Введение к работе
Актуальность проблемы. Наружный сегмент палочки (НСП) сетчатки позвоночных - специализированный отдел фоторецепторной клетки, трансформирующий световое возбуждение в электрический сигнал. Он состоит из стопки замкнутых мембранных структур - дисков, окруженных плазматической мембраной. Диски содержат первичный и единственный акцептор видимого света в зрительной системе мембранный белок родопсин (R), а генератором выходного электрического сигнала является плазматическая мембрана. Активация всего лишь одной молекулы R из 107-10' молекул зрительного пигмента, присутствующих в НСП, ведет к появлению ответа, амплитуда которого составляет 3-5% от максимальной [Baylor et al., 1979]. Это означает, что in vivo система функционирует как счетчик одиночных фотонов, а в НСП локализован молекулярный усилитель, обладающий предельно высокой чувствительностью, огромньм коэффициентом усиления, предельно низким уровнем собственных шумов и высоким быстродействием - длительность ответа на поглощение одиночного фотона лежит в секундном диапазоне времен [Baylor et al., 1979].
Вопрос о том, как построен и функционирует такой усилитель, несомненно, актуален. Он был и продолжает оставаться предметом тысяч исследований последних десятилетий. Столь пристальный интерес к этой проблеме оказался оправданным. Действительно, в результате многолетних усилий стали ясны общие принципы построения системы зрительной трансдукции. Более того, стало очевидным, что эти принципы носят универсальный характер, а сама фоторецепторная система является одним из наиболее совершенных примеров систем клеточной трансдукции, аккумулируя в себе предельные свойства таких систем. Стало также очевидным, что система фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки является простой и удобной экспериментальной моделью для изучения общих принципов высококачественной переработки информации в живых системах. Все это определяло и продолжает определять актуальность проблемы. Это показывает, что проблема носит общебиологический характер, а ее актуальность далеко выходит за рамки актуальности вопросов, непосредственно связанных с пониманием принципов работы сенсорных систем.
Настоящая работа имеет прямое отношение к поиску и всестороннему изучению ключевых элементов системы фототрансдукции палочек и колбочек сетчатки позвоночных. Она непосредственно связана с исследованием механизмов функционирования этих элементов и принципов работы системы фототрансдукции в целом. Все это определяет как актуальность выбранного направления исследований в целом, так и актуальность и важность конкретных задач, решаемых в ходе работы.
Цели и задачи исследования. 1) Началу современного этапа формирования представлений о механизме работы фоторецептора положила появившаяся в 70-х годах так называемая Са2+-медиаторная гипотеза Хэггинса [Hagins et al., 1970; Hagins,1972]. Гипотеза постулировала, что в НСП должен присутствовать медиатор - т.е. вещество или система веществ, передающих информацию через цитоплазму от мембран дисков на плазматическую мембрану диффузионным путем [Baylor, Fuortes, 1970; Hagins, 1972; Cone, 1973]. Основываясь на ряде косвенных данных, Хэгтинс предположил, что роль медиатора играют ионы Са2+, а фотоактивированный родопсин (R*) выполняет роль ионного канала, обеспечивающего выход ионов Са2+ из внутридискового пространства. Изменение концентрации Са2+в цитоплазме, в свою очередь, ведет к изменению режима работы проводящих элементов плазматической мембраны НСП. Один из ключевых постулатов гипотезы состоял в том, что молекула R* должна приводит к выходу значительного количества ионов Са2+ из диска. Простота и изящество этой гипотезы
привлекла внимание к ней многих исследователей, а ее всесторонний анализ был предметом большого количества работ в течение ряда лет. Однако несмотря на все усилия подтвердить основной постулат этой гипотезы и зарегистрировать выход значительного количества ионов Са2+ в ответ на активацию одной молекулы R не удалось. Наши собственные исследования осмотического поведения различных типов фоторецепторных мембран, показали, что фотолиз молекулы R ведет к трансмембранному переносу не более одного иона [Гаспарян и соавт., 1980; Орлов и соавт., 1977; 1980]. Эксперименты по исследованию регуляторных характеристик каналообразующих структур плазматической мембраны НСП на ИЛМ не подтвердили предположения о регуляторной роли ионов кальция [Гаспарян и соавт., 1979, 1982; Фесенко и соавт., 1981]. Стало очевидным, что ионы Са2+, хотя и играют определенную роль в работе фоторецептора, вряд ли могут претендовать на роль первичного медиатора в акте фоторецепции.
Альтернативная точка зрения на природу медиатора в акте фоторецепции была стимулирована открытием сАМР и его роли как медиатора в процессах регуляции активности клеток внеклеточными гормонами. Попытки найти подобную систему в фоторецепторах [Bitensky et а]., 1971; Miller et al., 1972] привели к открытию в НСП cGMP-специфичной фосфодиэстеразы (PDE), активирующейся при обесцвечивании незначительных количеств родопсина [Pannbacker et al., 1972; Pannbacker, 1974; Bitensky et al., 1972; 1973,1975; Miki et al., 1975; Pober, Bitensky, 1979; Keirns et al., 1975]. Необычно высокое содержание PDE в НСП и ее огромная каталитическая активность делали ее потенциально способной быстро и значительно изменить концентрацию предполагаемого медиатора, в данном случае cGMP, в цитоплазме в ответ на свет. Несмотря на противоречивость данных о содержании cGMP в фоторецепторах и его концентрационных изменениях в ответ на свет, результаты экспериментов по электрофоретической инъекции этого соединения в НСП [Miller, Nicol, 1979, 1981; Miller, 1982] заставляли серьезно относится к cGMP как первичному медиатору в акте фоторецепции. В нашей лаборатории методом внутриклеточного диализа было показано, что cGMP увеличивает проводимость плазматической мембраны НСП [Куркин, Фесенко, 1982]. Кроме того, стало ясно, что длительность ответа палочек на одиночный фотон достаточно велика и потому вполне может быть обеспечена функционированием некой ферментативной системы.
Веский аргумент в пользу того, что PDE является ключевым ферментом системы фототранедукции палочек, был получен в 1978 г в результате исследований Ии и Либмана [Yee, Liebman, 1978]. Было показано, что при низких уровнях облучения активация одной молекулы родопсина в НСП ведет к активации значительного количества (до 500) молекул PDE. Таким образом, был впервые обнаружен процесс, который потенциально мог бы обеспечить усиление зрительного стимула. Эти результаты делали принципиально интересным вопрос о том, каким же образом одна молекула родопсина способна активировать значительное количество молекул PDE? Поиску ответа на этот вопрос и посвящена первая часть нашей работы.
Выполненные нами предварительные оценки, основанные на данных о диффузионной подвижности родопсина в мембране и концентрации PDE на поверхности диска, показывали, что сам R не способен взаимодействовать с требуемым количеством молекул PDE. Выходом из этого положения могло быть предположение о наличие посредника в процессе активации PDE родопсином. Такой посредник должен удовлетворять ряду условий. Он должен обладать высокой диффузионной подвижностью, присутствовать на поверхности диска в значительной концентрации и, что принципиально важно, быть способным запоминать кратковременное взаимодействие с R* на время, достаточное для переноса этой информации на молекулы PDE и их активацию в в течение относительно длительного времени. Иными словами, такой посредник должен обладать
неким аналогом памяти. Анализ литературных данных, несмотря на их ограниченность, показывал, что таким посредником мог бы быть GTP-связывающий белок.
Предположение о возможности функционирования таких белков в процессе передачи возбуждения от рецепторов гормонов на каталитическую субъединицу аденилатциклазы, стимулированное открытием необходимости участия GTP в этом процессе [Rodbell et al., 1971], активно рассматривалось исследователями, работающими в этой области [Rodbell, 1980; Cassel, Selinger, 1977; 1978; 1980; Blume, Foster, 1976]. В 1977 году было также показано, что GTP является необходимым участником процесса фотоактивации PDE и в фоторецепторах [Wheeler et al., 1977; Wheeler, Bitensky, 1977]. Совокупность этих данных и предположений и явилось для нас основанием для поиска GTP-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночных. Поиск GTP-связывающего белка в НСП сетчатки позвоночных и всестороннее исследование его механизмов активации и регуляции и явилось одной из основных целей настоящей работы.
Решение этой задачи облегчалась результатами наших предыдущих исследований. Разработка установки импульсного фотолиза с источником света микросекундной длительности, работающей в широком диапазоне температур [Фесенко и соавт, 1971 ;1972 а,б] позволило выполнить детальные исследования кинетики перехода прелюмиродопсин-люмиродопсин и показать, что кинетика этого процесса хорошо описывается суммой трех параллельных реакций первого порядка [Фесенко и соавт., 1972; 1973]. Исследуя причины сложности кинетики распада ранних промежуточных продуктов фотолиза родопсина, мы предположили, что одной из них может быть взаимодействие родопсина с какими-либо белковыми компонентами НСП [Фесенко, Орлов, 1977]. В пользу такого предположения свидетельствовали и результаты анализа детергентных препаратов родопсина методом изоэлектрофокусирования (IEF) [Орлов и соавт., 1977]. Последующая модификация процедуры получения НСП и их экстракции, а также применение для анализа экстрактов метода высокоразрешающего электрофореза (SDS-PAGE) [Laemmli, 1970; Фесенко и соавт., 1980; Гулак и соавт., 1984; Gulak et al., 1984] показала, что НСП содержат полипептиды, концентрация которых в НСП очень велика (5-10% от концентрации R). Таким образом, к начале работы по поиску GTP-связывающего белка мы имели данные, указывающие на то, что в НСП присутствуют белковые компоненты в количестве достаточном для того, чтобы играть роль активатора PDE.
2) К началу следующего этапа наших исследований было ясно, что cGMP-специфичная
PDE НСП - сложный мультисубъединичный фермент, относящийся к подсемейству
циклонуклеотид-зависимых, циклонуклеотид-специфичных фосфодиэстераз, но
отличающийся от них огромной каталитической активностью в присутствии GTP-
связывающего белка НСП трансдуцина (Gt) и наличием ингибиторной субъединицы,
плотно связанной с каталитической частью и потому обеспечивающего предельно низкую
активность PDE в темновых палочках. В связи с этим исследование механизма активации
PDE трансдуцином и ее регуляции имели принципиальный интерес. В нашей работе
решались вопросы, имеющие отношение к (1) механизму ее активации трансдуцином, (2)
природе ее связи с фоторецепторной мембраной и (3) регуляции ее базальной активности.
3) Хотя ионы Са2+ и не играют роль первичного медиатора, но принимают участие в
регуляции параметров электрического ответа НСП. В связи с этим одной из целей
настоящей работы являлся поиск Са2+-связывающих белков, которые могли бы
опосредовать действие ионов Са2+, а также поиск белков, которые являются мишенями
для таких Са2+-связывающих белков, например, кальмодулина.
-
Несмотря на успехи, достигнутые в изучении системы фототрансдукции палочек, принципы построения системы фототрансдукции колбочек долгое время оставались неясными. Характеристики колбочек не исключали возможности того, что роль медиатора в колбочках играют ионы Са2+. В связи с этим в нашей работе была предпринята попытка выяснить принципы построения системы фототрансдукции колбочек. Объектом исследования являлись сетчатки суслика, основное количество зрительных клеток которого представлено колбочками.
-
Система фототрансдукции НСП является одной из немногих систем, для которой можно достаточно точно определить скорость активации GTP-связывающего белка (в данном случае, Gt) в присутствии эндогенного активатора (в данном случае, R*). В связи с этим одной из задач работы являлась попытка определить, способен ли известный механизм активации GTP-связывающих белков - обмен связанного GDP на свободный GTP (GDP/GTP обмен)- обеспечить требуемую скорость активации Gt в НСП. Для этого с помощью различных методов и подходов мы пытались определить скорость диссоциации GDP из активного центра трансдуцина в присутствии R*. Одновременно были предприняты попытки (1) выяснить возможность активации Gt в результате индуцируемого молекулой R* фосфорилирования связанного GDP до GTP и (2) определить природу компонента, способного осуществить такую реакцию.
-
В ходе исследований мы обнаружили, что нуклеозиддифосфаткиназа (NDP киназа) НСП сетчатки быка взаимодействует с родопсин-трансдуциновым комплексом (R*Gt комлекс). В связи с этим одной из задач работы было детальное исследование характеристик этого взаимодействия. Исследования выполняли, используя как NDP киназу НСП сетчатки быка, так и рекомбинантные а И Р изоформы NDP киназы крысы и их генноинженерные производные. Согласно современным представлениям, NDP киназа-мультифункциональный белок, играющий важную роль в многочисленных регуляторных процессах в клетке в норме и патологии, причем функциональная роль его изоформ различна. В связи с этим одной из задач работы явилось исследование рекомбинантных а и Р изоформ NDP киназы и их производных физико-химическими методами (в частности, методом собственной белковой флуоресценции и методом остаточной ферментативной активности) для того, чтобы определить ключевую физическую основу различий изоформ, определяющих (а) различие их характеристик как белков, и как следствие, (б) различие их функциональных ролей в клетке.
Научная новизна. В НСП сетчатки лягушки обнаружен гетеротримерный GTP-связывающий белковый комплекс (транедуцин, Gt), молярная концентрация которого в НСП составляет 5-7% от концентрации R. Центр связывания GTP принадлежит его а субъединице. При малых уровнях фотолиза молекула R* индуцирует образование значительного количества молекул Gt-GTP. Это означает, что Gt может обеспечивать первичное усиление зрительного стимула и быть посредником в процессе передачи информации от молекулы R* на молекулы PDE.
Выполнен анализ гипотезы, согласно которой активное состояние транедуцина (Gt-GTP) формируется из неактивного состояния (Gt-GDP) в результате индуцируемого R* обмена связанного GDP на свободный GTP (GDP/GTP обмен). Эксперименты, выполненные на препаратах НСП сетчатки лягушки при соблюдении условий, способствующих максимальной скорости обмена, показали, что скорость GDP/GTP обмена мала. Ё последующих специальных опытах, выполненных на различных типах препаратов мембран НСП сетчатки быка с помощью широкого спектра подходов и методов (в частности, при использовании метода быстрой фильтрации и применении радиоактивно меченных GDP и GTP) было показано, что время диссоциации комплекса
Gt-GDP в присутствии R* в составляет 4-6 с при 20С. Такие результаты делают маловероятным предположение о том, что обмен связанного GDP на свободный GTP может обеспечить необходимую скорость активации Gt (~10 молекул Gt/c,) in vivo.
Обнаружено, что в препаратах НСП сетчатки лягушки GDP, связанный трансдуцином, способен фосфорилироваться до GTP в присутствии R* и АТР. Процесс фосфорилирования протекает с высокой скоростью даже при 0С. Высказано предположение о том, что фотоиндуцированное фосфорилирование связанного GDP до GTP может лежать в основе быстрой активации Gt в фоторецепторах.
Высказано предположение о том, что скорость гидролиза GTP в активном центре трансдуцина может определять время жизни его активного состояния и, следовательно, характеристики работы молекулярного усилителя НСП. Разработан так наз. «однооборотный» метод измерения времени гидролиза GTP в активном центре Gt. Выполнены измерения скорости гидролиза GTP в активном центре Gt в препаратах НСП сетчатки лягушки. Показано, что время гидролиза GTP резко уменьшается при понижении концентрации ионов Са2+ до наномолярного уровня. Таким образом, впервые была показана принципиальная возможность регуляции времени жизни активного состояния Gt. Последующее использование «однооборотного» метода измерения времени гидролиза GTP в активном центре Gt в ряде лабораторий способствовали открытию семейства белков RGS (Regulators of G protein Signalling), способных в комплексе с рядом дополнительных белков увеличивать скорость гидролиза GTP в активном центре G белков.
Выполнены эксперименты, показавшие, что активированная PDE есть комплекс фермента с активной формой Gt. Подобная точка зрения подтверждена в ряде последующих работ и стала общепринятой. Показано наличие популяции PDE, плотно связанной с мембраной, но экстрагирующейся из нее при кратковременной обработке препаратов низкими концентрациями трипсина. Высказано предположение о наличии в составе PDE липидного якоря, иммобилизующего PDE на мембране. Подобное предположение нашло свое последующее экспериментальное подтверждение в ряде работ других лабораторий. Обнаружено развивающееся во времени увеличение активности различных типов препаратов PDE НСП при гидролизе сАМР. Высказано предположение о функциональной роли некаталитических центров связывания cGMP.
Предпринята попытка выяснить природу ключевых компонентов системы зрительной трансдукции колбочек. Для этого разработан метод получения препарата НС колбочек сетчатки суслика, Полученный препарат содержал PDE, близкую PDE палочек по ее содержанию в фоторецепторной клетке, кинетическим характеристикам, значению к.м.м., pi, термостабильности, чувствительности к действию трипсина, наличию в ее составе термостабильного белкового ингибитора и способности активироваться в присутствие обесцвеченного зрительного пигмента и GTP. Это дало основание считать, что колбочки, как и палочки, содержат ферментативный каскад усиления, функционирующий с участием cGMP-специфичной PDE и GTP-связывающего белка. Выполнен анализ, результаты которого позволили сделать вывод о том, что системы фототрансдукции палочек и колбочек подобны, но различаются в системах, прекращающих развитие процесса активации после действия света и возвращающих элементы и систему в целом в первоначальное состояние. Сделанное заключение позволяет объяснить хорошо известные различия палочек и колбочек в кинетике фотоответов и светочувствительности.
Методом аффинной хроматографии на мелиттин-сефарозе обнаружен ряд белков, взаимодействующих с сорбентом Са+-зависимым образом. Белки с к.м.м. 21 Ша и 10 Юа был идентифицированв как кальмодулин и белок S-100, соответственно. Белки с к.м.м ~ 26 kDa были позднее идентифицированы в других лабораториях как (1) рековерин, ингибирующий родопсинкиназу в темноадаптированных фоторецепторах и снимающий ингибирующий эффект при понижении ионов кальция в цитоплазме НСП в ответ на свет и (2) как белки GCAP-1, GCAP-2, участвующие в процессе активации гуанилатциклазы при светоиндуцируемом понижении концентрации ионов Са+ в фоторецепторах. Совокупность этих данных способствовала формированию современных представлений о роли ионов Са2+в формировании первичного ответа фоторецепторов позвоночных.
Показано, что водорастворимая NDP киназа в препаратах НСП сетчатки быка способна к равновесному связыванию с обесцвеченными фоторецепторными мембранами. Такое равновесное взаимодействие находится под контролем концентрации п И Na , К , Са2+ ИЛИ Mg . Обнаружено, что: 1) мембраносвязанная NDP киназа высвобождается в присутствии низких концентраций GTP[SJ; 2) СТР[8]-зависимое взаимодействие NDP киназы с обесцвеченными мембранами имеет место лишь в присутствии трансдуцина; 3) мембраны, лишенные Gt, характеризуются низким сродством к NDP киназе и взаимодействуют с ферментом GTP[S]-независимым образом. Предполагается, что GTP[S]-зависимое взаимодействие NDP киназы с обесцвеченными мембранами НСП опосредуется с помощью Gt, а центрами связывания фермента являются комплексы между Gt И R*. Рассматривается возможность участия NDP киназы в процессе быстрой фотоактивации Gt. В последующих модельных экспериментах исследовалось взаимодействие рекомбинантных а- И Р-изоформ NDP киназы крысы с обесцвеченными мембранами НСП сетчатки быка. Показано, что изоформа (X способна к рН, катион- и GTPfSj-зависимому взаимодействию с мембранами подобно эндогенной NDP киназе НСП сетчатки быка, а трансдуцин является необходимым партнером такого взаимодействия. Обнаружено, GTP-зависимое взаимодействие является изоформ-специфичным: кажущееся сродство изоформы Р к центрам связывания в фоторецепторных мембранах по крайней мере в 100 слабее, чем сродство NDP киназы а. Представлены косвенные данные, указывающие на то, что различия в сродстве изоформ к комплексу R*Gt обусловлены различиями вариабельных участков VI этих гомогексамеров. Показано, что именно NDP киназа является мишенью для действия W и катионов (Na , К , Са ИЛИ Mg ) и опосредует их влияние на взаимодействие между NDP киназой и комплексом R*Gt.
Изолированные высокогомологичные рекомбинантные гомогексамеры а И Р NDP киназы крысы (каждый из двух типов субъединиц содержат 3 триптофана (Тгр78, 133, и 149) и 4 тирозина (Тут 52, 67, 147, и 151)) были детально исследованы методом собственной белковой флуоресценции в растворе. Обнаружено, что данные белки принципиально различны по своим флуоресцентным свойствам (квантовому выходу, положению максимума спектра флуоресценции и форме спектра) при нейтральных рН и их поведению при рН титровании. Обнаружено, что NDP киназа а подвергается структурным изменениям в диапазоне рН 5-8, тогда как NDP киназа Р стабильна в этом диапазоне условий. Выполнен анализ, указывающий на то, что различия в конформационной лабильности и спсобности изоформ NDP киназы к взаимодействию с родопсин-трансдуциновым комплексом могут иметь одну и ту же физическую основу, которая возможно одновременно определяет и известные различия в функциональной роли изоформ NDP киназы в клетке. Предполагается, что причиной таких различий, скорее всего, являются различия электростатической ситуации в этих белках, а не какие-либо структурные различия между ними при нейтральных рН.
Выполнено сравнительное исследование рекомбинантных NDP киназ а и крысы (} и их химерных, мутантных и tag-производных методом собственной белковой флуоресценции. Полученные результаты дают основания считать, что уникальные флуоресцентные свойства NDP киназы а и способность к конформационным перестройкам, отличающие ее от изоформы |5, определяются свойствами вариабельного участка VI. Возможно, что различия в структуре и свойствах этого участка и определяют функциональные различия изоформ а И Р в клетке. Показано, что участок VI также определяет способность NDP киназы а взаимодействовать с G-белками и различия в термостабильности а- и Р-производных фермента. Сделан вывод о том, что дальнейшие исследования по выявлению основ функциональных различий между изоформами NDP киназы млекопитающих должны сводиться к изучению точечных мутантных форм NDP киназы по вариабельным аминокислотным остаткам участка VI. Наиболее вероятными заменами, определяющими функциональные различия изоформ а и Р крысы, являются замены Arg42Gln, His47Leu И Asn69His. В дальнейших исследованиях эти аминокислотные остатки должны быть главной мишенью для направленного мутагенеза.
Анализируется гипотеза, согласно которой функциональный смысл обнаруженного в настоящей работы специфического взаимодействия между NDP киназой и R*Gt комплексом отражает один из этапов участия этого фермента в процессе активации G белка палочек сетчатки.
Научно-практическое значение работы. Результаты работы и высказанные предположения значительно расширяют наши представления как о молекулярных механизмах работы фоторецепторов сетчатки позвоночных, так и об общих принципах работы систем клеточной трансдукции. Они также способствуют углублению наших представлений о принципах построения систем, осуществляющих высококачественный информационный процессинг в клетке.
Сравнительное исследование палочек и колбочек показало принципиальное подобие их систем фототрансдукции. Одновременно выявлены ключевые элементы молекулярного усилителя, изменение которых принципиально меняет основные свойства фоторецепторов позвоночных.
Разработанный нами однооборотный метод измерения времени гидролиза GTP в активном центре GTP-связывающих белков нашел широкое применение во многих лабораториях нашей страны и за рубежом. Данный метод позволил получить результаты, способствующие формированию современных представлений о молекулярных механизмах регуляции времени жизни активного состояния белков этого семейства.
Полученные данные вносят заметный вклад в понимание вопроса о физиологическом смысле присутствия в клетках млекопитающих консервативных изоформ NDP киназы с близкими структурными и каталитическими свойствами. Сделаны предположения о физической основе различий между изоформами, которая, по-видимому, и определяет все известные различия в функциональной роли изоформ NDP киназы в клетке. Такие выводы представляют интерес в связи с многочисленными данными об участии различных изоформ NDP киназы в процессах клеточной регуляции (процессы клеточной трансдукции, дифференцировка, регуляция экспрессии генов) в норме и патологии (канцерогенез, метастазирование, апоптоз).
Апробация работы. Материалы работы докладывались на 1-ом Всесоюзном Биофизическом Конгрессе (Москва, 1982), IV Всесоюзном Симпозиуме «Циклические нуклеотиды» (Минск, 1982), IX Всесоюзной Конференции по Биохимии нервной системы
(Ереван, 1983), IV Всесоюзном Симпозиуме «Химия белков и пептидов» (Рига, 1983), V Всесоюзном Симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» (Пущино, 26-28 сентября 1984), Юбилейной Научной Конференции Института Биофизики АН СССР «40-летие Великой Победы» (Пущино, май 1985), VIII Симпозиум Биохимических Обществ СССР и ГДР «Проблемы биохимии и биотехнологии» (Рига, 1985), Симпозиуме «Люминесцентный анализ в медицине и биологии. Приборы и применение» (Рига, 1985), Всесоюзном Симпозиуме «Зрение организмов и роботов»(Вильнюс, 1985), 13th International Biochemical Congress (Amsterdam, 1985), V Всесоюзном Симпозиуме «Циклические нуклеотиды и регуляция ферментативных реакций» (Рязань, 1985), VI Всесоюзном Симпозиуме «Конформационные изменения биополимеров в растворах» (Тбилиси, 1985), V Всесоюзном Биохимическом Съезде (Киев, 1986), 17 FEBS Meeting (West Berlin, 1986), II Школе-семинаре «Механизмы зимней спячки млекопитающих» (Пущино, 3-12 июля 1986), VI General Meeting of the European Society for Neurochemistry «Molecular Basic of Neural Functions», (Prague, 1986), VI Всесоюзном Симпозиуме «Роль циклических нуклеотидов и вторичных месенджеров в регуляции ферментативных реакций» (Петрозаводск, 1988), VI Всесоюзном Симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» (Москва, 12-16 ноября 1988), International Simposium "Molecular organization of biological structures" (Moscow, 1989), 19th FEBS Meeting (Rome, Italy, 1989), 8th European Society Neurochem. Meeting (Leipzig, 1990), Научной конференции ИТЭБ РАН (Пущино, 1994), International Conference «Physics and Chemistry of Organic Luminophores'95» (Kharkhov, 1995), International Meeting «Spectroscopy of Organic Compounds» (Nezhgin, Ukraine, 1995), First International Workshop on nm23/NDP kinase (Paris, 1995), Eighth International Conference ofthe International Society of Differentiation (ISD) (Hiroshima, Japan, 1994), 3rd Internet World Congress on Biomedical Sciences (Tokyo, 1996), 41th Annual Meeting ofthe American Biophysical Society (New Orleans, USA, 1997), XXXIII International Congress of Physiological Sciences (St. Petersburg, Russia, 1997), Междунар. конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 1998), П Russian Biophysical Meeting (Moscow, 1999), International Symposium «Biological Motility: New Trends in Research» (Pushchino, 2001), Fourth International Congress ofthe Genetics, Biochemistry and Physiology ofNDP Kinase/NM23 (Tokyo, Japan, 2001), 45th Annual Meeting ofthe American Biophysical Society (Boston, USA, 2001), Международной конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003), Fifth International Congress of the Genetics, Biochemistry and Physiology ofNDP Kinase/ NM23/AWD (Lexington, KY, U.S.A., 2003), International Symposium "Biological Motility" dedicated to the memory of academician G.M. Frank (1904-1976) (Pushchino, 2004), III Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004).
Основные методы
Получение препаратов НСП сетчатки позвоночных. Препараты НСП сетчатки лягушки Rana temporaria и быка Bos taurus получали в близком соответствии с описанными ранее методами [Гаспарян и соавт, 1980; Krapivinsky et al, 1980; Тищенков, Орлов, 1983] при 4С и слабом красном свете (20 ВТ, X > 680 нм) в результате мягкой гомогенизации сетчаток в 40% (w/V) растворе сахарозы, приготовленном на изотоническом буфере А (25 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 140 мМ NaCl, 3.5 мМ КС1, 2 мМ MgCL, 0.1 мМ СаС12 и 0.1 мМ дитиогреитол (DTT» и последующей двукратной флотации (140000 g, 1 ч) суспензии. Очищенные НСП (А280/А500 =2,3-2,8) суспендировали в той же среде при концентрации R = 5 мг/мл, хранили в темноте при 0С и использовали в работе 1-3 суток. Длительное хранение осуществляли при -20С. Получение препаратов, обогащенных водорастворимыми белками НСП сетчатки лягушки. НСП суспендировали в растворе с низкой ионной силой (1 MMTris-HCl, рН7.6, 0.1мМШТ)при слабом красном свете и центрифугировали 1 ч при 140000 g. Супергиганты (концентрация белка 1-1.5 мг/мл) собирали и использовали в работе.
Получение препаратов фоторецепторных мембран, свободных от водорастворимых компонентов НСП сетчатки лягушки. НСП суспендировали в растворе с низкой ионной силой (1 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 0.1 мМ DTT) при слабом красном свете и центрифугировали 30 мин при
140000 g. Процедуру промывки мембран проводили не менее 3-4 раз. Полученные мембраны хранили в темноте при -20С.
Разделение белков методом гель-фильтрации. Изоэлектрофокусирование (IEF). Электрофорез. Гель-фильтрацию препаратов водорастворимых белков НСП (1-1.5 мг) проводили при 0С на колонке 93 х 1.5 см с Sephacryl S-200 (Pharmacia, Швеция) в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 100 мМ КС1, 5 мМ MgCl2 и 0.1 мМ DTT, при скорости элюции 20 мл/ч. Объем собираемых фракций 1-2 мл. IEF водорастворимых белков НСП в градиенте плотности сахарозы проводили как описано ранее [Тищенков, 1984] на самодельной колонке объемом 30 мл, используя для создания градиента рН (рН 3.5-9.5) амфолиты-носители (LKB, Швеция), Элетрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствие додец ил сульфата натрия (SDS-PAGE) проводили по методу Лэммли [Laemmli, 1970].
Связывание гуаниловых нуклеотидов различными типами препаратов НСП. Определение уровня связывания негидролизуемого аналога GTP [ Н]-гуаН03ИН-5*-(Р,7-ИМИН0)трифосфата ([3H]GppNHp) проводили при 20С в среде, содержащей 50 мМ Tris-HCl, рН 7.6, 100 мМ КС1, 1 мМ MgCl2 и 0.1 мМ DTT при конечной нуклеотида 0.43-10 мкМ. Реакцию индуцировали добавлением [3H]GppNHp в темновые или облученные видимым светом суспензии НСП при концентрации зрительного пигмента 0.1-1 мг/мл. После инкубации в течение определенного времени пробы объемом 50-100 мкл наносили на нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.4 мкм ("Сынпор", ЧССР) и промывали 3-4 порциями по 0.8 мл указанного выше буфера в течение 15 с. Радиоактивность фильтров определяли в толуольном сцинтилляторе на счетчике SL-4000 (Intertechnique, Франция). Препараты НСП, содержащие дозированное количество R*, получали, облучая темновые препараты НСП желтым светом в течение 2 мин за 15-20 мин до начала опыта. Степень фотолиза регулировали изменением расстояния до источника облучения и применением нейтральных светофильтров. Препараты, содержащие более 80% R*, были обозначены как светоадаптированные препараты НСП.
Измерение уровня связывания [3H]GppNHp препаратами водорастворимых белков НСП или фракциями, полученными при их разделении методом гель-фильтрации, проводили в среде, содержащей указанный выше буфер и светоадаптированные мембраны ([R*]=l мг/мл), свободные от водорастворимых белков НСП (см. выше). Связывание инициировали добавлением препарата водорастворимых белков или фракций, полученных при гель-фильтрации. Инкубацию вели 20 мин.
Процессы диссоциации [14C]GDP из связывающих центров светоадаптированных и преинкубированных с 1 мкМ радиолигандом в течение 10-15 мин НСП сетчатки лягушки изучали, регистрируя кинетику уменьшения количества связанного Г C1GDP после введение в образец GppNHp в конечной концентрации 0.1-1 мМ. Полученные данные описывали экспоненциальной зависимостью A(t) = Ао "" (Адю* — Aq) [exp(-t/Tj)], ГДЄ Aq И Адщх - стационарные уровни связывания [3H]GDP до и после добавления антагониста, соответственно, а Т| - постоянная времени процесса.
Связывание негидролизуемого аналога GTP гуанозин 5'-0-(3-тио)трифосфата ([y"S]GTP, GTP[S]) различными типами препаратов НСП сетчатки быка выполняли в принципиальном соответствии с описанными выше методами, используя нитроцеллюлозные фильтры НА 0.45 мкм (Millipore Corp., USA). В ряде случаев при исследовании процесса ассоциации центрами связывания использовали установку для быстрой фильтрации и метод скоростной обратной фильтрации, описанные далее.
Измерение скорости гидролиза [a PJGTP в препаратах НСП сетчатки лягушки. Для удаления эндогенного GDP светоадаптированные препараты НСП сетчатки лягушки суспендировали в изотоническом буфере А и центрифугировали 15 мин при 30000 g. Подобную процедуру проводили 3-4 раза. Полученные НСП суспендировали в той же среде в концентрации по R* 25-50 мкМ.
Измерения проводили в условиях, при которых концентрация [a32P]GTP (0.3-0.5 мкМ) значительно ниже концентрации центров связывания ([R*Gt] = 2-4 МкМ).. Реакцию инициировали добавлением [a32P]GTP и вели при 20'С. Через определенные моменты времени из реакционной смеси отбирали пробы объемом 3-5 мкл и смешивали их с равными объемами этанола. Содержание [СХ P]GTP И [ot P]GDP в пробах определяли в результате их разделения методом тонкослойной хроматографии на селикагелевых пластинах "Kieselget F6Q254 (Merck), радиоавтографии пластин и последующего денситометрирования радиоавтографов. Временное разрешение метода, определяемое скоростью смешивания реагентов и отбора проб, составляло 2-3 с.
Аффинная хроматография водорастворимых белков НСП на мелиттин-сефарозе и кальиодулин-сефарозе. Мелиттин из яда пчел (Apis mellifera) получали по несколько модифицированному методу Кинга и соавт. [King et al., 1976] в результате гель-фильтрации (Sephadex G-50) и ионообменной хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой. Электрофоретически гомогенные препараты кальмодулина и белка S-100 из мозга быка получали как описано нами ранее [Permyakov et al., 1985; Kreimer et al., 1992]. Мелиттин-сефароза и кальмодулин-сефароза были синтезированы сотрудником лаборатории В.М. Грищенко по описанным ранее методам [Kincaid, Coulson, 1985; Kincaid, Vaughan, 1979; Kreimer et al., 1992].
Для экстракции водорастворимых белков НСП суспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ HEPES, рН 8.0,2 мМ EDTA, 1 мМ DTT) при концентрации R-1 мг/мл и центрифугировали 1 ч при lOOOOOg Процедуру экстракции проводили трижды. Супернатанты, содержащие 40-45% белка исходного препарата НСП, объединяли, диализовали при 0*С против буфера, содержащего 25 mMBES, рН 7.0,250 MMNaCl, 5 MMMgCl2,l мМ СаС12 и 1 мМ DTT, центрифугировали (100000 g, 1 ч) и наносили на колонку в том же буфере. Колонки промывали Са2+-содержащими растворами с целью удаления компонентов, не взаимодействующих с сорбентом. Последующие этапы элюции проводили, используя EGTA-содержащие среды [Грищенко и соавт, 1989; Грищенко и соавт, 1998]. Определение активности PDE. Фосфодиэстеразную активность препаратов измеряли рН-метрическим методом [Liebman, Ivanchuk, 1982], регистрируя закисление среды, обесловленное появление протонов в ходе реакции гидролиза сАМР (иногда cGMP). В качестве рН-индикатора использовали краситель крезоловый красный (Реахим). Увеличение пропускания красителя при 575 нм регистрировали с помощью спектрофотометра "Specord UV-VIS", включенный в режиме измерения кинетики. Реакцию вели в кварцевых кюветах (длина оптического пути 0,2-1 см, объем 0.5-2 мл) при 30С в среде, содержащей в большинстве опытов 10-40 мМ HEPES-NaOH (начальное значение рН 8,0), 25-50 мкМ крезоловый красный, 10 мМ MgCl2 и исследуемый препарат.
Часть измерений активности PDE, в частности измерения, проводимые при высокой концентрации НСП, выполняли с помощью малогабаритного (диаметр 3 мм) малоинерционного (т <2 с) рН-электрода в стеклянной ячейке (1-2 мл), снабженной магнитной мешалкой. Электрод был соединен с операционным усилителем и далее с аналогово-цифровым преобразователем. Цифровые значения подавались на вход персонального компьютера, снабженного разработанной в лаборатории программой (автор Д. Б. Вепринцев). Программа позволяла интегрировать значения в пределах устанавливаемого экспериментатором времени (0,1-1 с) и выводить значения рН каждые 1-5 с в виде табличных данных и(или) в виде графика изменений рН от времени.
Реакции инициировали добавлением 100 мМ сАМР до конечных концентраций 0,1-25 мМ. В ряде опытов использовали cGMP. При изучении активации PDE под действием активного трансдуцина после регистрации базальной активности фермента в течении нескольких минут в среду добавляли GTP, GppNHp или GTP[S] до необходимых концентраций и продолжали измерения в течении последующих 1-2 мин. В течении указанного времени скорость высвобождения протонов была постоянной. Для определения уровня максимальной активности фермент активировали трипсином (10 мкг/мл). После инкубации при 30С в течении 2 мин протеолиз останавливали добавлением избытка ингибитора трипсина.
В ряде случаев измерение активности PDE в препаратах НСК сетчатки суслика проводили при 20С, используя в качестве субстрата [14C]cGMP ("Amersham"). Реакционная смесь содержала 50 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 140 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 2-3 мМ [uC]cGMP (конечная удельная активность 5-20 мКи/моль) и исследуемый препарат. Содержание [14C]cGMP и [14C]GMP в пробах, отбираемых в соответствующие моменты времени, определяли в результате их разделения методом TLC и авторадиографии пластин как описано выше.
Экстракция PDE из фоторецепторных мембран НСП сетчатки быка. Препараты НСП сетчатки быка, полученные как описано выше, суспендировали в соответствующей среде при концентрации по родопсину 1 мг/мл и центрифугировали 1 ч при 60000 g. Супернатанты собирали, а осадок подвергали последующим этапам экстракции. В качестве сред применяли изотонический буфер (20 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 и 0.1 мМ DTT) и гипотонические растворы: раствор I (2 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 0.5 мМ MgCl2 и 0.1 мМ DTT) и раствор П (2 мМ HEPES, рН 8.0). В ряде случаев гипотонические растворы содержали 200 мкМ GTP или 2 мМ EDTA или (и) EGTA.
Получение препаратов наружных сегментов колбочек сетчатки суслика. В качестве исходного материала использовали сетчатки сусликов (Citellus undulates). Препарирование сетчаток и выделение наружных сегментов колбочек (НСК) проводили при слабом красном свете
(A>680 hm) и 4C. Сетчатки встряхивали 4-5 мин в 47% (w/v) растворе сахарозы, приготовленном на изотоническом буфере А (см. выше) и центрифугировали 15 мин при 10000 g. Супернатант собирали, гомогенизировали, помещали на дно центрифужной пробирки, наслаивали 40% и 30% (w/v) растворы сахарозы в буфере А и центрифугировали 1 ч при 100000 g. Материал, локализованный на границе между 30% и 40% растворами сахарозы (препарат НСК) и в стартовом растворе 47% сахарозы (препарат Ф47)> собирали и использовали в работе. Выход препарата НСК составлял 0.1-0.3 мг белка на сетчатку и определялся условиями гомогенизации. В качестве экстрактов препаратов НСК использовали супернатанты, полученные при экстракции препаратов НСК растворами с низкой ионной силой (10 мМ Tris-HCl, рН 7.4) и последующего центрифугирования (100000 g, 2 ч).
В ряде опытов использовали препараты ST - супернатанты, полученные из сетчаток животных, адаптированных к темноте 10-12 часов. Декапитацию животных, препарирование сетчаток и все последующие операции проводили в темноте или при слабом красном свете. Сетчатки (1-2 шт.) помещали в 1-2 мл буфера А, встряхивали и центрифугировали 1 мин при 300 g. Супернатант ST собирали, хранили в темноте и использовали в работе в течение 20-30 мин после их получения.
Анализ и очистка препаратов GDP. Чистоту GDP (Boehringer) анализировали методом высокоразрешающей жидкостной хромаграфии (FPLC) на колонке Mono Q (Pharmacia), используя для элюции линейный градиент NaCl (0 - 500 мМ) в 20 мМ Tris-HCl буфере (рН 8.0). По данным анализа препарат GDP содержал 0,2 - 0,5% GTP. Для очистки GDP подвергали двукратной жидкостной хроматографии на колонке Mono Q как описано выше. Примесь GTP в таком препарате была ниже чувствительности метода определения (<0.05%). Чистоту препаратов GDP также проверяли по их способности активировать PDE в суспензии НСП (см. далее).
Чистоту [3H]GDP (NEN) анализировали методом тонкослойной хроматографии (TLC) на 0.2 мм селикаглевых пластинах "Kieselgel 6OF254 (Merck) в смеси 1,4-диоксан : NH4OH (27%) : вода в соотношениях 6:1:4 (v/v) с последующей радиоавтографией пластин и использованием усилительного экрана. Препарат [3H]GDP использовали без дополнительной очистки, поскольку примесь GTP не превышала 0.1%.
Процессинг GDP в препаратах НСП. НСП, суспендированные в изотоническом буфере А в конечной концентрации по белку 0.2-2 мг/мл, обесцвечивали комнатным светом. Реакции инициировали добавлением GDP или [3Н]ООРдо конечной концентрации 0.1-1 мМ. В диапазоне времен 0-60 мин отбирали пробы и анализировали их методами FPLC, или TLC с последующей авторадиографией пластин как описано выше.
Установка для скоростной фильтрации. В работе использовалась установка для скоростной фильтрации, детально описанная ранее [DuPont, 1984]. Благодаря фиксации нитроцеллюлозных фильтров (объем 30 мкл) между пластинами из пористого стекла и наличию устройства, подающего раствор определенного состава с заданной скоростью, аппаратура позволяла осуществлять промывку фильтров в течение заранее заданного времени со скоростью до 7 мл/с . Это давало возможность провести предельно быструю смену среды в фильтре, а при введении в среду промывки радиоактивных лигандов предельно быстро внести радиолиганд в реакционную среду (метод обратной скоростной фильтрации).
Измерения активности вТРазы трансдуцина «однооборотным» методом в препаратах НСП сетчатки быка. НСП суспендировали при 4С в изотоническом буфере А в концентрации по белку 2 мг/мл, обесцвечивали и промывали 2-3 раза тем же буфером, центрифугируя по 15 мин при 100.000 g для удаления эндогенного GDP. Полученные НСП ([R*] ~ 1 мг/мл) при температуре 21-23Х быстро (<1 s) смешивали с [y^GTP (NEN) до конечной концентрации GTP 0.17-0.66 мкМ. Через определенные интервалы времени из реакционной среды отбирали пробы объемом по 30 мкл. Определение 32Р в пробах выполняли как описано ранее [Arshavsky, Bownds, 1992]. Эксперименты, выполненные на НСП сетчатки лягушки, проводили в близком соответствии с описанной схемой, используя в качестве субстрата [cTPJGTP и разделяя продукты реакции ([a32P]GTP и [a32P]GTP) методом TLC с последующей авторадиографией пластин как описано выше. Данные описывали экспоненциальной зависимостью: A(t) — А{> + (Алах *~ Ао) [l*CXp(-t/Ti)], где Ао И Ащах - начальная и максимальная амплитуды ответа, соответственно, а Tj - постоянная времени процесса.
Измерение кинетики инкорпорирования [yiSJGTP в препаратах НСП, проинкубированных с GTP. Полученные как описано в предыдущем разделе образцы НСП объемом по 100 мкл и содержащие 2.5 нмолей R* и я 0.07 нмолей Gt (измерено по уровню инкорпорирования [^5S]GTP)
быстро (<1 s) смешивали с 100 мкМ GTP до конечной концентрации 2 мкМ. После инкубации каждой из проб с GTP при 23С в течение 2 с, достаточных для практически полного насыщение комплексов Я^^лигандом, в нихдобавляли [у SJGTP до конечной концентрации 20 мкМ. После инкубации проб в течение 1-80 с, их быстро разбавляли 2 мл изотонического буфера и фильтровали. Общее время разбавления и фильтрации не превышало 2 с. Радиоактивность фильтров определяли стандартным методом. Данные описывали как результат двух последовательных реакций: A(t) — Ао + (А* *~ Ао) О + [Кі/(КгКї)]ЄХр(-КД - [К[/( K^-Jt^expf-КгОЬ ГДЄ Ао И Атах'- начальная и максимальная амплитуды ответа, соответственно, а К.\ И Кг — константы скорости первого и второго последовательных процессов, соответственно. Определение активности и содержания NDP киназы в препаратах. Активность NDP киназы измеряли при ЗО'С, определяя скорость фосфорилировании TDP NDP киназой с помощью системы сопряженных ферментов пируваткиназы и лактатдегидрогеназы [Park and Agarval, 1973; Fukuchi et al., 1994]. Скорость расхода NADU на финальной стадии данной системы реакций измерялась спектрофотометрически по скорости уменьшения поглощения NADH при 340 нм в результате его перехода в NAD*.
Содержание NDP киназы определяли с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга, используя поликлональные антитела (NK2) против NDP киназы крысы, взаимодействующие также с NDP киназой быка [Kimura, Shimada, 1988]. Поскольку распределения активности фермента и количества белка NDP киназы соответствовали друг другу, в большинстве опытов измеряли лишь ферментативную активность NDP киназы.
Получение препаратов рекомбинантных изоформ NDP киназы крысы и их производных. Гены изоформ аиР NDP киназы крысы и их производных были сконструированы и экспрессированы в Е. coli в Отделе Молекулярной Биологии Токийского Института Геронтологии Н. Ишикавой (Dr. N. Ishikawa) и Ю. Ишиджимой (Dr. Y. Ishijima) под руководством проф. Н. Кимуры. Рекомбинантные белки были очищены до гомогенного состояния (чистота > 98%, метод SDS-PAGE) сотрудниками нашей лаборатории методом аффинной хроматографии на АТР-агарозе. Получение частично очищенных препаратов NDP киназы НСП сетчатки быка. Препараты НСП промывали (100000 g, 10 мин) на свету при рН 5.5 (10 мМ MES-NaOH, 0.25 мМ MgCh) для удаления пула водорастворимых белков НСП и нуклеотидов. NDP киназу экстрагировали изотоническим буфером (рН 8), центрифугируя 1 ч при 100000 g.
Получение препаратов Gt: Препараты Gt получали известным методом [Kuhn, 1980]. Поданным SDS-PAGE, транедуцин составлял >90% белка в препарате. NDP киназа составляла <0.1% белка препаратов Gt.
Получение препаратов N- и W-мембран НСПдля опытов по связыванию NDP киназы. Для получения обедненных NDP киназой, Gt-содержащих мембран (N-мембраны), суспензии НСП (R*/R=0.2, [R]=0,5 мг/мл) в нейтральном буфере (10 мМ Tris-HCl, рН 7,5, 0,25 мМ MgCl2) центрифугировали 10 мин при 100000 g. Далее мембраны трижды промывали как описано выше. Полученные мембраны содержали 80-90% Gt и 7-10% NDP киназы, присутствовавших в исходных препаратах НСП.
Мембраны, обедненные NDP киназой и Gt (W-мембраны), получали комбинацией методов, используемых для экстракции Gt и других периферических белков [Kuhn, 1980, Shinozawa, Bitensky, 1980]. Поданным SDS-PAGE, R составлял >90% белка мембран. Содержание Gt в мембранах, определяемое с помощью антител против Ct-субъединицы G белков (DuPont/NEN), было ниже чувствительности метода (<5% от содержания Gt в НСП). Содержание NDP киназы составляло 5-7% от ее содержания в НСП.
CBH3biBaHHe3wioreHHOHNDPKHHa3bi сетчатки смембранами НСП. Дляразделения свободной и связанной форм NDP киназы НСП использовали метод центрифугирования. НСП разбавляли буфером до заданных концентраций по белку в объемах 50-200 мкл, гомогенизировали и центрифугировали 10 мин при 100000 g на центрифуге ТЫ00 (Beckman, США) при 15-20С. Супернатанты и осадки использовали для измерений активности NDP киназы и/или содержания фермента.
Связывание рекомбинантных NDP кияаз Ct В р с N-и W-мембранами. Эксперименты по связыванию рекомбинантных изоформ NDP киназы крысы и их производных с препаратами N- и W-мембран проводили в близком согласии с методом, описанным выше. N- или W-мембраны смешивали при определенных условиях с препаратами рекомбинантных NDP киназ. Образцы (50-200 мкл) центрифугировали 10 мин при 100000 g. Супернатант и осадок использовали для определения активности свободного и связанного фермента, соответственно. Активность NDP
киназы препаратов N- и W-мембран не превышала 0.2-0.5% активности рекомбинантного фермента. В отсутствии мембран рекомбинантные NDP киназы не седиментировали при центрифугировании, и не претерпевали необратимых изменений активности в присутствии используемых буферных и солевых растворов. Данные опытов по связыванию NDP киназы при различных концентрациях IT, солей и нуклеотидов анализировали с помощью выражения А= Aq +
А„» /[1 + (KWL)11] (1), где А, А. И Атах - активности NDP киназы в супернатантах при концентрации лиганда L, в отсутствии лиганда и при его насыщающих концентрациях, соответственно; К]д - полунасыщающая концентрация лиганда и h-коэффициент Хилла Флуоресцентные измерения. Для измерения собственной белковой флуоресценции изоформ NDP киназы крысы и их производных использовали лабораторный спектрофлуориметр с монохроматическим возбуждением [Burstein et al., 1973; Bukolova-Orlova et al., 1974], либо спектрофлуориметр Shimadzu RF 5000. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 296.7 нм, избирательно поглощаемым остатками триптофана. Спектры корректировали [Burstein, Emelyanenko, 1996] Интенсивности в корректированных спектрах были пропорциональны числу фотонов в единице интервала длин волн в единицу времени. Разложение спектров на индивидуальные компоненты проводили как описано ранее [Abornev, Burstein, 1992; Orlov et al., 1998]. Определение квантового выхода исследуемых белков выполняли общепринятым методом [Burstein, 1977]. Данные по тушению флуоресценции анализировали как описано ранее [Burstein, 1977].
Исследование термостабильности NDP киназ. Термостабильность NDP киназ определяли как описано ранее [Орлов и соавт., 1983; Erent et al., 2001], измеряя ферментативную активность образцов после их инкубации в течение 15 мин при температуре в диапазоне 20-8СГС. Образцы содержали исследуемый фермент (5 мкг/мл), 5 мМ HEPES-NaOH буфер (рН 8), 0.5 мМ MgCl2 и БСА (1 мг/мл).
Дополнительные методы. Спектральные измерения выполняли на спектрофотометрах "Specord UV-VIS (Carl Zeiss, GDR) и Beckman DU 650 (Beckman, USA). Содержание родопсина определяли по разности поглощения образцов НСП при 500 нм до и после их полного обесцвечивания оранжевым светом лампы накаливания 40 вт в присутствии NH2OH. Молярный коэффициент экстинкции родопсина при 500 нм принимали равным 40600 СМ М" . Содержание белка определяли по известному методу Брэдфорд [Bradford, 1978] или с помощью стандартного набора реактивов ВСА Protein Assay Kit (Pearce, USA), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
