Содержание к диссертации
Введение
1. Строение и функционирование наружного сегмента палочки сетчатки позвоночного 14
1. Морфология фоторецепторной клетки. Электрический ответ фоторецептора 14
2. Медиаторный механизм передачи сигнала в НСП. Требования к медиатору 19
3. Попытки экспериментального подтверждения кальций--медиаторной гипотезы Хагинса 20
4. Циклические нуклеотиды могут являться медиатором в передаче возбуждения в фоторецепторе 27
2. Функции гтф-связшащих белков 46
1. N-белки в механизмах гормональной рецепции 46
2. Участие ГТФ-связывающих белков в процессе элонгации трансляции прокариот 50
3. Участие ГТ$-связывающего белка в механизме активации светозависимой Щд в НСП 51
4. Постановка задачи исследования 57
Материалы и методы
1. Материалы 62
2. Получение препаратов наружных сегментов палочек сетчатки лягушки 63
3. Получение мембран дисков наружных сегментов (ЩЩС).. 65
4. Получение препарата,обогащенного водорастворимыми белками НСП 65
5. Центрифугирование НСП в градиенте плотности сахарозы, б5
6. Очистка комплекса белков НСП, обладающих светоза-висимой сорбцией на фоторецепторные мембраны 66
7. Термоденатурация препаратов и супернатанта НСП 66
8. Электрофоретическое разделение белков в полиакрил-амидном геле ( SDS -электрофорез) 67
9. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях 68
10. Разделение водорастворимых белков методом гель-фильтрации на Сефакриле S -200 70
11. Изоэлектрофокусирование белков в амфолинах 70
12. Связывание гуаниловых нуклеотидов с препаратами НСП.. 72
13. Измерение Са -связывающей способности фракций, полученных после гель-фильтрации белков супернатанта НСП 74
14. Тонкослойная хроматография нуклеотидов 74
15. Приготовление растворов с заданной концентрацией свободного Са х 74
16. Шосфорилирование /14о/ ГДІ, связанного с нуклеотид-связывающими центрами НСП 75
17. Определение аденилаткиназной активности 76
18. Измерение гуанозиндифосфактиназной КФ 2.7.4.6 активности 77
19. Методы измерения нуклеозидтрифосфатазных активностей. 77
20. Определение концентрации белка 78
Результаты собственных исследований 79
1. ГТФ-связывающий белковый комплекс НСП сетчатки лягушки 79
1. Зависимость связывания /^Н/ГВДФ препаратами НСП от количества обесцвеченного родопсина 79
2. SDS -электрофорез в ПААГе белков супернатанта НСП
3. Изоэлектрофокусирование белков супернатанта НСП 85
4. "Комплекс Кюна" из НСП сетчатки лягушки 85
5. Гель-фильтрация белков супернатанта и идентификация ГТФ-связывагащего белка 87
6. Термоинактивация ГТФ-связывающей способности супернатанта НСП 92
2. Обменный механизм формирования активного состояния трансдуцина НСП сетчатки лягушки 96
1. Кинетические характеристики процессов связывания /3Н/ПЩФ и /14С/ГДФ препаратами НСП 96
2. Характеристика процессов диссоциации комплексов гуаниловых нуклеотидов с препаратами НСП 100
3. Оценки констант диссоциации гуаниловых нуклеотидов с нуклеотидсвязывающими центрами НСП 102
3. Фосфорилирование ГДФ, связанного препаратами НСП сетчатки лягушки, как возможный механизм форми рования активного состояния трансдуцина 104
1. Фосфорилирование связанного ГДФ 105
2. Влияние АТФ на связывание ГДФ препаратами НСП 109
4. Фосфотрансферазные активности, катализируемые трансдуцином НСП сетчатки лягушки
1. Аденилаткиназная активность препаратов НСП 112
2. Аденилаткиназная активность водорастворимой фракции НСП 114
3. ГДФкиназная активность различных типов препаратов НСП и водорастворимой фракции НСП 123
4. Термоинактивация АК, ГДФкиназной активностей и ЩЦФ--связывающей способности препаратов супернатанта НСП. 125
5. Светозависимость ГДІкиназной активности 125
5. Нуклеозидтрифосфатазные активности препаратов НСП. 127
1. Гидролиз ГТІ при низких (менее I мкМ) концентрациях.. 128
2. Сопряженные ферментативные реакции в НСП 130
3. Нуклеозидтрифосфатазные активности препаратов НСП 131
4. Распределение ГТФазной активности во фракциях, полученных при гель-фильтрации белков супернатанта НСП 133
5. Термоинактивация НТФазных активностей 134
6. Модуляция ферментативных активностей трансдуцина ионами кальция. Возможная функциональная роль у субъединицы трансдуцина 138
1. Регуляция ионами кальция гидролиза , связанного ГТФ.. 138
2. Зависимость ГДФкиназной активности от концентрации ионов кальция 139
3. Модуляция нуклеозидтрифосфатазных активностей 142
4. Са -связывающая способность фракций, полученных при гель-фильтрации препарата супернатанта НСП 145
5. Термостабильность фактора, обеспечивающего Са регуляцию ГТФазной активности ш^ и Чд субъединиц трансдуцина 149
Обсуждение результатов 152
Виводы 174
- Попытки экспериментального подтверждения кальций--медиаторной гипотезы Хагинса
- Центрифугирование НСП в градиенте плотности сахарозы,
- Шосфорилирование /14о/ ГДІ, связанного с нуклеотид-связывающими центрами НСП
- "Комплекс Кюна" из НСП сетчатки лягушки
- Термоинактивация АК, ГДФкиназной активностей и ЩЦФ--связывающей способности препаратов супернатанта НСП.
Введение к работе
Данная работа посвящена характеристике ГТ$-евязывающего белкового комплекса наружных сегментов палочек (НСП) сетчатки лягушки, в частности, выяснению механизма образования активного ( = активаторного) состояния ГТФ-связывающего белка, способного в комплексе с ГТФ модулировать скорость светозависимой фосфоди-эстеразы (ЗДЭ) циклических нуклеотидов НСП.
Исследование ферментативных систем метаболизма циклических нуклеотидов фоторецепторной клетки имеет важное практическое значение, поскольку нарушения обмена циклонуклеотидов являются нередко первым (если не единственным) ранним регистрируемым признаком некоторых патологических состояний, например, дисплазии палочек и колбочек /Этингоф Р.Н., 1979, 1981/.
С другой стороны, расшифровка механизма действия ГТФ-свя-зывающих белков имеет самостоятельное значение в связи с тем, что класс ГТФ-связывагощих белков играет ключевую роль в ряде важнейших физиологических процессов в организме: действии гормонов и нейромедиаторов, в процессах элонгации трансляции, сборки микротрубочек /fcodbell , 1980; Kazixo , 1978; Маг cum et a], 1978/.
Результаты изучения механизма функционирования белков этого класса могут иметь важное теоретическое и практическое применение в нейрофармакологии опиоидных пептидов, необходимых для более полного понимания действия болеутоляющих средств и создания препаратов, лишенных побочного действия, поскольку имеющиеся данные показывают, что действие опиатов опосредуется ГТФ-евязы-вающими белками /wilkening et al. , 1980; Koski et al. , 1981/.
Использование препаратов НСП сетчатки позвоночных для исследования ГТ$-связывающих белков имеет несомненное преимущест-
9 во перед другими объектами. Во-первых, имеется реальная возможность быстро и в препаративных количествах получать высокоочи-щенные нативные препараты НСП /Орлов Н.Я. и др., 1980; Гаспарян А.Г. и др., 1980/; во-вторых, НСП сетчатки позвоночных имеют ограниченную гетерогенность полипептидного состава, из которого часть белков функционально идентифицированы / Kuhn ,1980а ,Ъ /, в-третьих, ГТФ-связывающий белковый комплекс составляет значительную ДОЛЮ водорастворимой фракции белков НСП /Godchaux, Zimmerman , 1979/ и обладает светозависимой сорбцией на фоторецеп-торные мембраны, что существенно упрощает его выделение / Kuhn, 1980а/.
Следующие аргументы послужили нам основой для постановки задачи исследования. (I) Максимальная активация Щд в препаратах НСП наблюдается в присутствии ГТІ в мкМ концентрации /wheeler, Bitens ky t 1977/; негидролизуемый аналог ГТФ вызывает длительную активацию Щд, снижение Щд активности наблюдается при использовании ГТФ и связано с появлением ГТФазной активности с 1С менее I мкМ / Pober, Bitensky,1979 /. (2) ГТФазная активность сопряжена с двумя фракциями водорастворимых белков НСП /shinozawa , ві-tensky , 1980/. (3) В препаратах НСП наблюдается Са -зависимый гидролиз эндогенного ГТФ /Bernhaum , Bownds , 1979/, водорастворимые белки НСП обладают Са -ингибируемой ГТФазной активностью /Krapivinsky et al. , 1980/. Последние данные указывали на одно р, из мест действия ионов Са "" в НСП. Кроме того, было обнаружено сходство свойств светоактивируемой Щд и гормонактивируемой АЦ /Poher , Bitensky , 1979; Shinozawa et al. , 1979/, позволившее предположить, что НСП сетчатки позвоночных содержат ГТФ-связывающий белок. Однако к моменту начала нашей работы существование такого белка в НШ показано не было.
Из экспериментальных данных, представленных в диссертации, следует, что НСП сетчатки лягушки содержит ГТФ-связывающий белковый комплекс, представленный тремя полипептидами,молекулярная масса которых оценена нами в 39, 36 и менее 15 кД. Содержание его субъединиц составляет 7-8% от количества родопсина в НСП.
Параллельно и независимо от нас ГШ-евязывающий комплекс был обнаружен в НСП сетчатки быка / Fung et al., 1981/ и назван авторами трансдуцином (Т). Он также представлен тремя полипептидами 39, 36 и 10 кД, которые авторы / Fung et al. , 1981/ предложили обозначать Т^, т^ , соответственно. Ряд данных, изложенных ниже, позволяет утверждать, что НСП сетчатки лягушки и быка имеют аналогичный комплекс белков, представленный близкими по молекулярному весу полипептидами, поэтому, следуя введенным обозначениям, ГТФ-связывающий белковый комплекс НСП сетчатки лягушки мы будем называть трансдуцином лягушки.
Представленные нами результаты показывают, что связывание гуаниловых нуклеотидов препаратами НСП обусловлено их взаимодействием с 3V субъединицей, содержащей ГТФ-связывающий центр.Аналогичные выводы были сделаны относительно %с субъединицы транс-дуцина быка / Fung et al., 1981; Fung , 1983/.
Темноадаптированные НСП связывают ГДФ и практически не взаимодействуют с негидролизуемым аналогом ГТФ - ГВДФ; фотолиз родопсина потенцирует связывание ЩДФ, причем одна молекула обесцвеченного пигмента приводит к связыванию в наших экспериментальных условиях до 70 молекул ЩЦФ. В НСП сетчатки быка связывание достигает 70-500 моль ГВДФ на моль обесцвеченного родопсина /Fung, stryer , 1980; Fung et al. , 1981/. Совокупность этих данных демонстрирует хорошее согласие с требованием активации ин виво нескольких сот молекул ДЭ циклонуклеотидов при фотолизе одной моле- кулы родопсина В НСП /Yee , Liebman , 1978; Woodruff , Bownds , 1979/.
Нами показано, что потенцируемый фотолизированным родопсином обмен ГДФ на ГТФ в нуклеотидсвязывающих центрах НСП ( тк субъединица трансдуцина) не в состоянии обеспечить необходимую скорость формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка (т.е. комплексов Т^ ГТФ) из-за низкой скорости процесса обмена даже в экспериментальных условиях, способствующих его ускорению. Оценены некоторые характеристики процесса обмена гуанило-вых нуклеотидов в НСП сетчатки лягушки.
Эти результаты ставят под сомнение обменный механизм формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночного, предложенный в лаборатории Страйера / Fung, Stryer, 1980/ по аналогии с общепринятой моделью функционирования ГТФ-связывающих белков в других системах - рецепции гормонов и элонгации трансляции /cassel , Selinger , 1976; Kaziro , 1978; Pfeuffer , 1979/.
Экспериментально показано наличие в НСП сетчатки лягушки альтернативного обмену механизма, а именно, фосфорилирования ГДФ, связанного с а?^ субъединицей, до ГТФ в ГДФкиназной реакции. Полученные данные указывают на то, что эта реакция является свето-стимулируемой, что подчеркивает ее физиологическую значимость. Роль фосфотрансферазы выполняет, по-видимому, т> субъединица трансдуцина. Формирование активного состояния 0U субъединицы в реакции фосфорилирования по нашим данным может обеспечить требуемую скорость активации ЗЩЭ в НСП в ответ на свет.
Сопряжение ГТФазной активности т^ субъединицы трансдуцина (появляющейся в присутствии мембран дисков наружных сегментов, содержащих обесцвеченный родопсин) с ГДФкиназной активностью т^ и Tf, субъединиц проявляется в виде АТФазной активности. Эту активность можно зарегистрировать, по-видимому, только в том случае, если тЛ субъединица содержит связанный ГДФ. Такое сопряжение ферментативных активностей трансдуцина объясняет ранее известные факты гидролиза АТФ и ГТФ препаратами НСП и фракцией водорастворимых белков НСП /Ostwald , Heller, 1972; Thacher, 1978; Krapivinsky et al., 1980/. Нами обнаружен гидролиз трансдуцином АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ; причем К^ этих реакций более чем в 100 раз превышает K^j ГТФазной активности 0^( I мкМ) /Wheeler, Bitensky, 1977/.
Ферментативные активности трансдуцина: ГТФазная, ГДФкиназ- ная, НТФазная - модулируются ионами кальция в диапазоне концен-
7 -8 траций 10" -10 М, причем все типы реакций ингибируготея ионами
Са при повышении его концентрации более 5*10 М. Ряд косвенных данных, полученных нами, позволяет сделать предположение,что регуляция ионами кальция ферментативных активностей трансдуцина, по-видимому, обеспечивается % субъединицей, которая обладает
2+ способностью связывать Са , а действие этих ионов направлено на
ГТФазную активность с К менее I мкМ.
Есть основания полагать, что механизм формирования активного состояния ГТФ-связывающего белка в реакции трансфосфорилирова-ния является универсальным, поскольку в экспериментах, проведенных нами совместно с С.К.Смаиловым в лаборатории академика Спирина А.С. (Институт белка АН СССР, Цущино), было показано (1982г, данные не опубликованы) образование активных комплексов фактора элонгации прокариот ЕВЧЕ5ГТФ в результате фосфорилирования ГДФ, связанного с ер-Ти.
Полученные в диссертационной работе результаты могут быть использованы при исследовании систем, в функционировании которых принимают участие ГТФ-связывающие белки»
14 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Попытки экспериментального подтверждения кальций--медиаторной гипотезы Хагинса
Хагинсом с сотр. /Hagins et al., 1970; Yoshikami, Hagins , 2+ 1973/ было обнаружено, что повышение концентрации Са более I мМ во внеклеточной среде имитирует действие света, снижая амплитуда фотоиндуцированного ответа рецептора. Перфузия сетчатки лягушки р, р, Са -ЭГТА буфером в присутствии Са ионофора - антибиотика Х573А - приводит к обратному эффекту при концентрации свободно-го кальция менее 10 М /Hagins , Yoshikami, 1974/. Использование ионофора Х573А позволяет обнаружить блокирование проводимости р, _л для ионов натрия при более низких концентрациях Са ( 10 М), 2 2+ чем в его отсутствие (2 10 М Са ). Результат демонстрирует, что ионы кальция воздействуют на НСП с внутренней стороны цито-плазматической мембраны /Hagins , Yoshikami, 1974/. Инъекция кальция внутрь палочки сетчатки лягушки приводит к гиперполяризации мембраны фоторецепторной клетки, добавление ЭГТА дает обратный эффект - наблюдается деполяризация мембраны /Pintо et al. , 1977/. Изменение потенциала фоторецепторной клетки при варьировании концентрации кальция в среде происходит в течение секунд, этот эффект не связан с ингибированием Иа+,К+ -АТФазы, поскольку в присутствии оуабаина в течение некоторого времени (минуты и даже десятки минут) можно регистрировать фотоответ. Кроме того, повышение концентрации кальция в экстраклеточной среде замедляет падение темнового тока фоторецептора в присутствии оуабаина /Yoshikami , Hagins , 1973/, что также свидетельствует в пользу кальциевой гипотезы. Таким образом, предварительные данные, полученные при исследовании действия ионов кальция на цитоплазматическую мембрану фоторецептора, говорили в пользу того, что кальций действительно способен выполнять роль внутриклеточного медиатора в НСП, как было высказано в гипотезе Хагинса /Hagins , 1970,1972/.
Однако в дальнейшем были получены противоречивые данные о способности ионов кальция служить медиатором в НСП. Содержание ионов Са в НСП. Фотоиндуцированный дисбаланс ионов кальция. Интегральное количество кальция в НСП сетчатки лягушки и быка достаточно для того, чтобы концентрация в НСП ионов 2ч-Са составляла несколько мМ /fezuts , Cone , 1977; Schnetcamp , 1979/. Было показано, что препараты НСП и суспензии дисков НСП 2+ сетчатки лягушки содержат 0,1-0,2 моль Са на моль родопсина /Szuts , Cone , 1977/. На каждый диск приходится около 2 10 молекул Са ; если этот кальций локализован во внутридисковом пространстве в свободной форме, его концентрация составит около I мМ, эта оценка подтверждается рентгеновским микроанализом Aoshikami, Hagins , 1976/. Исследования связывания ионов Са препаратами дисков НСП сетчатки быка показывают, что при физиологических концентрациях кальция (1-2 мМ) связывание может достигать нескольких молей кальция на моль родопсина / Hendriks et al. , 1974; Mason et al. , 1974/. В этом случае концентрация кальция в дисках должна превышать концентрацию в экстраклеточной среде в несколько раз, однако полученные результаты не позволяют предполагать существование такой концентрации кальция в дисках ин виво /szuts , 1980/. Несмотря на достаточное количество кальция в НСП, попытки показать фотоиндуцированный дисбаланс ионов Са успеха не принесли. Наблюдаемый фотоиндуцированный дисбаланс меньше требуемого в 10-100 раз, что, однако, может быть следствием нефизиологических условий проведения экспериментов /Hendriks et al, 1977; Говардовский В.И., 1977; Kaupp et al. , 1979; Szuts , І980/.Шутс z&zuts , 1980/ методом изотопного замещения кальция в сетчатке лягушки показала, что даже при длительной (I час) инкубации сетчатки в растворе, содержащем л)а +, обменивается менее 0,01моль 2+ Са на моль родопсина, т.е. менее 10% всего кальция. Скорость обмена составляет менее 10 ионов в секунду через мембрану диска и не регулируется светом.
Эти данные по мнению автора ставят под р. сомнение Са -медиаторную гипотезу. В отличие от мембраны дисков, цитоплазматическая мембрана НСП позволяет более высокую проницаемость для ионов кальция /Szuts , 1980/, однако и в этом случае полученные результаты могут быть интерпретированы неодно- mi значно Aoshika, Hagins , 1978; Gold, Corenbrot, 1980/. В некоторых работах был обнаружен выход требуемого количества ионов кальция при фотолизе одной молекулы родопсина, однако позднее эти результаты не получили подтверждения /szuts , Cone, 1977; Yee , Liebman , 1978/. Критическое рассмотрение имеющихся в литературе данных и собственных результатов позволили Шуте /Szuts , I960/ сделать вывод о том, что хотя и нельзя исключить участия кальция в передаче сигнала через цитоплазму НСП, нет доказательств обевобожде- р. р, ния ионов Са из внутридискового пространства. Вероятно, Са находится в связанном состоянии в цитоплазме НСП или на внешней мембране дисков /Говардовский В.Л., Берман А.Л., 1977; Szuts , 1980/. Правомерность такой точки зрения основана на фактах низкой концентрации ионов кальция в темноадаптированных НСП /Hagins, Yoshikami, 1975; Caretta , Cavaggioni, 1976/ и высокого содержа- ния кальция в НСП /Szuts , Cone , 1977; Hendriks et al. , 1974; Schnetcamp , 1979/, а также существования в НСП мест связывания для Са2+ /Hendriks et al. , 1977/. Связывание и активный транспорт кальция в НСП. В диапазоне -5 б концентрации кальция в цитоплазме 10 -10 М препараты НСП и мембран дисков наружных сегментов способны связывать до 0,5 моль Са на моль родопсина /Bonting , Daemen , 1976/, при концентрации около I мМ связывание возрастает и достигает нескольких моль Са на МОЛЬ родопсина /Hemminky , 1975; Bonting , Daemen , 1976/. Как правило, фотолиз зрительного пигмента не приводит к изменению Са +-связывающей способности препаратов дисков НСП / Neuf eld et al. , 1972; Bonting , Daemen , 1976/, однако в одной из работ было обнаружено небольшое снижение связывания кальция препаратами ку НСП сетчатки быка при фотолизе в них родопсина / Hemmin, 1975/. 2+ Способность АТФ изменять уровень связывания Са препаратами мембран дисков или НСП была показана в ряде работ, однако трудно определить, на что действует АТФ: на аккумуляцию кальция или на центры его связывания. В лаборатории Этингоф Р.Н. продемонстрировано, что фосфолипиды мембран дисков наружных сегментов не обладают способностью связывать Са /Корчагин,П.В. и др., 1978/, что в совокупности с данными по связыванию кальция препаратами НСП и дисков НСП говорит о возможности существования спе- 2+ циального Са -связывающего компонента, ассоциированного с мембранами НСП.
Способность дисков НСП сетчатки быка аккумулировать Са + в присутствии АТФ была впервые продемонстрирована Нейфельдом с соавт. / Neufeld et al, 1972/, обнаружившими увеличение накопляющей способности мембран дисков НСП в 2-3 раза при низких концентрациях экзогенного кальция; аналогичные результаты получены для НСП сетчатки лягушки /Mason et al. , 1974/. Шнеткампу с со-авт. /schnetcamp et al. , 1977/ при исследовании препаратов НСП сетчатки быка, полученных в присутствии ЭГТА и лишенных большей доли Са , удалось продемонстрировать увеличение кальцийсвязыва-щей способности в несколько раз при добавлении в инкубационную систему І мМ АТФ, причем максимальный уровень связывания кальция в присутствии АТФ соответствовал уровню связывания препаратов, не подвергавшихся обработке ЭГТА. Авторами было предположено существование в НСП активного аккумулирования кальция (скорее всего дисками), зависящего от АТФ и ионов натрия, однако эксперименты по проверке этого предположения показали отсутствие АТФ-зави- 2+ симого накопления Са дисками /Szuts , 1980/. Ряд работ был посвящен исследованию гидролиза нуклеозидтри- фосфатов в предположении о существовании в НСП ферментативной 2+ системы, обеспечивающей транспорт ионов кальция. Са -зависимый гидролиз трифосфатов был продемонстрирован, но функциональное значение этого процесса для авторов осталось невыясненным /Ost-wald, Heller , 1972; Thacher , 1978; Biernhaum, Bownds , 1979; Krapivinsky et al. , 1980; Bownds , I960/ Например / Ostwald, Heller, 1972/, были получены данные о наличии в препаратах НСП сетчатки лягушки оуабаин-нечувствитель-ной частично светоактивируемой АТФазы, активность которой ЗаВИ-села от ионов Са и Mg .В присутствии Mg и 10 мМ Са удельная активность АТФазы составляла около 0,75 мкмоль на мг —4 2+ белка препарата в час, а при 10 М Са - 1,1 мкмоль; Н реакции авторы оценили в 0,4 мМ. Остается неясным функциональное значение и светоактивируемых АТФазной и ГТФ азной активностей, обнаруженных /Thacher , 1978/ в препаратах НСП сетчатки жабы и имеющих К реакций соответственно 30 и 210 мкМ.
Центрифугирование НСП в градиенте плотности сахарозы,
Для получения препарата ЩНС препарат НСП (в буфере I) подвергали центрифугированию при 140 000 s в течение 30 мин, осадок НСП суспендировали в растворе низкой ионной силы - буфере 2: I мМ трис-CI рН 7,6, 0,1% 2-меркаптоэтанола. Мембраны осаждали при 200 000 s в течение 30 мин. Процедуру повторяли 2-3 раза. Осадок ЩНС суспендировали в буфере 2 в конечной концентрации по родопсину около 5 мг/мл и хранили в светонепроницаемом контейнере при -20 С. Этот препарат использовали в течение 2-4 недель. 4. Получение препарата, обогащенного водорастворимыми белками НСП НСП, полученные после второй флотации в 40% растворе сахарозы (объем 0,3-0,5 мл) суспендировали в 5 мл буфера 2, гомогенизировали 20-30-кратным пропусканием через иглу для внутренних инъекций (0,2 мм), затем подвергали центрифугированию при 200 000 g в течение I часа. Супернатант (объемом 4,5 мл) обычно имел концентрацию белка 1,2-1,5 мг/мл. Содержание родопсина составляло не более 30 мкг/мл, повторное центрифугирование позволяло значительно снизить содержание родопсина (менее 10 мкг/мл). Для полного удаления ЩНС из супернатанта НСП, последний фильтровали через нитро-целлюлозные фильтры "Сынпор" 0,17 мкМ. Спектрофотометрически содержание родопсина в фильтрате определить не удавалось. 5. Центрифугирование НСП в градиенте плотности сахарозы Центрифугирование препарата НСП осуществляли в линейном градиенте плотности сахарозы (20-50% вес/объем) в течение двух часов при 140 000 g при 4-18С. Для этого НСП, полученные после первой флотации, суспендировали в 3 мл 10 или 60% сахарозы, приготовленной на буфере I, и наслаивали (или подслаивали на дно) на предварительно сформированный линейный градиент сахарозы. Фракционирование осуществляли через отверстие в дне пробирки, собирая фракции объемом 1-2 мл /Фесенко Е.Е., Орлов Н.Я., 1980/. 6.
Очистка комплекса белков НСП, обладающих светозависимой сорбцией на фоторецепторные мембраны Препарат очищенного трансдуцина получали по несколько модифицированному методу светозависимой сорбции / Kuhn, 1980 а/. 250 мкл НСП в концентрации по родопсину 40 мг/мл гомогенизировали в 8 мл среды, содержащей 5 мМ Трис-CI (рН 7,5), I мМ MgCl2H І мМ дитио-трейтола, полностью обесцвечивали (А 540 нм) в течение 30 с при 20 С, быстро охлаждали ( I мин) до 0С и центрифугировали при данной температуре при 24 000 g х 10 мин. Осадок промывали 8 мл о 5 мМ Трис-CI буфера (рН 7,6) при 0 С, а затем 8 мл 100 мМ Трис-С1 буфера (рН 7,6) при 20С, центрифугируя при 24 000 g х 15 мин. Для экстракции трансдуцина промытые НСП суспендировали в 4 мл 5 мМ Трис-CI буфера (рН 7,6), содержащего 40 мкМ ГТФ и I мМ дитиотрей-тола и центрифугировали при 200 000 gx I ч. Супернатант (объем 3 мл, концентрация по белку 100-150 мкг/мл) собирали и использовали в работе. 7. Термоденатурация препаратов НСП и супернатанта НСП Термоденатурацию образцов (НСП и супернатанта НСП) проводили в тонкостенной (0,2 мм) стеклянной пробирке,погруженной в термостат (точность поддерживаемой температуры +1С). Время термообработки составляло 5 мин. Контрольные эксперименты с использованием термопары для регистрации температуры показали, что время установле- ния заданной температуры в образце (объем 200-300 мкл) составляет 20-30 сек.
После термообработки образец переносили в ледяную баню. 8. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле. ( SDS -электрофорез) Для оценки кажущегося молекулярного веса белков применяли электрофорез по /Laemraly , 1970/ в 12% полиакриламидном геле. Разделяющий гель. Основной раствор содержал 30$ акриламид, 0,8% бисакриламид, 375 мМ трис-CI рН 8,8. Рабочий раствор готовили, разбавляя основной раствор раствором 375 мМ трис-CI, рН 8,8, содержащего 0,1% SDS . Для полимеризации акриламида добавляли персульфат аммония и ТЕМВД 75 мг и 150 мкл на 100 мл геля соответственно. Концентрирующий гель. Содержал 3% акриламид, 0,08% бисакрил-амида, 0,1% SDS и 125 мМ трис-CI рН 6,8. Электродный буфер (рН 8,3). Содержал 25 мМ трис-основание, 192 мМ глицина, 0,1% SDS . Препараты белков растворяли в буфере, содержащем 62,5 мМ трис-CI рН 6,8, 2$ SDS , 10% глицерина; 5% мер-каптозтанола и 0,001% брофенолового синего. Разделение проводили в блоке геля размером 140x150x2 мм в течение 6 часов при температуре 20С и токе 20 мА. Гельфиксировали в смеси: уксусная кис л о та-.метано л: вода в соотношении 7:50:43. Окраску проводили 0,25% раствором Кумасси G-250, приготовленном на фиксирующем растворе. Для определения кажущихся молекулярных весов (далее везде мы будем обозначать их просто молекулярные веса) разделяемых полипептидов супернатанта НСП в качестве белков-маркеров использовали РНК-полимеразу E.colr, имеющую субъединицы следующих молекуляр- к препарат РНК-полимеразы был любезно предоставлен нам сотрудником Института биологической физики к.б.н. Грумб ковой Л.0. ных весов:40, 90, 155 и 165 килодальтон (кД) /Ашмарин И.П.,1977/, а также белки скелетных мышц кролика : миозин, С-белок, Р -белок, легкие цепи миозина с молекулярным весом 200, 140, 80, 25, 17 и 15 кД соответственно. По результатам электрофоретического разделения белков-маркеров был построен график, по которому определяли молекулярный вес белков супернатанта НСП. 9. Электрофорез белков в неденатурирующих условиях Электрофорез белков проводили в ПААГе при рН 8,0, используя систему № 6 по /Маурер Г., 1971/. Основные растворы: 30% акриламид и 0,8% метиленбисакриламид; буфер "а": 6,85 г трис-основание, 48 мл Ін HCI на 100 мл раствора, рН 7,5; буфер "б": 4,95 г трис-основание, 39 мл НдРО на 100 мл раствора, рН 5,5. Электродный буфер содержал I г триса и 5,52 г веронала на I л раствора, рН 7,8. Концентрирующий гель содержал 3 мл буфера "б", 2,4 мл раствора персульфата аммония (15 мг/мл), 17 мл воды и 50 мкл ТЕМЦЦ. Разделяющий гель (10%) содержал б мл буфера "а", 2,5 мл персульфата аммония, 23;5 мл воды и 50 мкл ТЕЩ. Разделение проводили в блоке геля размером 150x140x2 мм при постоянном напряжении 120-150 В в течение 4-6 часов при 4С.
После разделения от блока отрезали полосы шириной 10 мм в направлении, параллельном направлению разделения, окрашивали их Кумасси G -250 и денситометрировали. Для элюции белков гель разрезали на полосы 2x2x140 перпендикулярно направлению разделения и заливали их 0,5 мл І мМ трис-С1, рН 7,5. Операции вели на холоде в течение 12-24 часов. Элюат ис- х препараты белков скелетных мышц были любезно предоставлены нам сотрудников ИБФ АН СССР Орловой А.А. пользовали для определения ферментативных активностей. Используемый метод позволял экстрагировать до 30-40% белка из 10% геля. 10. Разделение водорастворимых белков супернатанта НСП методом гель-фильтрации на Сефакрил S -200 Гель-фильтрацию препаратов супернатанта проводили на колонках размером 42 х 0,9 см и 93 х 1,5 см в буфере 3, содержащем 10 мМ трис-CI, рН 7,6 100 мМ KCI, 0,1 мМ ДТТ, 5 мМ MgCl2 при 0 С. Образец (1,5-2,5 мг белка в 1,5-1,0 мл) наносили в 10% растворе сахарозы, приготовленном на буфере 3. Элюцию осуществляли со скоростью 20 мл в час, собирая фракции объемом 1-2 мл. Колонку предварительно калибровали, раздельно используя каталазу (250 кД), бычий сывороточный альбумин (67 кД), гемоглобин (65кД), овальбумин (42 кД) и цитохром (13 кД). Исключенный объем определяли с декстраном голубым. На рис.7 (стр. 71 ) представлен калибровочный график для колонки 93 х 1,5 см. 11. Изоэлектрофокусирование белков в амфолинах Изоэлектрофокусирование белков супернатанта проводили в амфолинах с диапазоном рН от 3,5 до 9,5, используя поддерживающий градиент сахарозы 20-60% (вес/объем) /Орлов Н.Я., 1976/. Разделение вели в присутствии 0,5% амфолинов в течение 12-18 часов при 0С и токе 1,0-1,5 мА. Защитные слои содержали: тяжелый -0,3 М H-jPO в 60% сахарозе, легкий - 0,3 М НаОНв 15% сахарозе. Образец (2,0-2,5 мг белка в 2-2,5 мл) вносили в один из сосудов прибора для формирования линейного градиента сахарозы (60-20% вес/объем). После разделения собирали фракции объемом 2 мл, измеряли рН фракции и доводили рН до 7,6, фракции использовали для определения ферментативных активностей. Контрольный эксперимент по изоэлектрофокусированию бычьего гемоглобина дал удовлетвори
Шосфорилирование /14о/ ГДІ, связанного с нуклеотид-связывающими центрами НСП
Шосфорилирование /14о/ ГДІ, связанного с нуклеотид-связывающими центрами НСП
Препарат НСП после второй флотации в сахарозе (см. метод получения НСП) супендировали в буфере 50 мМ трис-СІ, рН 7,6, ЮОмМ NaCl, 5 мМ MgCl2 , 2,5 мМ ЭГТА до концентрации по родопсину 0,1 мг/мл, что соответствует, по нашим оценкам, концентрации нук-леотидсвязывающих центров около 1-1,5 мкМ. Препарат обесцвечивали до начала опыта (не менее 1% по родопсину) и в течение 15-20 минут преинкубировали с I мкМ г лЛГДФ. Объем пробы составлял 200-400 мкл. Затем в инкубационную смесь добавляли АТФ до конечной концентрации 50 мкМ, перемешивали в течение 3-5 с и немедлен- но начинали отбор проб объемом 20 мкл. Реакцию останавливали добавлением отобранной пробы к 80 мкл охлажденного 70% этанола. Далее центрифугированием отделяли денатурированный белок и супер-натант упаривали до объема 10-15 мкл. Супернатант содержал не менее 90% радиоактивности. Каждую пробу наносили на 2-3 пятна (диаметром 1-1,5 мм) на пластинку Silufol W -254. Разделение нук-леотидов проводили методом тонкослойной хроматографии. После разделения продуктов реакции пластины радиоавтографировали в течение 3-Ю суток, используя пленки "Kodak"(США) или Ш-І (СССР). После проявления радиоавтографы денситометрировали. Количественное определение синтезированного X ГТ проводили методом взвешивания пиков денситограммы. 17. Определение аденилаткиназной (Ш 2.7.4.3) активности При определении активности реакционная среда содержали 50 мМ Трис-CI буфер (рН 7,6), 2 мМ MgCl2, 0,1 мМ СаС12, 2 мМ ДЦР и 10-100 мкл исследуемого препарата. В некоторых опытах кон- + 2+ центрацию Са варьировали с помощью Са -ЭГТА буфера. Инкубацию вели в течение 0,1-12 ч при 20С.
Условия выбирали таким образом, чтобы скорость ферментативной реакции была постоянна в течение всего времени инкубации. Уровень АТР, образовавшегося в ходе реакции, измеряли с помощью гексокиназно-глюкозо-6-фосфатдегидро-геназного теста /Mourad, Parks , 1973/, определяя скорость образования НАДШ по увеличению поглощения при 340 нм. Среда (I мл), используемая при определении концентрации АТР в пробах, содержала 50 мМ трис-CI буфер (рН 7,6), 10 мМ Са - ЭГТА буфер (рСа2+ 4,4), 10 мМ KCI, Ь мМ 1 I мМ глюкозу, 0,1-0,2 мМ NADP , 0,1 мкг гексокиназы ("Serva "), 2-3 мкг глюкозо-6-фосфатдегидро-геназы " Calbiochera" и 25-200 мкл исследуемогдпрепарата. Обычно определение АК активности проводили при комнатном освещении, в некоторых опытах описанные выше операции были выполнены при слабом красном свете (Х 670 нм). 18. Измерение гуанозиндифосфаткиназной (КФ 2.7.4.6) активности ГДФкиназную активность измеряли радиоизотопным методом /Parks , Agarwal , 1973/ при 20С. Реакционная смесь (объем 8-20 мкл) содержала 50 мМ Трис-GI буфер, рН 7,6, 5 мМ MgCl2 , 0,1 мМ СаС12 , 0,2-0,5 мМ ГДФ, 1-2 мМ fc32P] АТФ (50-100 мКи/ ммоль, "Amersham", Англия) и 2-Ю мкл исследуемого препарата. В ряде экспериментов концентрацию свободного Са в реакционной среде варьировали с помощью Са-ЭГТА буфера. Количество образовавшегося f Р] ГТФ определяли в результате разделения нуклеотидов методом тонкослойной хроматографии, радиоавтографии плстин и последующего денситометрирования радиоавтографов. В выбранных экспериментальных условиях скорость реакции оставалась постоянной в течение всего времени инкубации СО,1-6 ч). Спектральные измерения были выполнены на спектрофотометре "specord UV-VIS " (ГДР).
Гели и радиоавтографы денситометрировали на микроденситометре "Joyce Loebl " (Англия). 19. Методы измерения нуклеозидтрифосфатазных активностей Гидролиз связанного U-4PJ г;щ проводили в среде (20 мкл), содержащей 50 мМ трис-CI, рН 7,6, 3 мМ MgCl2 , 0,3 мкМ (У3%1ГТФ, 10 мМ Са-ЭГТА буфера, 10-100 мкг белка НСП. Анализ продуктов реакции проводили методом ТСХ. Гидролитическую активность препаратов НСП и супернатанта измеряли в среде 20-50 мМ трис-CI, рН 7,6, 3 мМ MgCl2, 1-2 мМ НТФ, 10 мМ Са-ЭГТА буфера в течение 20-60 мин при 20С в зависимости от количества белка в пробе. При использовании [ Р] меченых нук- леозидтрифосфатов гидролиз оценивали после разделения продуктов реакции методом ТСХ. Гидролиз НТФ измеряли также по образованию неорганического ортофосфата Ф , который при взаимодействии с молибденовокислым аммонием в кислых условиях приводит к образованию окрашенного раствора молибденовой сини; использовали методику, предложенную / Bonting, 1971/. Реакцию останавливали добавлением равного объема 10% охлажденной ТХУ, выдерживали 10-15 мин в ледяной бане и центрифугировали в течение 10 мин при 15 000 на холоду. Супер-натант окрашивали добавлением равного объема 1% раствора молибда-та аммония в 1,15 н H2S04, содержащего 40 мг/мл FeSO . Оптическую плотность образцов измеряли через два часа при 700 нм. 20» Определение концентрации белка Концентрацию белка определяли по методу Лоури и соавт. / Lowry et al., 1951/ или по величине оптической плотности раствора белка при 280 нм. В первой части работы нами была поставлена задача обнаружения ГТФ-связывающего белка НСП, существование которого можно было предположить на основании имеющихся литературных данных /God-chaux , Zimmerman , 1979; Shinozawa et alt , 1979; РоЪег , Bit en-sky, 1979/. I. Зависимость связывания Г3Н]ЩЩБ препаратами НСП от количества обесцвеченного родопсина. Как было выяснено в первых опытах, препараты НСП сетчатки лягушки обладают способностью связывать гуаниловые нуклеотиды (обычно использовали [3Н]ЩЦФ и [ иІГДФ). Уровень связывания 13НЗГИДФ светоадаптированными препаратами НСП составлял 25-28 ммолей нуклеотида на моль зрительного пигмента. Связывающая способность темноадаптированных препаратов НСП ниже в 20-30 раз. На рисунке 8 (стр.81 ) представлена типичная зависимость связывания 13Н]ГВД от количества обесцвеченного родопсина в препарате: уровень связывания (3Н]ЩЦФ, величина которого составляет 0,025-0,028 моль нуклеотида на моль зрительного пигмента, может быть достигнут при фотолизе 0,03-0,1% родопсина в образцах. Вычитая из 0,028 уровень связывания 13Н]ЩДФ темноадаптированными препаратами (0,003 моль нуклеотида на моль родопсина), получаем, что около 0,025 моль связывается при фотолизе 0,0003 моль родопсина, или более 70 молекул [3Н1ГЙДФ способно связываться нуклеотидсвязывающими центрами НСП при фотолизе одной молекулы родопсина. Полученный результат находится в принципиальном согласии с данными, полученными при исследовании РНІГЦЦФ связывающей способности препаратов НСП сетчатки быка (70 моль ГВДФ на моль родопсина) /Fung et al. , 1981; Fung, Stryer, 1980/, концентрации (0,43 мкМ) и времени инкубации (20 мин).
Связывание [3Н]ЩЦФ препаратами мембран дисков наружных сегментов (МДНС) было менее одного ммоля на моль зрительного пигмента как в обесцвеченных, так и в темноадаптированных препаратах ВДНС. Добавление к светоадаптированным препаратам ЩНС супернатанта, содержащего водорастворимые компоненты НСП, увеличивало способность таких препаратов связывать їн] ЩЦФ. Уровень связывания нуклеотида в образцах, содержащих стандартное количество ЩЩ0 (100 мкгго зрительному пигменту) и различное количество супернатанта (10-50 мкг по белку) был прямо пропорционален количеству добавленного супернатанта (рис.9, стр.82). Из представленного рисунка следует, что один мкг добавленного белка приводит к связыванию 4,6 пкмоль f н] ЩЦФ. Далее мы попытались определить, какой из водорастворимых белков НСП участвует в процессах связывания Г HJ ЩЦФ. Для этого мы предприняли попытку разделить компоненты супернатанта с помощью различных методов: SDS-электрофореза в ПААГе, изоэлектро-фокусирования в амфолинах, методами светозависимой сорбции белков НСП на ВДНС и гель-фильтрации на Sephacryl S-200. 2. SDS-электрофорез в ПААГе белков супернатанта НСП. На рисунке 10 (стр. S3 ) представлены результаты электрофоретическо-го разделения белков супернатанта НСП, полученных при гипоосмоти-ческом шоке НСП (см.Методы и рис.5). На представленных фотографиях и денситограмме видно, что максимальное количество белка в супернатанте приходится на долю полипептидов с молекулярным весом около 39 и 36 килодальтон (кД). Процентное содержание каждой белковой фракции, оцененное по результатам трех независимых электро-
Термоинактивация АК, ГДФкиназной активностей и ЩЦФ--связывающей способности препаратов супернатанта НСП.
На рис.30 (стр.126 ) представлена зависимость АК, ГДФкиназной активностей от температуры преинкубации препаратов супернатанта. Полуденатурация ГДФкиназной активности наблюдается при температуре 53-55С, в то же время АК активность стабильна вплоть до 100С. Полную инактивацию АК активности наблюдали только после прогревания супернатанта в течение не менее 20 мин при 100С. В параллельных опытах контролировали способность термообработан-ных образцов супернатанта связывать негидролизуемый аналог ГТФ в присутствии обесцвеченных ВДНС. Совпадение температур полуденатурации ГДФкиназной активности и ГИДФ-связывающей способности свидетельствуют о зависимости ГДФкиназной активности от состояния нуклеотидсвязывающего центра Т субъединицы трансдуцина. 5. Светозависимость ГДФкиназной активности Последний вывод предыдущего раздела подтверждается также результатами Главы 3 о фосфорилировании связанного ГДФ. Реакция не происходит в отсутствие обесцвеченного родопсина, хотя центры свя- зывания содержат связанный ГДФ. Фотолиз всего 1% родопсина в образце ведет к фосфорилированию ГДФ до ГТФ (рис.22), демонстрируя тем самым функциональную значимость ГДФкиназной реакции. Таким образом, аденилаткиназная и ГДФкиназная активности трансдуцина могут обеспечить формирование его активного состояния Т ГТФ. На их функциональную значимость указывают данные о том, что (I) АК и ГДФкиназные реакции кат&чизируют белки "комплекса Кюна", т.е. трансдуцин;(2) АК в меньшей степени, а ГДФки-назная активность в большей, зависят от обесцвеченных ЩЩС, что является необходимым свойством фосфотрансферазы, переводящей Т в активное ( Ш ГТФ) состояние. ГЛАВА 5. НУКЛЕ03ЦЦТРШ0СФАТАЗНЫЕ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ НСП Экспериментальные результаты, представленные в обзоре литературы, показывают наличие различных нуклеозидтрифосфатазных активностей, катализируемых препаратами НСП сетчаток быка и лягушки.
Основное внимание исследователей было направлено на те актив-ности, которые регулировались светом или ионами Са . Было обнаружено, что НСП сетчатки лягушки обладают 2-мя типами ГТФазных активностей Кщ менее I мкМ /Wheeler , Bitensky , 1977; Wheeler, 1977/ и с Код в диапазоне десятков сотен мкМ /Wheeler , Bitensky , 1977; Bignetty et al. , 1979; Ostwald , Heller, 1972/. Было показано, что ГТШазная активность с % менее одного мкМ связана с водорастворимыми белками НСП /Godchaux , Zimmerman, 1979; Shinozawa , et al. , I979;Shinozawa , Bitensky , 1980; Kuhn , 1980 а,Ъ/ и принимает участие в дезактивации ЗЩЕ. ГТФазная активность с более низким сродством к ГТФ (в 100-1000 раз) /Wheeler et al. , 1977; Thac her , 1978 /, а также АТФазная активность с 1 30-400 мкМ /Thacher , 1978; Ostwald , Heller , 1972/, несомненно присутствующие в НСП, остаются до сих пор неидентифицированными. Эксперименты, представленные в этой главе, позволяют высказать предположение, что эти активности связаны с трансдуцином. I. Гидролиз ГТФ при низких (менее I мкМ) концентрациях. Результаты, представленные в I главе, показывают, чтоГВДФ связывается с препаратом НСП в течение 10-15 минут. Это связано с занятостью центров связывания ( а? ) эндогенным ГДФ / Godchaux , Zimmerman , 1979/.
Однако при использовании реконструированных препаратов НСП (МДНС+супернатант) время связывания ГВДФ составляет менее 10-15 сек. Естественно предположить, что при использовании приготовленных таким образом препаратов, связывание ГТФ также будет происходить за время 10-15 сек. Действительно, реконструированные препараты связывают ГТФ (0,3 мкМ) за это время, что можно зарегистрировать по образованию ГДШ или Ф . Более подробно этот вопрос будет изложен в главе 6. В случае, когда центры ( Т ) сожержат эндогенный ГДФ, то скорость гидролиза будет лимитироваться медленной скоростью его диссоциации. В пользу такой точки зрения говорят результаты,представленные на рис.31 (стр. 129). В данном опыте использовали препараты темноадаптированных НСП, в нулевой момент времени к которым добавлялиU- Р] ГТФ (0,3 мкМ). Разделение продуктов реакции вели методом ТСХ. Частичный гидролиз ГТФ, по-видимому, связан с наличием в препарате обесцвеченных молекул родопсина. Фотолиз 1% родопсина приводит к ускорению гидролиза добавленного ГТФ. Кинетика гидролиза ГТФ подобна кинетике диссоциации ГДФ в светоадап-тированных препаратах НСП (рис.20, стр.101 ) или ассоциации ЩЦФ (рис.17, стр.98 ). Можно ожидать, что скорость гидролиза ГТФ лимитируется диссоциацией ГДФ, образующегося в реакции. В этом слу- чае скорость реакции будет пропорциональна: дисс.и ІД Используя значение к , полученное нами при исследовании скорости процесса диссоциации ГДФ (табл.3, стр. 102 ), можно оценить скорость гидролиза. При концентрации ГТФ 0}5 мкМ и при условии, что он находится в связанном состоянии (т.е. в виде Т ГТФ), удельная ГТФазная активность составит (в пересчете на трансдуцин 80 кД) 15 нмоль на мг в мин при 20С. Имеющиеся в литературе данные /Wheeler , 1977; Shinozaw Bitensky , 1980/ по ГТФазной активности (светозависимой) при пересчете на мг трансдуцина хорошо согласуются с полученной оценкой при концентрации кальция Ю"5-Ю"6 М. При понижении концентрации свободных ионов скорость гидролиза увеличивается. Этот факт будет обсужден в б главе. 2. Сопряженные ферментативные реакции в НСП Поскольку, согласно нашим данным, активное состояние трансдуцина (Т ГТФ) может быть образовано за счет фосфорилирования связанного ГДФ ( Т ГДФ — Т/ГТФ ) в ГДФкиназной реакции: Т/ГДФ + А1Ф — Т ГТФ + АДФ (I) а ГТФ, связанный с I , при фотолизе родопсина гидролизуется до ГДФ и Фн: Т/ГТФ — Т/ГДФ + Фн (2) то суммарная реакция будет выглядеть как АТФазная (1)+(2): АТФ —АДФ + Ф„. н Существенньм свойством этой АТФазной активности является наличие ГДФ, связанного с тл. Кроме того, за утилизацию макроэргическо- го $-фосфата АТФ отвечает, согласно нашим данным тл , способная катализировать аденилаткиназную реакцию. Известно, что нуклеозид-монофосфаткиназы (НМФК) и нуклеозидаифосфаткиназы (ЦЦФК) не являются строго специфичными по донору макроэргического фосфата /Parks , Agarwall, 1973/. В этом случае АТФазная активность препаратов может гидролизовать не только АТФ, но и другие нуклеозид-трифосфаты. 3. Нуклеозидтрифосфатазные активности НСП. Добавление АТФ (1-1,5 мМ) к препарату НСП приводит его к гидролизу и образованию АДФ и Ф со скоростью около 1,5-10 нмоль на мг белка препарата НСП в мин при 20С.
С несколько меньшей скоростью протекал гидролиз УТФ и ЦТФ - 0,5-5 нмоль на мг белка НСП в мин. С наибольшей скоростью гидролизовался ГТФ - 20 нмоль в мин при 20С. Скорость гидролиза ГТФ, полученная нами, лежит в том же диапазоне, что и скорость гидролиза ГТФ, измеренная /Wheeler , Bitensky , 1977/ для ГТФазы с К около 90 мкМ. Гидролиз АТФ можно было увеличить, если к препарату НСП добавить ГДФ (1,0-10,0 мкМ, рис.40, стр. 146 ), что может быть объяснено связыванием ГДФ с Т субъединицей трансдуцина. Добавление олигомицина и оуабаина к высокоочищенным препаратам НСП (Агюг/ %00 = " не влиял0 на АТФазную активность. Как уже было отмечено, ГТФ гидролизовался с максимальной скоростью, поэтому часть работы была выпполнена при измерении гидролиза ГТФ. Фракционирование препарата НСП показало, что ГТФ-азная активность может быть отделена от ЬЩНС при гипотоническом шоке НСП и может составлять до 160 нмоль на мг белка супернатанта НСП в мин. Оценку констант Михаэлиса реакций гидролиза нуклеозидтрифос-фатов проводили с использованием преобразования зависимости ско-
