Введение к работе
Актуальность проблемы. Хемиосмотический принцип
энергетического сопряжения окисления и фосфорилирования предполагает существование белковых генераторов электрического тока . Выяснение молекулярных механизмов образования трансмембранпой разности потенциалов (Ау) на сопрягающих мембранах является одной из центральных и наиболее актуальных задач современной биоэнергетики. Функцию преобразования энергии из одпой формы в другую осуществляют мембранные белки-генераторы, перенося заряды по электрон-транспортным цепям (ЭТЦ). Одним из таких генераторов трансмембранного потенциала является убшагаол.-цитохром с-оксидоредуктаза (bci-комплекс). В настоящее время установлено значительное сходство между бактериальным и мнтохондриальным bcf-комплексом. В связи с этим исследояание бактериального bcj-комплекса весьма актуально для выяспення механизмов функционирования соответствующего пигмент-белкового комплекса митохондрий.
Цитохромный Ьс^-комплекс хроматофоров содержит один апопротеид с двумя гемами типа Ь (высокопотенциальным - bn и низкопотенциальным - Ь[), один цитохром типа с (cf) и белок 2Fe2S (FeS-центр Риске). Согласно модели Q-цикла с работой bej -комплекса связаны два раздельных каталитических сайта : сайт Z , в котором убихннол окисляется белком 2Fe2S и цитохромом Ь\; сайт С , где хішон восетанавлішаетея цитохромом bj, (в митохондриях это сайты "о" и "і", соответственно).
В свете представления о трапемембранном расположении редокс-нереносчиков Ьс^-комплекса значительный интерес представляет изучение электрогенных стадий при переносе зарядов в комплексе. Для выяснения природы и механизмов элсктрогенпых реакций Ьс^ -комплекса был примепен прямой электрометрический метод регистрации образования Ду на сопрягающих мембранах, разработанный в лаборатории новых физических методов НИИ Физико-Химической Биологии им. А.ІІ. Белозерского МГУ. Кроме этого, остается не до конца решенным вопрос о расположении редокс-центров в bcf-комплексе. Не существует прямых доказательств участия FeS-центра Риске в переносе электронов в убихинол.-цитохром с-оксидоредуктазе. Эти и ряд друпгх вопросов делают важным и актуальным исследование цитохромного bej-комплекса. Изучение молекулярных механизмов переноса зарядов в белках-генераторах трансмембранного потенциала вносит значительный вклад в область классических фундаментальных исследований в биохимии.
Целью настоящей работы было выяснение молекулярных механизмов переноса зарядов на высокопотенциальпом участке цени цитохромного Ьса-комплекса. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать спектральные и термодинамические свойства железо-сериого
кластера (FeS-центра Риске) в цитохромном bcj-комплексе;
2. Использовать метод светозависимого химического восстановления
цитохромов для изучения восстановления цитохрома с\ в митохондриальном bej-
\
комплексе посредством фотовозбуждешшго редокс-краситсля
феназинметосульфата (ФМС).
3. Установить роль FeS-центра Риске в процессе переноса зарядов в
цитохромном bcj-комплсксс. Изучить равновесие между железо-серным белком
Риске и цитохромом сі-
4. Выявить электрогенные стадии при переносе зарядов на
высокопотенциальцом участке ЭТЦ цитохроміюго Ьсі-комшіекса.
5. Соотнести стадии фотоэлектрического ответа с топологией редокс-центров
в bcj-комплёксе и описать схему электрогенных реакций в убихинол:цитохром с-
оксидореду ктазе.
Научная новизна работы. С помощью кругового дихроизма (КД) показано, что хромоиовый ингибитор стигмателлин полностью восстанавливает FeS центр Риске в митохондриальиом Ьсркомплексе. Использование спггмателлина позволило впервые выявить в спектре поглощения цитохроміюго bci-комплекса полосу, связанную с восстановлениым FeS центром Риске.
В работе впервые использован метод фотохимического восстановления
цитохрома Cj в митохондриальиом bci-комплексе. Показано, что нейтральная
семихинонная форма красителя феназинметосульфата (ФМС-SQ) является
непосредственным донором электронов на цитохром Сі- Добавление
стигмателлина к митохондриальному Ьсі-комплексу приводило к увеличению
степени светозависимого восстановления цитохрома Сі посредством
фотовозбужденного ФМС на 30% . На основе полученных данных посчитана величина среднеточечиого потенциала E'j для FeS центра Риске. Согласно этим расчетам FcS-Риске находится в быстром равновесии с цитохромом Cj и перенос электрона между железо-серным кластером и цитохромом сі - термодинамически выгодный процесс, хотя константа равновесия реакции не превышает 2.
Для исследования электрогенных процессов в bcj-комплексе был использован прямой электрометрический метод регистрации трансмембранного потенциала. Исследование хроматофоров, выделенных из мутантных штаммов HliiN, E295Q фотосинтезируюгдих бактерий Rhodobacter sphaeroides с точечными заменами аминокислот в цитохромном bci-комплексе позволило выявить электрогенную стадию, обусловленную депротонированием убихинола в убихинол-оксидазном сайте Z. С помощью светозависимого химического восстановления цитохрома сі в митохондриальиом Ьс^комплексе получены данные, согласно которым гем с4 погружен в диэлектрический слой мембраны.
В заключение предложены схемы расположения редокс-цептров в цитохромном Ьсгкомплексе .
Практическое значение работы. Полученные результаты существенно дополняют современные знания о свойствах и механизме функционирования цитохроміюго bci-комплекса и могут найти применение в исследованиях дыхательной и фотосинтетической редокс-цепей. Все изложенные экспериментальные данные получены впервые. Они открывают широкие
перспективы для дальнейших исследований структурно-функциональных особенностей цитохромного Ьс^-комплекса.
Изучение КД-спсктроскопин FeS-цснтра Риске открыло широкие возможности для дальнейших исследований железо-серного белка Риске. Принципиально новым подходом является использование хромонового ингибитора стигмателлина для полного восстановления FeS-Риске. Этот подход также в будущем позволит изучать с помощью КД-спектроскошш с высоким разрешением кинетику переноса электрона между FeS-центром Риске и цитохромом cj .
Метод светозависимого химического восстановления растворимых цитохромов, впервые использованный в работе для восстановления цитохрома с{ в митохондриальном Ьс{-комплексе посредством фотовозбужденного редокс-красителя ФМС, в дальнейшем можпо использовать для исследования молекулярных механизмов переноса зарядов в bgf-комплексе высших растений. Применение ФМС в качестве допора электронов для цитохрома cj позволит в дальнейшем более широко использовать другие активируемые светом красители для инициирования восстановления и окисления различных цитохромов. Наконец, использование ФМС открывает возможности для дальнейшего более детального изучения электрогенеза, как в митохондриальном bcj-комплексе, так и в bgf-комплексе высших растений.
Экспериментальные данные, полученные в работе имеют важное научное значение. На основе полученных данных предложены схемы относительного расположения редокс-перепосчикоп в цитохромном Ьсх-комплексе. Полученные результаты можно использовать в качестве лекционного материала.
В настоящее время с помощью рептгеиоструктурного анализа расшифрована структура bcj-комплекса. Сопоставление данных, полученных с помощью методов, используемых в работе , с результатами рентгеноструктурного анализа позволит в дальнейшем определить изменение диэлектрической постоянной (Дс) внутри цитохромного bcf-комплекса.
Исследование механизмов окисления убихинола может иметь значение для медицинских исследований различных генетических заболеваний, связанных с нарушениями окисления QH2-
Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на городском семинаре по биоэнергетике в НИИ физико-химической биологии им, А.Н. Белозерского МГУ (Москва, 1994, 1995). Результаты также были представлены на мини-симпозиуме по биохимии (Оспабрюк, Германия, 1994); на Х-ой Международной Харденовской конференции "Биологический перенос электронов и протонов" (Эшфорд, Апглия, 1994); на Х-ом Международном Конгрессе по Фотосинтезу (Монпелье, Франция,1995); на конференции "Цктохромный Ьбі-комплекс- перенос электронов, трапелокация протонов и редокс-рецепция" (Регенсбург, Германия, 1996); на 9-ой Европейской Биоэнергетической конференции (Лувен-ла-Нсв, Бельгия, 1996).
Публикации. По материалам исследований опубликованы 5 печатных работ, 1 работа находится в печати.
Стриктура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследовашш, изложения
результатов, их обсуждения, выводов, списка используемых в работе сокращений, приложения и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2-мя таблицами и 35-ью рисунками.
