальной спектрофотометрии /157/ и ЭПР спектроскопии /170/. Они были идентифицированы как Fe-S белковые центры /А,Б/. Было обнаружено, что под действием красного света возникают абсорбционные изменения в спётральной области 430 нм. Предположено, что это результат фотохимической реакции, при которой Р700 передает электрон пигменту Р430. В отсутствии внешних доноров и акцепторов электрона Р700⁺ и Р430~ имеют одинаковую кинетику затухания с Ъ.с: 40 мсек /171/. Были проведены подробные исследования поведения пигментов при добавлении в среду доноров и акцепторов электрона. В присутствии аскорбата ускоряется восстановление Р700 и замедляется окисление Р430. Добавление внешнего акцептора, напротив, приводит к стабилизации Р700⁺ и резкому окислению Р430~. В результате различных эксперименталь-

ных условий были осуществлены и исследованы, реакции циклического потока электронов через внешний медиатор, а также нециклический поток электрона от внешнего донора к внешнему акцептору. Было найдено, что в отсутствие внешних доноров и акцепторов электрона наблюдаются рекомбинация Р700⁺ и Р43СГ /10/.

В результате окислительно- восстановительного титрования Р430 было установлено значение Ej/g» которое не зависело от изменения рН среды в пределах. 8-9,5 / 172/ и составляло - 530 мВ /173/. Установлено также /174,175/, что если препараты ЗЮІ освещаются в присутствии акцептора электрона и замораживаются на свету, в спектре ЭПР при низких температурах остается только сигнал Р700⁺. Напротив, если адаптированные к темноте препараты замораживаются, то на свету при температуре 77 К обнаруживается сигнал ЭПР Р700⁺ и сигнал Р430"*. В дальнейших работах при использовании селективного возбуждения $С1 /176/, а также благодаря совершенствованию препаративных методик обогащения препаратов / 177,178/были найдены дальнейшие подтверждения тому, что первичными и вторичными акцепторами электрона в фотосистеме I являются железо-серные белки. Отметим, что в препаратах, обогащенных реакционными центрами ФСІІ и свободных.. от РЦ ФСІ, не наблюдаются абсорбционные и ЭПР изменения в полосе 430 нм, т.е. Fe- S центры связаны только с функционированием ШСІ /179/.

Фотоиндуцированное появление сигнала ЭПР характерно для од-ноэлектронного восстановления ^e-S центров и имеет значение ^=1,86,

^=1,94, #=2,05 /175/. В работах /175,180/, было показано, что сигнал ЭПР железо-серных центров наблюдается не только при фотохимической реакции в <Ю1, но и в темноте при низких окислительно-восстановительных потенциалах среды. При этом появляются еще два пика сигнала ЭПР с ^ = 1,89 и 1,92. Амплитуда сигналов зависит от

степени восстановления препарата ФСІ /181,182/. Эти факты являют-

ся подтверждением того, что Р430 состоит из двух Fe-S центров, имеющих^ 2,05, 1,94, 1,86 /центр А / и 6 =,2,05, 1,92, 1,89 / центр В /. Исследования по окислительно-восстановительному титрованию показали, что для центра А среднеточечный потенциал со.с>-тавляет-530-550 мВ, а для центра В - 580-594 мВ /181,182/. Пред-полагают, что акцепторы А и В относятся к центам типа 4 Fe,, 4 S , в которых каждый атом железа имеет в качестве лигандов 4 атома 8. В окисленной форме все атомы Fe находятся в трехвалентном состоянии. При восстановлении электрон делокализуется между двумя или большим числом атомов Fe. Тесная связь двух 4fe, 4S центров с одним белком повышает возможность переключения с одноэлектронного на двухэлектронный путь переноса /183/.

В работе /176/ авторы рассмотрели вопрос о взаимодействии акцепторов А и В в цепи переноса электрона. Стехиометрия продуктов световой реакции Р700⁺ и восстановленные формы А и В составляет 1:1.

Характер изменений спектров ЭПР указывает на тесное взаимодействие. Если центр А восстановлен, восстановление центра В приводит не только к появлению спектра ЭПР, характерного для В, но и к изменению спектра А. На основе этих наблюдений был сделан вывод /184/, что А и В вместе представляют собой 8Fe, 8$ кластер, включающий два близко расположенных 4 he , 4S центра. Была, однако, обнаружена температурная зависимость tf-фактора центра В. При температуре 150-200 К наблюдается восстановление на свету обоих: центров, а при 25 К преимущественно происходит восстановление центра А. Если восстановить химически центры А, то светоиндуцирован-ное восстановление центров В не достигает количества восстановленных центров А /185/.

... Таким образом, по совокупности экспериментальных фактов можно предположить, что А и В функционируют параллельно. Было вы-

сказано.предположение, что А передает электроны на НАДФ⁺, а В участвует в циклическом транспорте электронов. Б отсутствии периферических акцепторов и при низких, температурах в восстановленном состоянии накапливается вначале центр А. При понижении Е^ среды или увеличении потока электронов восстанавливается и центр В.

В различных лабораториях предпринимались усилия для обнаружения более раннего по отношению к Fe-S центрам А и В акцептора электрона в РЦ СП. Было показано, что при химическом восстановлении первичных акцепторов электрона А и В при комнатной температуре кинетика окисления Р700 становится обратимой /185, 186/. В работах. /185-187/ был обнаружет сигнал ЭПР нового электронного акцептора Аг> с (f = 1,78, 1,88, 2,Сб. При подкислении препарата ФСІ наблюдается высвобождение 10-12 атомов серы на реакционный центр /186/. Это позволяет предположить,что Ар тоже представляет собой Fe-S центр. Можно считать установленным, что перенос электрона с Аг> на А, В происходит быстрее, чем за 20 мкс. Окислительно-восстановительный потенциал центра Ag определен в работе /172/. Было обнаружено 50% уменьшение фотоокисления Р700 при очень низком окислительно-восстановительном потенциале - 730мВ что может быть связано с восстановлением центра А« Поскольку при низких температурах наблюдается необратимый перенос электрона от Р700⁺ на акцепторы А и В, с ^<0,1 мсек, а восстановление Аг> не вызывает изменения в спектре ЭПР радикала Р700⁺, произвели оценку расстояния между Ag и Р700 и установили, что оно больше 1,5нм /175/.

Самый близкий /по временной последовательности событий/ акцептор был обнаружен при исследовании обратимого окисления Р700 в восстановительных условиях, при которых Ag, А, Ви все более периферические акцепторы электрона восстановлены /184/.

Б этих условиях было обнаружено обратимое светоиндуцирован-ное окисление как при комнатной температуре, так и при 5 К, что указывает на наличие акцептора Ар Действие вспышки света, кроме характерных для Р700 изменений сигнала ЭПР и оптического поглощения вызывает возникновение нового сгнала ЭПР при ^= 2,00. Кроме того, в дифференциальном спектре поглощения возникают изменения, соответствующие восстановлению Хл а /172,188/. Это позволяет предположить, что Aj представляет собой Хл а, расположен-ный_; вблизи специальной пары Р700.

Дополнительнымидоказательствами являются данные, полученные в работах /189,190/, проведенные на пигмент-белковых комплексах С1 обработанных StiS/без акцепторов А и В/ по ревосстановлению первичного донора электрона. Полученные кинетики а А интерпретировались как перенос электрона от Aj и Ag на Р700⁺.

С привлечением методов пикосекундной спктроскопии было установлено, что Aj получает электроны от Р700 за время около 10 пс после световой вспышки /191/.

На основе данных об акцепторах фотосистемы I и результатах исследования белковых компонентов ФСІ /184/ предложена синтетическая модель структуры реакционного центра фотосистемы I. Эта модель представлена на рис Д.

к растворимому ферредоксвну

Рдс.1 Сшгемческая модель структуры РЦ ФС I. I -VI белковые компоненты с молекулярными весами 70, 25, 20, 18, 16, 8 кшю/далътон соогвегствено, Р700-фотоактдвный пигмент РЦ, Aj, А₂, А, В-акцепгоры электрона.

Последовательность фотохимических процессов переноса электрона в РЦ

Согласно современным представлениям в РЦ происходит преобразование энергии электронного возбуждения, возникшего в результате поглощения кванта света в энергию разделенных зарядов. Этот процесс осуществляется путем переноса электрона от фотовозбужденного бактериохлорофильного димера Р870 на первичный стабиль - II ный акцептор Q j /первичный хинон/. Электрон от Qj затем переносится на вторичный хинон Q 2 а Р + восстанавливается цито-хромом типа с.

Разработка лазерных спектрометров и спектрофлуориметров с пикосекундным временным разрешением позволила исследовать кинетику процесса фотовыцветания Р870 и последующего переноса электрона на Q j. Оказалось, что перенос электрона происходит через ряд промежуточных состояний /19,23/. Кроме коротких времен, особенностью функционирования РЦ является независимость от температуры квантового выхода фотоокисления Р870, который достигает 100% и остается неизменным вплоть до I К/ 5/.

Первичный донор электрона. Существует ряд фактов, которые указывают на то, что Р870 является первичным донором электронов в РЦ. Окисление Р870 приводит к потере фотохимической активности РЦ /25/. После этого происходит окисление цитохрома, который отдает свой электрон на Р870+ /26/.

Освещение РЦ или химическое окисление приводит к выцветанию полос поглощения 870 нм и 600 нм, сдвигу полосы при 370 нм и появлению новых полос при 425 їж и 1245 нм /18/, наблюдается также сдвиг полосы 800 нм в коротковолновую сторону. Окислителнно-восстановительное титрование показало, что Р870 является одно-электронным переносчиком с окислительно-восстановительным потенциалом 450 мВ /27/.

Однеэлектронное окисление Р сопровождается появлением сигнала ЭПР с -фактором 2,0026 /28/, имеющего гауссову форму, причем кинетика появления и затухания сигнала ЭПР совпадает с таковой, измеренной по оптическим абсорбционным изменениям /29/. Сигнал ЭПР катион-радикала Бхл ш \r(tvo имеет такой же & -фактор, но ширина его линии/приблизительно в (2 больше, чем ширина сигнала ЭПР Р870+. Приведенные факты свидетельствуют о делокализации неспаренного электрона по двум молекулам Бхл в Р870. Дополнительным подтверждением этому являются данные, полученные с помощью измерения спектров двойного электронно-ядерного резонанса. Было найдено, что величина сверхтонких расщеплений в спектре Р870+ в 2 раза меньше соответствующих величин для катион-радикала Бхл Ы \siixo /30/.

Бремя жизни синглетного возбужденного сосояния Р870, рассчитанное из измерений квантового выхода флуоресценции изолирован-ныхРЦ согласно данным работы /31/, оказалось равным 7 пс. Близкие значения были получены путем прямого измерения времени жизни флуоресценции РЦ с помощью пикосекундного флуорометра. Кинетика затухания флуоресценции препаратов с активным РЦ при комнатной температуре имеет две компоненты. Быстрый компонент имеет длительность 5 + 2 пс и исчезает при окислении Р870 и характеризует время жизни Р870. Медленный - длительностью I - 2 не связан либо с флуоресценцией солюбилизированного бактериохлорофилла, либо с рекомбинационным свечением /4/.

Первичный акцептор электрона. Основным доказательством существования промежуточных акцепторов электрона послужил тот факт, что разделение зарядов происходит в том случае, когда акцептор электрона хинонной природы химически восстановлен. Действительно, с развитием лазерной пикосекундной техники в работах /32-35/, при возбуждении образца пикосекундным импульсом с длиной волны 530 нм было обнаружено новое состояние /Р /, которое включает в себя выцветание полос Бф при 545 нм и 760 нм и полис Бхл при 600 нм, 800 нм и 870 нм.

Нужно отметить, что возможность существования промежуточ-ныхакцепторов была предсказана в работе /36/ на основании анализа флуоресцентных данных по миграции энергии электронного возбуждения от Бхл антенны к реакционному центру. Было показано, что для обеспечения высокого квантового выхода разделения зарядов - ІЗ и достаточно медленной их стабилизации, необходимо существование короткокивущих промежуточных стадий.

Последующие исследования с помощью пикосекундных абсорбционных спектрометров дали информацию о кинетике образования и дезактивации состояния Р в условиях, когда акцептор электрона Q, j не восстановлен. Как показано в работах / 32,37/, разделение зарядов в порфириновом комплексе РЦ происходит за время меньшее 10 пс, а образующееся в результате состояние Р живет в течение 150-240 пс и его исчезновение сопровождается переносом электрона на акцептор Q j /32,35,38,39/. При этом увеличение поглощенияв полосе 1250 нм, возникающее вследствие окисления первичногор донора Р870, возникает одновременно с образованием состояния Ри затем сохраняется в течение десятков миллисекунд/34/.

Изучение природы промежуточного акцептора /I / проводилось с помощью анализа спектральных изменений как в пикосекундном диапазоне времен, так и(стационарных услових. Последнее возможно благодаря тому, что длительное освещение реакционных центров ряда пурпурных бактерий в условиях низкого редокс. потенциала среды приводит к накоплению промежуточного акцептора І в восстановительном состоянии /40-42/.Если РЦ освещать в восстановительных условиях в присутствии донора электрона /низкопотенциальных цитохромов/, то перенос электрона может конкурировать с внутренними процессами, протекающими в РЦ. Поскольку состояние Р870 I Qj стабильно в течение многих минут, то происходит постепенное накопление такого состояния

Генератор пикосекундных импульсов света

В настоящее время при изучении быстропротекающих процессовшироко применяются лазерные пикосекундные источники света, вчастности, твердотельные. Основной особенностью генераторов с -твердотельными элементами является высокая интенсивность выходных импульсов света, что позволяет применят их в качестве источников накачки преобразователей частоты света, для которых необходимо возбуждение мощными импульсами. Наибольшее распространение получили генераторы на кристалле иттрий-алюминиевого граната, активированного неодимом /YkG- : Wd "V /205-206/, и генераторы на фосфатном стекле с Mi 3+ с пассивной синхронизацией мод /207/.

Иттрий-алюминиевой гранат имеет более высокую теплопроводность по сравнению со стеклянной матрицей, что позволяет работать генераторам с более высокой частотой повторения. Кроме того, кристаллы УА6- : Wd обеспечивают больший, чем в неодимовои стекле коэффициент усиления. Это дает возможность использовать меньшее число каскадов усиления для получения заданной энергии импульсов света. Спектральная ширина активного перехода ионов Wet в матрице УА& ограничивает длительность импульсов генератора на уровне 20 - 25 пс, в то время как для фосфатного стекла -5 - 7 пс. Большая длительность импульсов генерации УА& : № лазера с одной стороны уменьшает вероятность возникновения нелинейных эффектов в процессе генерации и усиления импульсов света, что в свою очередь, увеличивает стабильность и пространственную структуру импульсов, с другой - уменьшает временное разрешение пикосекундных спектров.

Таким образом, модно построить генератор на УА& : высокой стабильностью параметров импульса, работающий с частотой повторения до 10 Гц, выдающий импульса света длительностью 25 пс. Такой генератор может обеспечить измерение малых изменений поглощения и дает возможность усреднения большого числа результатов измерений.

Можно отметить также, что в последние годы появились актив - 44 ные элементы из фосфатного стекла, в котором концентрация ионов Wot3"1 достигает болших значений /197/. Лазера на таких элементах приближаются по своим параметрам /усиление, частота повторения/ к лазерам на УАЄ iWd3" ", но имеют меньшую длительность генерируемых импульсов света 2-3 пс. Однако, такие элементы пока еще мало доступны.

Для пикосекундного абсорбционного спектрометра был построен генератор на активном элементе УА& :Wdt , работающий в режиме самосинхронизации мод /210/. Такой режим достигался путем помещения в резонатор нелинейного сомопросветляющегося красителя. В нашем генераторе применялись растворы красителя 3955 в изобути-ловом спирте или же краситель 3274у в этаноле. Повышение вероятности самосинхронизации мод может быть достигнуто путем осуществления двухпорогового режима генерации /.198/. Такой режим получается при совмещении во времени моментов просветления красителя и насыщения активной среды. В этом случае вначале возникает свободная генерация, а через 1 мкс цуг пикосекундных импульсов. Таким образом, вероятность повышения синхронизации мод происходит за счет того, что дискриминация по амплитуде флуктуационных импульсов производится в течение 100 проходов по резонатору до формирования дуга. Для реализации двухпорогового режима авторы /198/в резонатор между активным стержнем и кюветой с красителем помещали 2-х кратный телескоп. Однако оказывается /211/, что в генераторе на кристалле УА6 :NcL + за счет высокого коэффициента усиления активной среды, может быть достигнут двухпороговый режим генерации путем экспериментального подбора геометрии резонатора, начального пропускания красителя и коэффициента отражения переднего зеркала. Так, в нашем случае пероятность полной синхронизации мод составляла примерно 95% для обоих красителей, однако ресурс работы генератора на красителе 3274у был в 3-5 раз -45 больше и составлял 5»10 вспышек.

Получение перестраеваемых по частоте импульсов света с помощью ПГС и генерация континуума

Абсорбционный спектрометр должен иметь перестраиваемые в исследуемой части спектра источники возбуждения и зондирования, причем энергия возбуждающего импульса света должна быль достаточной для наведения регистрируемого изменения поглощения. Хорошими характеристиками обладает параметрический генератор света /ПГС/ бегущей волны, выполненный по двухкристалльной схеме /194, 202/. Такой генератор представляет собой два нелинейных кристалла, перестройка частоты достигается поворотом кристаллов на некоторый угол. В первом, излучением накачки с Т\ = 532 нм, возбуждается широкополосная параметрическая сверхлюминесценция, которая поступает на второй кристалл «- параметрический усилитель, в котором осуществяется режим сильного энергообмена. В работе /203/ показано, что наиболее подходящими для такой схемы являются кристаллы КДР, обладающие высоким порогом оптического разрушения /в пикосекундном диапазоне 70-100 Гвт/см /, отсутствием накопления разрушений, а так же малым сечением двухфотонного поглощения и вынужденного комбинационного рассеяния /ВКР/. В ПГС на кристаллах КДР может быть достигнута энергетическая эффективность более Ь0%.

Для достижения высокого коэффициента преобразования в двух-кристальной схеме необходимо правильно подобрать интенсивности накачки и сигнала на входе второго кристалла /усилителя/. Это достигается подбором расстояния между кристаллами и фокусом положительной линзы, расположенной перед первым кристаллом. Линза должна быть цилиндрической, что позволяет устранить диафрагменный и апертурний эффекты: и осуществить параметрическое взаимодействие по всей длине кристалла. Такие генераторы дают на выходе энергию до 3 мДж, что достаточно для неведения необходимого для измерения поглощения образца.

Само изменение поглощения регистрируется по поглощению другого пикосекундного импульса, который должен иметь достаточно малую энер: ию, чтобы не производить существенных изменений оптической плотности в образце, но достаточную для регистрации фотоприемником.

Наиболее распространенный способ получения зондирующего импульса основан на явлении исключительно большого спктрального уширения интенсивных, импульсов - генерации пикосекундного континуума - в широком классе веществ, в том числе в тяжелой воде, спирте. Считается, что этот эффект связан с фазовой самомодуляцией лазерного импульса в нелинейной среде /204/, однако, существуют и другие предположения о механизме генерации пикосекундного континуума.

Для получения континуума необходимы импульсы длиной волны 1064 нм и имеющие энергию 5 мДж, для накачки параметрического генератора - импульсы второй гармоники 532 нм, энергией 15-30 мДж. К настоящему времени достигнут значительный пргресс в реализации высоких: коэффициентов преобразования основного излучения во вторую гармонику /205/, В описываемой установке удвоение частоты основного излучения производилось в кристалле ІЩР /длиной I см/, энергетический коэффициент преобразования во вторую гармонику достигает 50%.

С помощью поляризатора Глана-Тейлора излучение разделяется на дна канала: зондирующий с длиной волны 1064 нм и излучением, поляризованным перпендикулярно плоскости рис.2, и возбуждающий с длиной волны 532 нм, поляризованный в плоскости рисунка. В кнале зондирования используется источник пикосек&дного континуума, представляющий собой кювету с тяжелой водой длиной 10 см, в которую фокусируется излучение основной частоты линзой с фокусным расстоянием 20 см. Энергия континнума в области 400-200 нм равна 40 мкДж. Спектр излучения континуума приведен на рис.4. В зондирующем канале расположены устройства для выделения определенной части спектрального диапазона пикосекундного континуума / интерференционный клин/, монохроматор;: и линия оптической задержки /ЛЗ/, управляемые шаговыми двигателями. Оптическая линия задержки позволяет регистрировать кинетики изменения оптической плотности образца во временном интервале 0-12 не с минимальным шагом I пс. В канале возбуждения была выбрана двух-кристальная сверхлюминесцентная схема параметрического генератора света ДІГС/, которая обеспечивает высокую энергетическую эффективность и прстоту технического исполнения. В ЇЇГС применяются два кристалла КДР /е-ое/ длиной 4 см, размещены на расстоянии 40 см. Излучение накачки /532 нм/ фокусируется цилиндрической линзой с фокусным расстоянием 70 см. Для плавного изменения длины волны используется угловая перестройка при помощи прецизионных; держателей кристаллов, обеспечивающие быструю перестройку без пространственного смещения светового пучка. В результате ПГС позволяет осуществить изменение длины волны возбуждающего излучения в диапазоне 800-1600 нм с энергетической эффективностью не менее 5-10$. Высокая мощность излучения ПГС позволяет расширить спектральный диапазон методом генерации второй гармоники.

Кинетика первичного разделения зарядов в реак ционных центрах бактерии

В настоящее время довольно хорошо изучены строение, состав и процессы, происходящие в реакционных центрах фотосинтезирую-щих, бактерий. Высокая квантовая эффективность фотохимического акта при фотосинтезе указывает на то, что первичное разделение зарядов в РЦ должно происходить с исключительно высокой скоростью Количественные расчеты, выполненные на основании экспериментальных данных о величинах квантовых выходов первичного акта и длинноволновой флуоресценции РЦ позволили получить значение константы фотохимической реакции К Ю10 - Ю11с"1 / 18,19,36,217 /.

Было установлено, что первичный донор электрона димер бак-териохлорофилла Р870 при получении энергии кванта света за время менее I пс переходит в синглетное возбужденное состояние.Далее РЦ переходит в так называемое состояние Р . Некоторыер. авторы считают, что состояние Р представляет собой смесь состояний ІР870+ Р800" и ІР870+Бф / 50 /, где Р800 по-видимому,мономер бактериохлорофилла с максимумом поглощения в полосер 800 нм. Другие полагают, что состояние Р включает в себя последовательный перенос электрона с Р800" на Бф. Характерное время жизни состояния Р составляет 4-7 пс /47,217,219,220/.

Большая часть данных о первичных этапах разделения зарядов в РЦ получена методом абсорбционной пикосекундной спетроскопии, тогда как данных и дезактивации состояния Р870 , отражающих, в основном переход Р870— Р870 , существенно меньше.

Впервые кинетика быстрой пикосекундной флуоресценции была /217,219,221,222/ зарегистрирована в работах:/ /. Однако эксперименты были выполнены с недостаточно высоким временным разрешением 8 пс на препаратах РЦ, отдельные молекулярные характеристики которых отличаются от нативных. В последующих работах, выполненных в других лабораториях, было подтверждено наличие быстрого компонента в кинетике затухания флуоресценции РЦ, связанного с переходом Р870 в состояние Р , и исследована зависимость квантового выхода этой флуоресценции от условий среды /рН, температура и др./. Однако временного разрешения используемой аппаратура оказалось недостаточно для точного1 определения времени жизни Р870 /223/.

В настоящей работе было изучено фотохимическое разделение зарядов в РЦ, выделенных из хроматофоров Rf s, 1\АЄvoider штамм I760-I с применением детергента лаурилдиметиламиноксида. Молекулярные характеристики таких препаратов и кинетика переноса электрона в них практически идентичны таковым i4 vriiro . Целью данного исследования являлось провести сравнительное исследова-ние реакции образования состояния Р методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии в одном эксперименте на одном и том же препарате. По нашим сведениям такое сравнительное исследование с достаточно высоким временным разрешением выполнено впервые.Флуоресценцию РЦ возбуждали одиночными импульсами света с 1\ = 530 нм, \Мп= 2 пс, плотность энергии J = 10 квант/сьг, частота следования 0,5 Гц.

Кинетику затухания флуоресценции РЦ регистрировали с помощью электронно-оптического преобразователя, сопряженного с ви-диконом и анализатором импульсов М0Щ LP-4840. Временное разрешение флуорометра составляло 1,5 пс. Установка работала в режиме накопления, что в раз /N - число накоплений/ улучшает отношение сигнал/шум и увеличивает динамический диапазон системы регистрации. Обработку экспериментальных данных с учетом аппаратной характеристической фукции осуществяли по методу затухающих наименьших квадратов Левенберга на ЭВМ "Электроника НЦ-80". Кинетику изменения поглощения, отражающую перенос электрона Р870 — Р измеряли на автоматизированном пикосекундном обсорбци-онном спектрометре,описанном выше. Число накоплений в каждом измерении устанавливалось ЭВМ и определялось заданием точности измерения. В процессе измерения обуществлялся отбор импульсов света по длительности, что в совокупности с математическими методами обработки экспериментальных данных с учетом аппаратной функции импульсов возбуждения и зондирования позволило довести временное разрешение спектрометра до 3 пс.

На рис. II представлены кинетики затухания длинноволновой флуоресценции, зарегистрированной в препаратах РЦ с восстановленными - кривая 2/ / и окисленными - кривая З Р870. Выделение области регистрации кинетики флуоресценции осуществляли интерференционными светофильтром сЬ = 926 од, лТ\ = 10 нм. Экспериментальные точки I, а также пунктирная линия 2 /—/ соответствуют аппаратной характеристической функции флуорометра.

Определение истинного времени затухания флуоресценции в моноэкспоненциальном приближении выполнено методом свертки аппаратной функции с экспонентой вида (1» A. Расчеты показывают, что экспериментальные точки наилучшим образом аппроксимируются такой экспонентой с величиной 0= б пс. /теоретическая кривая проведена на рис.11 сплошной линией/. Таким образом можно заключить, что затухание флуоресценции при 926 нм описывается экспонентой с % = 6 пс. Вместе с тем,Ёкинетике затухания флуоресценции РЦ /рис.11/ проявляется также наносекундный компонент свечения, вклад которого по отношению к быстому,незначителен.

Похожие диссертации на Пикосекундная спектроскопия процессов деления и рекомбинации зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rps. sphaeroides и ФС I высших растений

Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeБутылин Павел Андреевич

Математические модели электромембранных процессов очистки воды с учетом реакции диссоциации-рекомбинации воды и пространственного заряда Сеидова Наталья Михайловна

Кинетическая спектроскопия процессов протонного обмена в системах с водородной связью Бурейко Сергей Федорович

Инфракрасная спектроскопия процессов сольватации и температурно-фазовых переходов в высокодипольных средах и ионных расплавах Гаджиев Алил Зайдилаевич

Нестационарная оптическая спектроскопия процессов релаксации электронной подсистемы полупроводниковых квантовых точекЛеонов, Михаил Юрьевич

Исследование методами акустической спектроскопии процессов структурной релаксации и кристаллизации в объемных металлических стеклахКолыванов Евгений Леонидович

Лазерная спектроскопия неравновесных процессов в полупроводниковых квантовых нитях и точках Жуков Евгений Алексеевич

Столкновительно-излучательные процессы в спектроскопии плазмыДемченко Григорий Викторович

Фемтосекундная спектроскопия релаксационных процессов в CdSexSi1-x кристаллитах, пленках С60 и YBa2Cu3O7-дельтаСтепанов, Андрей Георгиевич

Спектроскопия фотофизических процессов в гетерогенных молекулярных системахСалецкий, Александр Михайлович