Содержание к диссертации
Введение
2.Обзор литературы 13
2.1. Никотиновый холинорецептор 13
2.2. Субъединичный состав холинорецептора 15
2.3. Структурные компоненты нАХР 17
2.4. Строение канала ацетилхолинового рецептора 20
2.5. Функциональные свойства нАХР 22
2.6. Вещества, модулирующие работу нАХР 24
2.6.1. Конкурентные лиганды 24
2.6.2. Неконкурентные лиганды 26
2.6.2.1. Экзогенные и эндогенные НКИ 26
2.6.2.2. Фармакологические свойства НКИ 27
2.6.2.3. Места связывания НКИ и потенциалзависимость их действия 29
2.6.3. Аллостерические модуляторы 31
2.6.4. Вещества имеющие двойной механизм действия 32
2.7. Использование методов математического моделирования при изучении механизмов постсинаптического электрогенеза 33
3. Объект и методы иследования 54
3.1. Объект исследования 54
3.2. Ванночка и система перфузии 54
3.3. Растворы 55
3.4. Электрофизиологические исследования 56
3.5. Статистическая обработка и анализ 56
3.6. Компьютерное моделирование 57
4. Результаты исследования и их обсуждение 59
4.1. Исследование влияния хлоргексидина на нАХР 59
4.1.1.Влияние хлоргексидина на ТКП 59
4.1.2. Влияние хлоргексидина на квантовый состав ТКП 62
4.1.3. Влияние хлоргексидина на ТКП в режиме ритмической стимуляции 62
4.1.4. Эффект частичного разблокирования рецепторно-канального комплекса 65
4.1.5. Частичное разблокирование рецепторов с помощью предварительной активации карбахолином 67
4.1.6. Потенциалзависимость действия хлоргексидина 69
4.1.7. Исследование внеканального действия хлоргексидина 71
4.2. Математическое моделирование 76
4.2.1. Реконструкция динамики изменения концентрации ацетилхолина в синаптическои щели при одноквантовом сигнале 76
4.2.2. Моделирование взаимодействия хлоргексидина с нАХР 85
5. Заключение 90
6. Выводы 92
7. Список литературы 94
- Субъединичный состав холинорецептора
- Использование методов математического моделирования при изучении механизмов постсинаптического электрогенеза
- Статистическая обработка и анализ
- Частичное разблокирование рецепторов с помощью предварительной активации карбахолином
Введение к работе
В нервно-мышечном соединении постсинаптические токи, возникающие в ответ на нервный импульс, могут угнетаться биологически активными веществами, имеющими различные механизмы действия. Как правило, самого факта влияния вещества на параметры постсинаптического тока недостаточно для определения конкретного механизма. Ситуация осложняется еще и тем, что многие биологически активные вещества обладают сразу целым спектром механизмов действия (Colquhoun, 1981; Ralevic, Bumstock, 1998; Chiodini et al., 2001).
Прежде всего, вещества, уменьшающие амплитуду постсинаптических токов, могут действовать или на процесс выброса агониста из нервного окончания, или непосредственно на постсинаптические рецепторы, или сочетать оба этих действия. Одним из подходов к решению вопроса о прейди постсинаптическом механизме действия вещества является исследование его влияния на постсинаптические токи, возникающие при вызванном и спонтанном квантовом освобождении медиатора. Спонтанная квантовая секреция агониста является довольно стабильным процессом и сравнение действия вещества на спонтанные и вызванные постсинаптические токи позволяет судить о соотношении его пре- и постсинаптических эффектов.
Если говорить о веществах, уменьшающих амплитуду постсинаптических токов за счет влияния непосредственно на постсинаптические рецепторно-канальные холинорецепторы, то их можно разделить на три класса: блокаторы, аллостерические модуляторы и ускорители десенситизации (Cockroft et al., 1990; Conley, Brammar, 1996; Changeux et al., 1998; Arias, 1998; Jackson, 1999; Krusek et al., 2004). Блокаторы можно подразделить на конкурентные, занимающие на рецепторе посадочные места для агониста и тем мешающие его посадке и последующему открытию канала, и неконкурентные, взаимодействующие с ионным каналом (Colquhoun, 1981). Неконкурентные блокаторы делят на три подгруппы - блокаторы закрытого канала, блокаторы открытого канала и блокаторы открытого канала ловушечногф типа, которые впервые были описаны для глутаматных рецепторов (Lingle, 1983; Gurney, Rang, 1984). Различают медленные, быстрые и средние блокаторы открытого канала; медленные ускоряют спад постсинаптических токов, быстрые - замедляют, средние делают его двухфазным. Аллостерические модуляторы взаимодействуют со специфическими участками рецепторно-канального комплекса и меняют кинетику его работы; ускорители десенситизации повышают вероятность перехода рецепторно-канального комплекса в десенситизированное непроводящее состояние, являясь фактически специализированной разновидностью аллостерических модуляторов.
Большой интерес с практической и теоретической точки зрения представляют вещества, способные оказывать длительное ингибирующее воздействие на синаптическую передачу (такого рода воздействие необходимо при некоторых заболеваниях), однако сейчас известно немного таких веществ. Блокаторы ловушечного типа могут длительное время оставаться в закрытом канале ионотропного рецептора, но только в отсутствие агониста, то есть в неактивном синапсе (Blanpied et al., 1997; Giniatullin et al., 2000). Длительное воздействие на ионотропные рецепторы могут оказывать некоторые токсины (Уткин и др., 1999; Bambrick, Gordon, 1994; Tsetlin, Hucho, 2004; Lewis, 2004), но их эффект обусловлен необратимостью связывания с рецептором или каналом, что сильно ограничивает возможности их применения и делает их веществами, опасными для жизни. Вещества же безопасные и способные при этом оказывать длительное воздействие на активно работающий синапс до сих пор известны не были.
Ранее были получены данные о слабообратимом ингибирующем действии нетоксичного и широко применяемого в клинической практике амфифильного антисептика хлоргексидина на постсинаптические токи в нервно-мышечном соединении (Соколова и др., 1998). Однако точный механизм и особенности действия этого вещества до сих пор не были исследованы и представляют собой актуальную, теоретически и практически значимую задачу. Для полного понимания механизма взаимодействия молекулы хлоргексидина и рецепторно-канального комплекса наряду с электрофизиологическими экспериментами необходимо было также провести модельные исследования, которые способны детально прояснить поэтапное развитие экспериментально наблюдаемых эффектов.
1.2. Цель и основные задачи исследования
Целью настоящего исследования было выяснение механизмов, посредством которых реализуется действие хлоргексидина на никотиновый рецептор мышечного типа.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Исследовать действие хлоргексидина на параметры вызванных и спонтанных постсинаптических токов в нервно-мышечном соединении лягушки.
2. Найти экспериментальные условия, позволяющие определить механизм действия хлоргексидина на ионотропный холинорецептор мышечного типа.
3. С помощью математического моделирования проверить гипотезы о механизмах действия и определить константы в кинетической схеме взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорецептором мышечного типа.
1.3. Положения, выносимые на защиту
1. В действии хлоргексидина на никотиновый холинорецептор мышечного типа присутствуют два компонента: блокада открытого канала медленного типа и аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса.
2. Аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса преобладает в действии хлоргексидина и обеспечивает 70% общего эффекта. Как аллостерическии модулятор хлоргексидин снижает сродство холинорецептора к агонисту и вероятность нахождения канала в открытом состоянии.
1.4. Научная новизна
Впервые для никотиновых холинорецепторов мышечного типа показано существование вещества, имеющего двухкомпонентный механизм действия - блокирование открытого канала и аллостерическую модуляцию кинетики рецепторно-канального комплекса. Причем наличие и преобладающая роль механизма аллостерической модуляции для хлоргексидина показаны как экспериментально, так и с помощью математического моделирования.
Впервые показана теоретическая возможность существования нового механизма пролонгированного действия для аллостерических модуляторов, связанного со способностью вещества растворяться в липидах мембраны и оказывать модулирующее действие через специализированные места посадки, находящиеся в зоне липид-белкового взаимодействия. В этом случае обратный выход из липида в водную фазу будет сильно затруднен и эффект вещества долго не будет "отмываться", несмотря на обратимое связывание этого вещества с рецепторно-канальным комплексом.
Впервые найдены функции, описывающие динамику изменения концентрации ацетилхолина и активности ацетилхолинэстеразы в синаптической щели нервномышечного соединения холоднокровных. Впервые построена и исследована математическая модель, описывающая кинетику взаимодействия хлоргексидина с никотиновым холинорецептором мышечного типа.
1.5. Научно-практическая ценность
Полученные в данной работе результаты вносят вклад в понимание механизмов функционирования синаптического аппарата скелетных мышц и углубляют наши представления о работе никотинового рецептора мышечного типа. Одновременное экспериментальное и модельное исследование тонких механизмов, обусловливающих особенности действия слабообратимых ингибиторов ионных токов, является новым методическим подходом, позволяющим приблизиться к пониманию принципов модуляции работы ионотропных рецепторов. Эти данные помогут понять механизм действия некоторых лекарств с пролонгированным синаптическим эффектом, а также могут лежать в основе создания новых лекарственных средств, мишенями для которых являются синаптические структуры. Полученные зависимости, описывающие динамику изменения концентрации ацетилхолина и активности ацетилхолинэстеразы в синаптической щели, можно использовать при моделировании кинетики процессов в нервно-мышечном соединении холоднокровных.
1.6. Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях КИББ КазНЦ РАН (Казань, 2003, 2004, 2005), 6-й, 7-й, 8-й международных пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2002, 2003, 2004), VI Всероссийском симпозиуме и школе-семинаре молодых ученых и учителей (Набережные Челны, 2004), XI Всероссийской конференции "Структура и динамика молекулярных систем" (Яльчик, 2004), международном симпозиуме "Neuron differentiation and plasticity - Regulation by intracellular signals" (Москва, 2003), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), международной школе-конференции "Internatioanl workshop in cell physiology" (С-Петербург, 2004).
Субъединичный состав холинорецептора
На основании анализа гидрофобности было выяснено, что нАХР имеет три хорошо различимых части: гидрофильную внеклеточную часть, гидрофобную часть, находящуюся в мембране, и гидрофильную внутриклеточную часть. Внеклеточный домен содержит как N- так и С- терминали. Известно, что место связывания агониста находится в N-терминали (Bertrand et al., 1995; Stephenson, 1995; Smith, Olsen, 1995). N-терминаль также имеет, в зависимости от субъединицы рецептора, один или более чем один предполагаемый центр гликолизирования (Hucho et al., 1996). Первичная последовательность каждой субъединицы рецептора пересекает липидную мембрану 4 раза формируя трансмембранные домены М1-М4 (рис. 2). М2 последовательность каждой субъединицы участвует в формировании стенки рецептор-ассоциированного ионного канала. В катион-селективных каналах М2 последовательность содержит отрицательно заряженные остатки, в то время как анион-селективные каналы, содержат положительно заряженные остатки. Внутриклеточный домен фомрируется гидрофильными участками трансмембранных доменов МЗ и М4. В свою очередь М1-М2 и M2-M3 домены соединены короткими гидрофильными участками, локализованными в цитоплазме или вне клетки.
С внешней стороны мембраны нАХР представляет собой розетку диаметром 70-80 А с впадиной в центре диаметром 25 А. Пять субъединиц организованы псевдосимметрично вокруг оси, направленной через ионную пору перпендикулярно липидной мембране (Kistler et al., 1982; Toyoshima, Unwin, 1990). Эта розетка формируется внеклеточными гидрофильными доменами рецептора, содержащими N- и С-терминали (рис. 2). N-терминаль каждой субъединицы формируется примерно 210 аминокислотами и выступает примерно на 60-70 А из мембраны. В N-терминалях а-субъединиц существует основная иммуногенетическая область (примерно 67-76 остатков), которая является центром связывания для больше чем 60 % антител, направленных против белка нАХР в аутоиммунной болезни миастения Гравис (Contironconi et al., 1994). Наблюдаемое центральное углубление во внеклеточной области также называется преддверием, в глубине его расположен вход в ионную пору. Стенка каждой ионной поры формируется М2 трансмембранными доменами каждой субъединицы. Другие трансмембранные домены мышечного АХР контактируют с липидной мембраной, наиболее гидрофобным является домен М4. Домены Ml и МЗ важны для процесса образования нАХР (Wang et al., 1996) и нормальной работы канала (Campos-Саго et al., 1997) соответственно. На поверхности нАХР, плотно контактирующей с липидной мембраной, идентифицированы две хорошо различимые области связывания: кольцеобразный липидный домен и не кольцеобразный липидный домен (Jones, McNamee, 1988). Кольцеобразный липидный домен окружен поясом липидных молекул, прилегающих к врнутримембранному периметру нАХР (Ellena et al., 1983; Jones et al., 1988; Arias et al., 1998). Хотя точные места связывания в некольцеобразном липидном домене неизвестны, предполагается, что они находятся на межмолекулярных поверхностях пяти субъединиц или в промежутках четырех трансмембранных доменов (Ortells, Lunt, 1996; Jones, McNamee, 1988; Narayanswami, McNamee, 1993) возле гидрофильной части нАХР. Длина внутриклеточного гидрофильного домена нАХР, основной цитоплазматической петли, равна 15-20 А и содержит, в зависимости от субъединицы, 109-142 аминокислоты. В случае мышечного типа АХР, эта петля содержит область, которая нековалентно взаимодействует с периферическим мембранным белком рапсином. Этот белок участвует в упаковке рецепторов в кластеры и во взаимодействии рецептора с цитоскелетом (Philips et al., 1991). Цитоплазматический домен содержит один тирозиновый сайт фосфорилирования на р, у и 8 субъединицах (Wagner et al., 1991). Поскольку тирозиновое фосфорилировние вовлечено во внутренние процессы десенситизации (Hopfield, 1988), а некоторые молекулы неконкурентных ингибиторов увеличивают скорость десенситизации АХР с одновременным ингибированием ионного канала, предполагают, что неконкурентные ингибиторы могут модулировать процесс десенситизации через фосфорилирование нАХР.
Использование методов математического моделирования при изучении механизмов постсинаптического электрогенеза
Для описания реакций взаимодействия АХ с рецепторами используется следующя кинетические схемы (Colquhoun, Hawkes, 1977): где A - молекула ацетилхолина, R - рецепторно-канальный комплекс, AR — комплекс одной молекулы АХ с рецепторно-канальным комплексом, A2R — комплекс двух молекул АХ с рецепторно-канальным комплексом, A2R — рецепторно-канальный комплекс в открытом состоянии, возле переходов между состояниями в схеме указаны константы скоростей соответствующих реакций. Математическое моделирование процессов, лежащих в основе функционирования нервно-мышечного синапса, началось вскоре после начала электрофизиологических исследований этого механизма. В 1972 году Magleby и Stevens предложили выражение, описывающее временной ход тока концевой пластинки: где W(t) = yc(t)-N/(K+c(t)), g(t) - проводимость постсинаптической мембраны; c(t) - локальная концентрация ацетилхолина; N — количество рецепторов в области активной зоны; К = k+/k. - константа равновесия реакции связывания АХ с рецептором; а, (3, к+, к. - соответствующие константы скоростей реакций. Таким образом, временной ход ТКП может описываться формулой (Dionne, Stevens, 1987): где V — мембранный потенциал, Veq - потенциал равновесия, п - степень кооперативности связывания АХ. Модель позволила описать ряд важных особенностей ТКП: 1) экспоненциальность большей части спада ТКП; 2) потенциалзависимость константы скорости спада; 3) спектр флуктуации проводимости постсинаптической мембраны при действии на ней АХ. Данная модель использовалась при анализе потенциалзависимости амплитуды и постоянной времени спада ТКП в норме и после фармакологических воздействий, изменяющих чувствительность кинетических констант АХР к изменению мембранного потенциала (Магазаник и др., 1976; Снетков, 1977). Появившиеся в 1979 году практически одновременно работы Wathey et al. и Rosenberry дали принципиально новый, качественный скачок в этом направлении исследований. Это было обусловлено двумя причинами. Во-первых, к этому времени значительно увеличился запас знаний, накопленных в электрофизиологических, гистологических, биохимических экспериментах относительно геометрии и топологии синапса, амплитудно-временных характеристик токов концевой пластинки и их зависимости от различных фармакологических агентов.
Была экспериментально подтверждена везикулярная теория освобождения ацетилхолина, получены значения для некоторых кинетических констант, плотности и распределения холинорецепторов на постсинаптической мембране и ацетилхолинэстеразы в синаптической щели. Во-вторых, развитие электронно-вычислительной техники дало возможность решать более сложные системы уравнений, описывающие процессы, происходящие в нервно-мышечном синапсе. Однако уже авторы первых работ по моделированию столкнулись с противоречием между техническими возможностями существующих ЭВМ и количеством различных процессов, вносящих вклад в формирование синаптических токов, то есть сразу же возникла проблема: какими факторами, участвующими в генерации синаптических токов, можно пренебречь и какие, наоборот, являются существенными. Так, в работе Rosenberry (1979) обсуждается возможность применения двух моделей. Первая предполагает, что ацетилхолин, холинэстераза и холинорецепторы равномерно распределены в синаптическои щели в течение всего времени формирования синаптического ответа. Такая модель позволяет корректно воспроизвести фазу спада постсинаптического тока и ее зависимость от некоторых факторов, однако точное воспроизведение амплитуды сигнала и его переднего фронта потребовало от авторов усложнения этой модели. Второй вариант модели предполагает наличие двух "критических" зон в синаптическои щели. АХ изначально равномерно распределен в первичной зоне, прилегающей к месту освобождения кванта, а затем диффундирует в остальные участки синаптическои щели. При этом плотность холинорецепторов на постсинаптической мембране также различна в "первичной" и "вторичной" зонах. Диффузия АХ из "первичной" зоны аппроксимируется радиальной диффузией с цилиндрической поверхности. Диффузия между пре- и постсинаптическими мембранами не учитывается. Для описания реакций взаимодействия АХ с рецепторами использовалась схема (1). Данная схема может быть заменена более простой:
Статистическая обработка и анализ
Запись постсинаптических токов осуществлялась с применением стандартной методики двухэлектродной фиксации потенциала (Волкова и др., 1975). Концевые пластинки внутримышечной части нерва определялись визуально. ТКП вызывались раздражением двигательного нерва с различными межимпульсными интервалами. Внутриклеточные электроды заполнялись 2.4 моль/л КС1 и имели сопротивление 3-=-5 МОм. Микроэлектроды изготавливали из трубок диаметром 1.5-=-1.8 мм, содержащих микрокапилляры, на полуавтоматической кузнице МЭ-2. Во время эксперимента потенциал мембраны поддерживался на заданном постоянном уровне током, протекающим через токовый электрод. Если этот ток превышал 200 нА, то этот эксперимент не участвовал в анализе. Записываемые данные были оцифрованы с частотой 50 кГц. ТКП и мТКП анализировали с помощью оригинальной программы, созданной в нашей лаборатории. Обычно для нахождения средних величин амплитуд, времени роста (от 10 до 90 %) и константы времени спада усреднялось 40-50 мТКП или 8-12 ТКП. При регистрации мТКП порог устанавливали на уровне, в 1.5-=-2 раза превышающем шум. Каждый сигнал также визуально контролировался для предотвращения влияния шума на анализ. Все данные представлены как средняя величина ± стандартная ошибка (n = число синапсов), со статистической значимостью, которая оценивалась с помощью парного теста Стьюдента (для параметрических величин).
Статистическая значимость оценивалась в программе SigmaStat, величина Р 0.05 показывает статистически значимые различия. Для вычисления концентрации вещества, которая вызывает падение амплитуды на 50 %, использовалось уравнение Хилла: где 1ь и 1с - амплитуды токов под действием блокатора и в контроле, [В] — концентрация вещества, и пн - коэффициент Хилла. Для оценки падения амплитуды при 0 мВ Моделирование основано на стандартной теории кинетики активации рецептора в ответ на связывание агониста (Colquhoun, Hawk.es, 1977). Предполагается, что эта теория может быть применима для кинетики связывания антагониста в присутствии агониста. Учитывая закон сохранения масс, мы записывали систему дифференциальных уравнений по аналогии с методикой, используемой Chretien и Chauvet (1998): где Р — вектор, составленный из вероятностей нахождения рецептора в каждом состоянии во время t,aQ- матрица переходов между состояниями. Для сравнения смоделированных ответов с экспериментальными данными мы вычисляли суммарные токи через ионные каналы нАХР по формуле: где V — мембранный потенциал (мВ), N - общее число каналов, Рореп — вероятность открытого состояния канала, а - проводимость одного канала. Было предположено, что а является константой (а = 25 пС; Colquhoun, 1981). Адекватность смоделированных ответов полученным экспериментальным данным оценивалась на глаз. Хлоргексидин в концентрации 5 мкмоль/л при редких раздражениях двигательного нерва (0.05 имп/с) вызывал снижение амплитуды и постоянной времени спада ТКП до 34.2±7.3% и 53.5±3.2% (п = 10, РО.05) соответственно (рис. 5). Амплитуда и постоянная времени спада переставали меняться через 20-25 мин после подачи хлоргексидина. В диапазоне 1-И5 мкмоль/л наблюдалось дозозависимое снижение амплитуды и постоянной времени спада хлоргексидином (рис.6.). Аппроксимация усредненной кривой доза-эффект для амплитуды ТКП уравнением Хилла позволила установить значения IC50, составившее 4.7 мкмоль/л при -70 мВ, и Пн, равное 0.9; последнее свидетельствует о том, что действие на холинорецептор производится одной молекулой хлоргексиидина.
Частичное разблокирование рецепторов с помощью предварительной активации карбахолином
Так как есть предпосылки того, что хлоргексидин относится к блокаторам открытого канала ловушечного типа, то можно было ожидать, что его эффект должен быстро устраняться в условиях постоянной активации холинорецептора. Поэтому мы провели серию экспериментов с использованием холиномиметика карбахолина. Надо отметить, что сам карбахолин снижает амплитуду ТКП, но его эффект относительно быстро отмывается. Через 35 минут после начала действия хлоргексидина в концентрации 10 мкмоль/л и выхода амплитудно-временных параметров ТКП на стационарный уровень в течение 20 минут препарат отмывали физиологическим раствором с добавлением карбахолина в концентрации 2 мкмоль/л, (это вызывало дополнительное падение амплитуд ТКП), после чего препарат отмывали нормальным физиологическим раствором.
Мы не обнаружили ожидаемого быстрого восстановления параметров до контрольного уровня и не наблюдали увеличения отмывки (рис. 9). Были также проведены эксперименты, в которых хлоргексидин подавался на фоне предварительной активации рецепторов карбахолином, причем в этом случае его эффект развивался быстрее (рис. 10). Это говорит в пользу того, что хлоргексидин относится к блокаторам открытого канала. Изучение потенциалзависимости эффекта веществ дает важную информацию о характере их действия на ионные каналы. Зависимость изменения амплитуд мТКП от уровня мембранного потенциала имела в контроле линейный характер с коэффициентом наклона 0.05±0.004 нА/мВ. На фоне аппликации 2 мкмоль/л хлоргексидина зависимость сохраняла линейный характер, но с коэффициентом наклона 0.02±0.005 нА/мВ (рис.11) что позволяет говорить о наличии изменений вольтамперных характеристик, характерных для блокаторов открытого канала. Изменение постоянной времени спада при изменении мембранного потенциала носило экспоненциальный характер с коэффициентами 208.19 мс/мВ в контроле и 38.196 мс/мВ под действием хлоргексидина; такое ослабление потенциалзависимости также характерно для действия медленных блокаторов открытого канала. В действии хлоргексидина наблюдаются многие признаки, характерные для блокаторов открытого канала, но одним из основных свойств последних является быстрая отмывка, чего в случае с хлоргексидином не наблюдается. Медленная отмывка характерна для блокаторов открытого канала с ловушечным механизмом действия, но для них отмывка резко ускоряется экзогенным агонистом, чего также не наблюдается в случае хлоргексидина.
Трудно предположить, что нетоксичное, широко применяемое лекарственное вещество может необратимо связываться с ионным каналом, поэтому мы выдвинули гипотезу о том, что амфифильный хлоргескидин может оказывать аллостерическое воздействие на рецепторно-канальный комплекс, предварительно растворяясь в окружающей его липидной мембране, выход из которой назад в водную фазу в этом случае будет затруднен. То есть хлоргексидин обладает сложным механизмом действия, первым компонентом которого является аллостерическая модуляция рецепторно-канального комплекса растворенным в его липидном окружении веществом, а вторым - блокада открытого канала. Для косвенной проверки этой гипотезы были проведены эксперименты, в которых хлоргексидин в концентрации 10 мкмоль/л подавался на фоне установившихся параметров ТКП на время, которое необходимо для того, чтобы развился его эффект, однако при этом мы отключали стимуляцию нерва. Мы исходили из предположения, что если хлоргексидин является блокатором открытого канала, то никакого значительного снижения параметров наблюдаться не будет, так как нет активации рецепторов, а следовательно - нет и каналов в открытом состоянии. Однако в результате экспериментов мы получили снижение амплитуды до 54.4±1.5%, а времени спада до 62.2±10.4%, причем после включения стимуляции параметры снижались до тех же значений, что и в экспериментах без отключения стимуляции. Для сравнения, при непрерывной стимуляции хлрогексидин в этой же концентрации снижал эти параметры до 34±7% и 53±2.9% (рис. 12), то есть в отсутствие стимуляции эффект хлоргексидина развивался на 70-80% от его значения при стимуляции нерва. Следовательно, основным механизмом действия хлоргексидина является не блокада открытого канала, а аллостерическая модуляция, осуществляемая через внеканальные места посадки на рецепторно-канальном комплексе.
Похожие диссертации на Механизмы модуляции работы никотинового рецепторно-канального комплекса хлоргексидином
