Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 7
2.1. Молекулярные механизмы фоторецепции 7
2.2. Описание кинетики фототрансдукции в рамках математического моделирования 16
3. Постановка задачи 25
4. Моделирование процесса фототрансдукции темноадаптированной палочки при предъявлении одиночных вспышек 28
4.1. Фаза активации фотоответа 28
4.2. Фаза восстановления фототоответа 31
4.3. Система уравнений, описывающих процесс фототрансдукции 34
5. Определение критических этапов кинетики процесса фототрансдукции 47
5.1. Влияние отдельных стадий на кинетику фазы активации фотоответа 4S
5.2. Активация родопсина 49
5.3. Взаимодействие родопсина с трансдуцином 50
5.4. Взаимодействие трансдуцина с фосфодиэстеразой и гидролиз цГМФ 51
5.5. Регуляция активности цГМФ чувствительных каналов 57
5.6. Результаты 63
6. Построение модели при использовании констант, полученных альтернативными методами 67
7. Моделирование адаптационных процессов 73
7.1. Деактивация родопсина 75
7.2. Регуляция активности гуанилатциклазы 79
7.3. Результаты 89
7.4. Роль отдельных механизмов в обеспечении адаптационных процессов 91
Заключение 95
Выводы 97
Приложение 1. Система дифференциальных уравнений, описывающая процесс генерации фотоответа в темновой адаптированной палочки в ответ на одиночную вспышку 99
Приложение 2. Использованные обозначения 104
Приложение 3. Количественные параметры кинетической модели 105
Список литературы 108
- Описание кинетики фототрансдукции в рамках математического моделирования
- Фаза восстановления фототоответа
- Взаимодействие родопсина с трансдуцином
- Регуляция активности гуанилатциклазы
Введение к работе
Изучение механизмов сенсорной рецепции обнаружило сходный характер процессов протекающих при преобразовании сигналов различной модальности. Оказалось, что механизмы трансдукции (усиления и десенситизации сигнала) в процессах сенсорной, гормональной и синаптпческой рецепции, за исключением, может быть, механорецепции, в принципе, близки.
Во всех этих случаях принимают участие белок-рецептор (белок из семейства G-белков), передающий сигнал на фермент-мишень, белки, осуществляющие десенситизацию (киназы, фосфорилирующие белок-рецептор) и белки из семейства арестинов.
Зрительный пигмент родопсин является классическим белком-рецептором, типичным представителем большого семейства G-белок-связывающих рецепторов. Его принципиальным отличием является то, что вместо сигнальной молекулы (гормон, нейромедиатор, одорант) в этом случае выступает квант света. Если химическое вещество как сигнал взаимодействует с рецепторным сайтом белка-рецептора, локализованным на N-концевой части полипептидной цепи или петель, экспонированных во внеклеточное пространство, то свет поглощается хромофорной группой, находящейся в гидрофобном ядре молекулы родопсина. Иными словами, информационный сигнал в родопсине передается изнутри наружу, а именно на С-концевую часть молекулы и гидрофильные петли на цитоплазматической стороне мембраны, а во всех остальных случаях - с N-концевого фрагмента и петель на С-концевой, внутриклеточный участок полипептидной цепи. Следует подчеркнуть, что в случае родопсина N-концевой фрагмент в палочке экспонирован во внутридисковое пространство и не несёт никакой функциональной нагрузки с точки зрения внутримолекулярной передачи сенсорного сигнала. С другой стороны, С-концевой фрагмент и петли на цитоплазматической поверхности мембраны во всех случаях, включая фоторецепцию, являются ключевыми для взаимодействия белка-рецептора с G-белками, киназами и арестинами. Естественно предположить, что молекулярные механизмы такого взаимодействия близки. Только в случае фоторецепции эти молекулярные механизмы описаны достаточно подробно. Действительно, родопсин явился первым типичным интегральным мембранным белком, первичная, вторичная и третичная структура которого была установлена. Его топография в фоторецепторной мембране (семь трансмембранных столбов) явилась прототипом всех известных в настоящее время G-белок-связывающих рецепторов. Арестиы также впервые был обнаружен в зрительной клетке, и его роль в десенситизации белка-рецептора была установлена. До недавнего времени считалось, что он является уникальным фоторецепторным белком. Выяснилось, однако, что он лишь представитель семейства подобных белков. Становится очевидным, что успехи в понимании молекулярных механизмов взаимодействия ключевых белков фототрансдукции родопсина, G-белка, родопсиновои киназы и арестина - открывают реальную возможность для подобного рода исследований в отношении молекулярных механизмов трансдукции других модальностей.
При описании сложных биохимических систем, начиная с некоторого момента описание лишь отдельных этапов перестает быть информативным для понимания общей картины. Учитывая то, что в последние годы накопилось большое количество новых данных относительно детальных молекулярных механизмов, обеспечивающих процесс фототрансдукции, представляется весьма актуальным их обобщение в рамках кинетической математической модели. С одной стороны это может позволить получить более глубокое понимание системы взаимосвязей в процессе сигнальной трансдукции. С другой стороны математическая модель позволяет свести воедино экспериментальные данные, полученные различными методами и проверить их на противоречивость друг другу.
Целью представленной работы было: во-первых, обобщить современные представления о молекулярных механизмах фототрансдукции в рамках математической кинетической модели. Во-вторых, проверить на противоречивость друг другу ряд экспериментальных данных, полученных различными методами.
Описание кинетики фототрансдукции в рамках математического моделирования
Математическое рассмотрение кинетики фототрансдукции было проведено ранее в ряде работ. Первая математическая модель фототрансдукции была предложена Ходжкиным и сотр. (Baylor et. al., 1974а; Baylor et. al., 1974b). Именно в этих работах впервые было достоверно измерено изменение потенциала на мембране зрительной клетки в сетчатке при поглощении света и стало ясно, что существует последовательность молекулярных механизмов, обеспечивающих появление этого потенциала - соотвествующие процессы впоследствии получили название фототрансдукции.
Поскольку никаких представлений о природе этих механизмов в тот момент не было, авторами была предложена чисто формальная математическая модель, которая представляла процесс появления фотопотенциала как результат последовательности реакций первого порядка. Решение такой системы было получено аналитически в виде суммы экспоненциальных членов. В результате сравнения с экспериментальными кинетическими кривыми авторами процесс активации фотоответа был представлен в виде шести-семи последовательных химических реакций первого порядка.
Следует отметить, что в данной работе рассматривался лишь передний фронта сигнала фототрансдукции, соответствующий фазе активации фотоответа. Возможность моделирования процессов восстановления появилась существенно позже по мере выяснения подробных молекулярных механизмов фототрансдукции. Однако, несмотря на простоту подхода данной работы, нельзя недооценивать ее значения для развития науки в области физиологии рецепции. Так именно в ней впервые были поставлены задачи и акценты, которые предопределили направления теоретических и экспериментальных исследований фоторецепции в последующие годы.
В последние два десятилетия экспериментально были выявлены конкретные реакции, обеспечивающие процесс фототрансдукции, и, соответственно, появились возможности теоретического построения более точных моделей, раскрывающих вклад отдельных стадий в общую кинетику каскада фототрансдукции. При этом для решения поставленной задачи - моделирования кинетики фототока в ответ на предъявление вспышки - различными авторами использовались два основных направления. Первый подход предполагал решение кинетической модели в явном аналитическом виде. Однако, в виду сложности системы дифференциальных уравнений, описывающих кинетику фототрансдукции, точного аналитического решения получить не удается. Поэтому авторы, использующие данный подход, были вынуждены прибегать к ряду дополнительных упрощений характеризующихся разной степенью обоснованности. В результате, полученные ими решения нельзя считать точными при количественном описании кинетической системы. Однако преимуществом аналитического подхода является то, что часто можно провести прозрачное качественное рассмотрение структуры полученного решения: в явном виде наблюдать вклад отдельных процессов общую кинетику процесса. Второй подход заключается в том, что строится по возможности наиболее полная (а соответственно и наиболее сложная) система дифференциальных уравнений, описывающих все известные реакции продесса фототрансдукции, и для ее решения используются численные методы. С развитием вычислительной техники данный подход стал вполне удобным инструментом для рассмотрения различных сложных кинетических систем. Преимуществом этого метода является высокая точность полученного решения. Однако использование численных методов не позволяет получить в явном виде различного рода функциональных зависимостей между отдельными компонентами, составляющими рассматриваемую систему (линейная, экспоненциальная и т.д.). Например, если поведение одного из компонентов системы зависит от многих динамических факторов при известном аналитическом решении сразу будет виден вклад каждого из них на различных временных промежутках. В случае же численного решения аналогичный анализ в явном виде провести не удается. Поэтому для изучения свойств полученного решения (например, для определения критических этапов) необходимо проводить целый ряд дополнительных расчетов.
Фаза восстановления фототоответа
После генерации фотоответа зрительный рецептор должен вернуться к исходному темновому состоянию. Для этого необходимо, чтобы цГМФ-чувствительные каналы перешли обратно в открытое состояние. Поскольку при изменении внутриклеточной концентрации цГМФ новое равновесие между связанной и свободной формой мембранных каналов устанавливается очень быстро, критическое значение имеет именно восстановление темнового значения концентрации цГМФ.
Восстановление внутриклеточной концентрации цГМФ обеспечивается за счет кальций-зависимого усиления работы гуанилатциклазы. В темноте в клетке устанавливается постоянная концентрация кальция, когда суммарный ток по кальцию равен нулю. С одной стороны, кальций поступает в клетку через цГМФ-зависимые каналы. С другой стороны, натрий-кальциевый обменник постоянно откачивает ионы кальция из цитоплазмы в межклеточную среду. Закрытие цГМФ-зависимых каналов при фотоответе приводит к уменьшению внутриклеточной концентрации кальция. В результате снижения концентрации внутриклеточного кальция происходит ускорение синтеза цГМФ гуанилатциклазой.
Однако только ускорение синтеза цГМФ не может обеспечить восстановление его темновой концентрации. Необходимо также остановить процесс гидролиза цГМФ фосфодиэстеразой, активированной светом. Для этого нужно, с одной стороны, инактивировать молекулы фосфодиэстеразы: а с другой стороны, прекратить процесс активации новых молекул фосфодиэстеразы, в основе которого лежит каталитическая активность возбужденного родопсина. Первый процесс обеспечивается ГТФ-азной активностью трансдуцина. Для прекращения гидролитической активности фосфодиэстеразы необходимо обеспечить диссоциацию а-субъединицы трансдуцина от у-субъедишщы фосфодиэстеразы. Эта диссоциация становится возможной только после гидролиза молекулы ГТФ; связанной с трансдуцином. Причем гидролитической способностью обладает сама а-субъединица трансдуцина (Pugh et. al., 1999).
Второй процесс связан с инактивацией активной формы родопсина -метародопсина II. Время жизни метародопсина II очень велико, поэтому в фоторецепторах существуют специальные молекулярные механизмы, позволяющие значительно ускорить процесс инактивации фотолизированного родопсина (Pugh et. al., 1999; Pulverirmller et. al., 1993). Для этого активный родопсин последовательно фосфорилируется родопсинкиназой, причем активность родопсинкиназы регулируется внутриклеточной концентрацией кальция: при уменьшении [Са2+] процесс фосфорилирования родопсина ускоряется. Далее фосфорилированная форма родопсина связывается с белком арестином, который при этом блокирует каталитические центры родопсина.
Амплитуда фототока пропорциональна количеству закрывающихся в ответ на засветку цГМФ-чувствительных ионных каналов (такое утверждение является обоснованным для экспериментов проводимых Б условиях фиксированной разницы потенциалов на клеточной мембране (voltage clump), а именно такие экспериментальные данные использовались нами для апробации теоретических расчетов). Чем более интенсивной будет вспышка, тем большим будет количество закрывающихся каналов и, соответственно, тем большей будет амплитуда фототока. Однако при достижении некоторой пороговой интенсивности засветки все каналы перейдут в закрытое состояние, и фототок достигнет максимально возможной величины. В ответ на вспышки большей интенсивности амплитуда фототока будет той же самой. Исходя из этого, можно перейти от абсолютных (пА) к относительным величинам фототока. При этом отпадает необходимость прямого расчета коэффициента пропорциональности между амплитудой фототока и количеством открытых цГМФ-чувствительных ионных каналов: необходимо лишь сопоставить две пары значений. Нулевому значению фототока соответствует количество открытых в темновом состоянии каналов. За единицу принимается максимальная амплитуда фототока, соответствующая ситуации, когда все каналы закрыты. Таким образом, кинетику фототока можно описать следующей формулой: р(1) = 1_РД гуаш
Как видно из приведенной формулы, скорость синтеза цГМФ не равна нулю даже в условиях темновой адаптации, при концентрации кальция 550 нМ. Это явление объясняется тем, что даже в отсутствие освещения в палочках происходит постоянный гидролиз и одновременно синтез цГМФ. Очевидно, что в темноте скорости гидролиза и синтеза цГМФ будут постоянны и равны между собой. Из литературы известно (Lamb and Pugh, 1992), что эта скорость составляет 4 мкМ/с.
Для расчета теоретических кривых остается лишь задать значения кинетических констант. При этом часть этих значений известна из литературы (ki - активация родопсина, к9, кю, К„ - гидролиз цГМФ фосфодиэстеразой, Kd, h - регуляция состояния цГМФ-чувствительных каналов; КСа, fee, 1темн , IOSM - параметры, определяющие ток ионов кальция через мембрану) (Приложение 3). Кроме того, из литературных данных (Lamb and Pugh, 1992; Schleicher et. al., 1989) известно о быстропротекающем характере ряда стадий процесса фототрансдукции (k3, к5 - два этапа взаимодействия родопсина с трансдуцином, к2р -процесс распада комплекса трансдуцин-фосфодиэстераза, klap -взаимодействие фосфорилированного родопсина с арестином).
Значения остальных кинетических констант в литературе не представлены и были получены нами в результате численного варьирования (k2; )ц, кб - три этапа взаимодействия родопсина с трансдуцином, kj, ks - взаимодействие трансдуцина с фосфодиэстеразой, kip - «временная доминанта» инактивации родопсина, УГЦмакс - максимальная скорость работы гуанилатциклазьг, Кб - взаимодействие кальция с внутриклеточным буфером). Варьирование констант производилось таким образом, чтобы обеспечить наилучшее соответствие с рассматриваемыми экспериментальными кривыми. Однако, проводить подбор неизвестных в модели коэффициентов, ориентируясь лишь на кинетику фототока, некорректно, так как количество параметров для варьирования велико. Соответственно, получить в этом случае достаточно узкие интервалы решений для каждого коэффициента невозможно. Поскольку в литературе определена кинетика не только конечного «продукта» -фототока, но и некоторых промежуточных продуктов, это дает возможность упростить поставленную задачу.
Так, освещение системы, содержащей родопсин, трансдуцин и ФДЭ, сопровождается изменением сигнала светорассеяния (Кшш et. а!., 1981; Heck and Hofmarm, 1993; Heck et. al., 2000). Точный механизм этого процесса неизвестен, однако предполагается, что сигнал светорассеяния отражает изменение эффективной толщины фоторецепторньтх дисков, которое может происходить в результате связывания или диссоциаций белковых молекул. Отсюда следует, что форма сигнала светорассеяния позволяет выявить кинетику отдельных реакций процесса фототрансдукции. Известно, что при активации трансдуцина его а-ГТФ-субъединица диссоциирует от родопсина в цитоплазму, уменьшая тем самым толщину диска. Последующее связывание а-ГТФ субъединицы с фосфодиэстеразой производит обратный эффект - утолщение диска. Таким образом, в реконструированных системах, содержащих связанный с дисками родопсин и трансдуцин, сигнал светорассеяния будет отражать кинетику активации трансдуцина - соответствующая кривая называется «сигналом диссоциации» (Heck and Hofmann, 1993). При добавлении в реконструированную систему фосфодиэстеразы сигнал светорассеяния будет отражать кинетику образования комплексов трансдуцин-фосфодиэстераза - этот сигнал называется «сигналом фосфодиэстеразы» (Heck and Hofmann, 1993).
Взаимодействие родопсина с трансдуцином
Процесс активации фотоответа в палочках сетчатки представляет собой сложную последовательность биохимических реакций, в которой сочетаются как этапы без усиления сигнала, так и процессы усилительного характера. Соответственно, характеризуя поведение такой системы, представляется важным выявить критические с кинетической точки зрения стадии, протекание которых определяло бы совокупную кинетику всего процесса.
Известно, что кинетика протекания простой неразветвленной последовательности реакций часто может определяться скоростью протекания одной самой медленной реакции, которая и будет в этом случае критическим этапом всего процесса. Наиболее репрезентативным является пример гликолиза. Однако важно отметить, что в процессе гликолиза отсутствуют этапы каталитического усиления, поэтому можно ожидать, что скорость протекания гликолиза в основном будет определяться одной самой медленной реакцией, тогда как влияние остальных реакций окажется незначительным. Очевидно, что при переходе к рассмотрению кинетики более сложных процессов, в которых присутствуют усилительные механизмы, количество критических этапов должно возрастать. Так исследуемый в представленной работе процесс фототрансдукции характеризуется на этапе активации фотоответа двумя внутриклеточными этапами усиления: S во-первых, каждая молекула возбужденного родопсина каталитически активирует некоторое количество молекул трансдуцина; V во-вторых, активная форма фосфодиэстеразы также каталитически гидролизует молекулы циклического ГМФ. Соответственно, можно ожидать появления еще как минимум двух этапов, скорость которых будет оказывать критическое влияние на кинетику процесса в целом. Приведенные выше рассуждения применимы к описанию кинетического поведения фазы активации фотоответа, которая протекает в течение нескольких десятков миллисекунд. Детальное рассмотрение следующей за ней фазы восстановления фотоответа необходимо проводить отдельно, так как она происходит в совершенно иных временных рамках - в течение нескольких секунд, (соответствующий анализ представлен в части, посвященной адаптационным процессам (см. стр.73)).
Рассмотрим последовательно вклад отдельных этапов каскада фототрансдукции в общую кинетику. Очевидным представляется в качестве общей кинетической характеристики процесса использовать временную зависимость фототока в ответ на засветку темновой адаптированной палочки.
В рамках данного исследования нами было проведено несколько серий теоретических расчетов. Внутри каждой серии варьировалось значение одной из кинетических констант, характеризующих скорость протекания соответствующего этапа, и наблюдалось расхождение получаемых кривых фототока от рассчитанных изначально (подробно расчет исходных значений констант описан в предыдущей части (см. стр.23)). В качестве количественного параметра, характеризующего различие между двумя кривыми, использовалось время достижения полумаксимальной амплитуды фототока (время на половине высоты кривой (Ti/2)). Рис. 7 отражает вклад в общее поведение системы времени фотоактивации родопсина. Как видно из представленных кривых данный этап не оказывает заметного влияния на изменение фототока. Видно, что скорость протекания данной реакции в исходных условиях достаточно высока. Так увеличение константы скорости данной реакции в 20 раз не приводит к заметному ускорению фазы активации фотоответа: время на полувысоте уменьшилось лишь на 1,3 % (с 95,87 мс, до 94,61 мс). С другой стороны фотоактивацию родопсина нельзя считать мгновенной реакцией, так уменьшение константы скорости этой реакции приводит к заметному, хотя ж не очень значительному замедлению фотоответа (уменьшение скорости реакции в 20 раз увеличило Тш на 19,3 %).
Как было описано выше, каталитическая активация трансдуцина родопсином протекает в результате пяти последовательных реакций (уравнения (2)-(6)). Очевидно, что рассматривать влияние изменения скоростей реакций (3) и (5) не имеет смысла, так как они учитывались в кинетической модели как быстропротекающие. Таким образом, из пяти реакций взаимодействия родопсина с трансдуцином остаются для рассмотрения три: (2), (4) и (6). Рис. 8-10 характеризуют вклад отдельных реакций активации трансдуцина в общую кинетику фазы активации фотоответа. Из представленных на рис.8 данных видно, что влияние реакции (2) на кинетику фототока незначительно. Поведение системы в данном случае похоже на вклад реакции (1): увеличение скорости протекания реакции не вносит заметный вклад в кинетику фототока (ускорение реакции в 20 раз приводит к уменьшению Тш на 2,0 %), однако уменьшение скорости приводит к значимому замедлению фотоответа (замедление реакции в 20 раз приводит к уменьшению Тш на 28,1 %). Однако, сравнение влияния реакций (1) и (2) позволяет отметить качественные различия: так если замедление реакции (1) вносит больший вклад в начальные моменты активации фотоответа, то вклад реакции (2) проявляется в основном на конечном промежутке фазы активации фотоответа. Данный факт можно объяснить тем, что в последовательности реакций каскада фототрансдукции фотоактивация родопсина предшествует связыванию родопсина с транс дуцином.
Регуляция активности гуанилатциклазы
Учет активности гуанилатциклазы является вторым определяющим фактором для адаптационных процессов в фоторецепторах. При детальном рассмотрении видно, что эта формула обладает рядом существенных недостатков. Во-первых, при [Са ]- » скорость синтеза цГМФ стремится к нулю. Но из экспериментальных данных (Dizhoor et. al, 1998) следует, что при повышении концентрации кальция скорость синтеза стремится к некоторому отличному от нуля значению (рис. 20). Во-вторых, представленная зависимость не учитывает опосредованный характер активации гуанилатциклазы. В третьих, в данном представлении реакции регулирующие скорость работы гуанилатциклазы учитываются как мгновенные. Для взаимодействия кальция с регуляторными белками такая оценка выглядит обоснованной, но для реакций взаимодействия GCAP-белков (guanylyl cyclase activating proteins) с гуанилатциклазой такое допущение не является очевидным.
В силу этого для более адекватного кинетического описания работы гуанилатциклазы, разумно перейти от эмпирической зависимости к рассмотрению в модели соответствующих молекулярных механизмов. Молекула гуанилатциклазы представляет собой трансмембранный белок, локализованный в фоторецепторных дисках. Известно, что в палочках гуанилатциклаза присутствует в форме димеров (Olshevskaya et. al., 1999; Yu et. al., І999). Скорость работы гуанилатциклазы регулируется концентрацией внутриклеточного кальция. Причем регуляция происходит опосредованно через модуляторные белки (GCAP1 и GCAP2) (Dizhoor and Hurley, 1999).
Хотя точный механизм регуляции активности гуанилатциклазы на сегодня неизвестен, в ряде последних литературных работ (Olshevskaya et. al., 1999) предлагается следующая картина активации гуанилатциклазы. Димеры гуанилатциклазы связываются с GCAP-белками, образуя комплексы GCAP-rn-rU-GCAP. При этом GCAP-белки обладают способностью к обратимому связыванию ионов кальция, выполняя, тем самым, функцию кальций-чувствительных сенсоров в регуляции активности гуанилатциклазы. Связывание ионов кальция GCAP-белками приводит к электростатическому отталкиванию между ними. В результате комплекс ССАР-ГЦ-ГЦ-ОСАР претерпевает конформационные перестройки, при которых молекулы гуанилатциклазы ототдвигаются друг от друга, что приводит к ослаблению их каталитической активности.
В литературе представлены различные экспериментальные данные по измерению активности гуанилатциклазы в зависимости от концентрации внутриклеточного кальция (Dizhoor et. al., 1998; Dizhoor and Hurley, 1999; Gorczyca et. al., 1994). Из представленных на рис. 20А данных видно, что в отсутствие молекул GCAP активность гуанилатциклазы находится на некотором уровне и практически не зависит от концентрации кальция. При добавлении GCAP-белков активность гуанилатциклазы приобретает ярко выраженную зависимость от концентрации кальция. При этом часть гуанилатциклазы находится в свободном состоянии и, соответственно, дает независимый от концентрации кальция вклад в общую активность синтеза цГМФ. Оставшаяся часть молекул гуанилатциклазы связана с GCAP-белками и может находиться либо в свободном от кальция, либо в связанном с кальцием состоянии. При низкой концентрации кальция все комплексы GCAP-ГЦ-ГЦ-GCAP находятся в свободной от кальция форме, и поэтому общая активность гуанилатциклазы выходит на свой максимальный уровень. Из рис.20 видно, что при насыщенной концентрации кальция активность GC намного ниже активности свободной от GCAP формы. Это говорит о том, что кальций связанная форма GCAP оказывает ингибирующее влияние на димер ГЦ-ГЦ, и таким образом активность кальций связанной формы комплекса ОСАР-ГЦ-ГЦ-ССАР близка к нулю.
Неизвестные константы диссоциации оценивались следующим образом: Kdl=0.99 цМ - находилась из соотношения активности гуанилатциклазы в отсутствии GCAP и минимальной активности гуанилатциклазы в присутствии GCAP и при насыщенной концентрации кальция. Kd2=0.084 цМ - находилась из точки пересечения активности гуанилатциклазы в отсутствии GCAP и активности гуанилатциклазы в присутствии GCAP.
Значения скоростей синтеза для двух форм гуанилатциклазы (v =31 ceK-l;v2=4 сек-1) рассчитывались из соотношения максимальной и минимальной активностей гуанилатциклазы в присутствии GCAP, а также из условия равенства нулю фототока в условиях темновой адаптации, т.е. при внутриклеточной концентрации кальция равной 550 нМ (Gray-Keller and Detwiler, 1994).
На основе полученных констант была построена теоретическая зависимость активности гуанилатциклазы от внутриклеточной концентрации кальция. Сравнение ее экспериментальной кривой (рис. 20Б) показало, большое расхождение данных. Это говорит о том, что учет взаимодействия GCAP лишь с одним ионом кальция недостаточен. Поэтому далее модель была дополнена реакциями, учитывающими взаимодействие GCAP с двумя ионами кальция. При этом считалось, что связывание даже одного иона кальция приводит к потере активности гуанилатциклазы. Кроме того, считалось, что связывание ионов кальция происходит последовательно с одинаковым сродством.
