Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Хитин 12
1.1.1. Распространение хитина в природе 12
1.1.2. Химическая природа и физико - химические свойства хитина 15
1.1.3. Получение хитина из природных источников 18
1.1.4. Биосинтез хитина 19
1.1.5. Биологическая активность хитина и его соединений 21
1.2. Хитиназы 23
1.2.1. Первые этапы изучения бактериальных хитиназ 23
1.2.2. Общие свойства хитиназ 24
1.2.3. Распространение хитиназ в природе 26
1.2.4. Выделение хитиназ 27
1.2.5. Измерение активности хитиназ 29
1.2.6. Строение и классификация хитиназ 31
1.2.7. Происхождение, классификация и строение растительных хитиназ 32
1.2.8. Происхождение, классификация и строение бактериальных хитиназ 36
1.2.9. Строение и каталитическая активность хитиназ 38
1.2.10. Регуляция активности генов хитиназ з
1.2.11. Хитиназы микроорганизмов рода Vibrio 41
1.2.12. Ингибиторы хитиназ 47
1.2.13. P-N-ацетилглюкозаминидазы (хитобиазы) и их свойства
1.2.14. Деацетилазы и их свойства
1.3. Применение хитина и хитиназ
1.4. Краткая характеристика бактериального рода Vibrio S7
Глава 2. Материалы и методы Я7
2.1. Среды и реактивы СП
2.2. Бактериальные штаммы СП
2.3. Определение концентрации Сахаров
2.4. Приготовление субстратов для ферментативных исследований...
2.5. Определение концентрации белка
2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях
2.7. Измерение деацетилазной активности
2.8. Определение оптической плотности (ОП)
2.9. Приготовление сред для культивирования /ГН
2.10. Приготовление буферов
2.11. Тонкослойная хроматография (ТСХ) 70
2.12. Ионообменная хроматография 70
2.13. Гидрофобная хроматография 70
2.14. Гель-фильтрация 70
2.15. Культивирование микроорганизмов 71
2.16. Определение ферментативной активности 71
2.17. Определение фунгициднои активности 4
Глава 3. Экспериментальные результаты 72
3.1. Сравнение результатов, полученных при калибровке различных колориметрических методов определения концентрации Сахаров 72
3.2. Выбор способа измерения хитиназнои активности 73
3.3. Vibrio sp. X его выделение и идентификация хитиназнои активности 74
3.4. Таксономия и морфологические характеристики исследуемого штамма 76
3.5. Рост Vibrio sp. X на синтетической среде 78
3.6. Особенности культивирования Vibrio sp. X 79
3.7. Рост на крахмале и накопление амилазной активности 84
3.8. Деацетилазная активность 85
3.9. Рост на других субстратах 3.10. Устойчивость к антибиотикам 86
3.11. Получение ферментативного препарата 87
3.12. Анализ белков культуральнои жидкости Vibrio sp, X 88
3.13. Выделение хитиназы В 89
3.14. Выделение хитиназы А "3
3.15. Состав белков культуральнои жидкости при выращивании Vibrio sp. X на различных средах 95
3.16. Выделение хитиназ С и D ""
3.17. Свойства хитиназ Vibrio sp. X &2
3.17.1. Зависимости активности от температуры, рН и ионной силы среды 102
3.17.2. Влияние различных ионов на активность ферментов
3.17.3. Действие ферментов на различные субстраты Ю6
3.18. Анализ продуктов гидролиза хитина хитиназами Vibrio sp. X... Ю8
3.19. Совместное действие хитиназ И 3.20. Индукция хитиназного регулона И4
3.21. Фунгицидная активность Vibrio sp. X И6
3.22. Сравнение Vibrio sp. X с Serratia marcescens и оценка его перспектив как продуцента хитиназы 119
Глава 4. Обсуждение результатов 121
4.1. Сравнение выделенных хитиназ с другими хитиназами Vibrio 121
4.2. Изменение рН ростовой среды в процессе культивирования 123
4.3. Изменение спектра синтезируемых хитиназ с течением времени.. 125
4.4. Влияние начального рН ростовой среды на индукцию хитиназного комплекса Vibrio sp. X 127
4.5. Построение математической модели роста Vibrio sp. X и накопления ферментативной активности 129
4.6. Перспективы использования Vibrio sp. X как продуцента
хитиназы 133
Заключение 135
Выводы 136
Список литературы
- Химическая природа и физико - химические свойства хитина
- Определение концентрации Сахаров
- Выбор способа измерения хитиназнои активности
- Изменение рН ростовой среды в процессе культивирования
Химическая природа и физико - химические свойства хитина
Химический синтез хитина является весьма трудоемким и, на сегодняшний день, представляется экономически нецелесообразным. Поэтому основным источником получения хитина являются панцири ракообразных, которые в большом количестве накапливаются как побочный продукт морского промысла. Для выделения хитина пользуются его нерастворимостью и большой химической стойкостью, переводя в раствор сопутствующие компоненты сырья. Так панцири крабов или омаров, содержащие до 25% хитина, деминерализуют разбавленной соляной кислотой, белки растворяют в Ц горячей щелочи. Отбеливание хитина проводят перекисью водорода (Н2О2). Более мягкие условия выделения заключаются в деминерализации хелатообразующими соединениями и обработке окислителями при нейтральных рН. Полученный таким образом хитин имеет степень полимеризации порядка нескольких тысяч. Менее распространена I ферментативная депротеинизация кутикулы [Gagne, Simpson, 1993].
Коллоидный хитин представляет собой осажденную из раствора концентрированной кислоты суспензию набухшего аморфного хитина. Для препаративного получения хитоолигосахаридов разработаны методы, включающие процессы частичного кислотного гидролиза, сольволиза жидким HF и ферментативного расщепления. Проводятся опыты по использованию в качестве источника хитина специально культивируемых организмов: личинок мух и пресноводного планктона (дафний) [EUCHIS 95, 1995]. Предлагается использовать в качестве источника хитина отходы ряда микробиологических производств, например мицелий Aspergillus niger, остающийся после выделения из культуральной жидкости лимонной кислоты. В Японии производится сейчас 700-1000 тонн хитина в год. Хитозан получают щелочной обработкой или ферментативным деацетилированием. В зависимости от условий деацетилирования могут быть получены ; гомогенно или гетерогенно деацетилированные продукты со значительно отличающимися свойствами.
Для получения полностью деацетилированного хитозана необходимо применение очень жестких условий деацетилирования. Химический способ подразумевает сплавление хитина с твердым КОН при 180 С [Бемиллер, 1967]. Хитоолигосахариды различной степени полимеризации получают в препаративных количествах, частичным гидролизом хитина концентрированной НС1 с последующим разделением продуктов реакции при помощи ионообменной хроматографии на целите [Rupley, 1964].
Ниже приведены стадии биосинтеза хитина в клетках Aspergillus niger. У других организмов, в состав которых входит хитин, этот процесс существенно не отличается [Феофилова, 1983]. 1. Из фруктозо-6-фосфата синтезируется глюкозамин-6-фосфат. Реакция катализируется ферментом глюкозаминфосфатизомеразой. Донором аминогруппы является аммоний или глутамин. 2. На глюкозамин-6-фосфат переносится ацетильная группа Ас-СоА с образованием N-ацетилглюкозамин-б-фосфата. Реакция катализируется ферментом фосфоглюкозаминтрансацетилазой. » 3. Из N-ацетилглюкозамин-б-фосфата и уридинтрифосфата синтезируется уридиндифосфат- N- ацетилглюкозамин с высвобождением двух фосфатов. 4. Фермент хитинсинтаза (ЕС 2.4.1.16) наращивает растущую цепь хитина с 4 конца. При этом отщепляется уридиндифосфат.
Как правило, биосинтез хитина происходит в особых клеточных органеллах-хитосомах которые локализованы преимущественно вблизи растущего конца грибной гифы. У Aspergillus nidulans обнаружены трансмембранные хитин - синтазы, локализованные в клеточной мембране [Motoyama et al, 1994; Motoyama, 1994]. При этом различные хитин - синтазы выполняют различные функции.
В клетках Saccharomyces cerevisiae обнаружены три плазматических хитин-синтазы. Продукт гена ch2 участвует в образовании первичного отверстия (септы) между материнской и отпочковывающейся дочерней клетками, продукт гена chl репарирует клеточную стенку дочерней клетки, деградированную хитиназами в процессе разделения клеток, продукт гена ch3 образует более 90% хитина входящего в состав клеточной . стенки [Motoyama, Sudoh, 1994]. Хитозан, входящий в состав клеточных стенок некоторых грибов {Rizopus oligospoms, некоторые Zigomicetes) образуется путем
Сделано наблюдение, что индукция растительных хитиназ сопровождается, после непродолжительной лаг-фазы ростом внеклеточного рН на 0,4-0,8 единиц. Авторы делают вывод, что это как-то связано с изменением проницаемости ионных каналов в Ъ клеточной мембране [Fukuda, 1996].
Молекулярные механизмы действия на клетку ацетилированных и % неацетилированных хитиновых соединений принципиально различаются. В первом случае имеет место высоко специфическое взаимодействие с мембранными рецепторами лектиновой природы. Оно проявляется при степени полимеризации выше 3-4. При дальнейшем увеличении степени полимеризации резко снижается концентрация метильные, метилфукозильные и другие группы. В итоге создается большое разнообразие сигнальных молекул на основе продуктов генов nodA, nodB, nodC, которое может определять специфичность взаимодействия бактерии с разными видами растений [Максимов и др., 1997]. Их концентрация крайне мала, активность проявляется уже при I» 10-12М.
Определение концентрации Сахаров
По своей структуре А является негидролизуемым аналогом хитотрисахарида. Ингибирует ферменты по ярко выраженному конкурирующему механизму. Синтезированы различные производные А, значительно отличающиеся от него по своему ингибирующему действию [Terayama et al., 1993; Kinoshita et al., 1993; Kitahara et al., 1993]. Интересно отметить, что сами стрептомицеты синтезируют как А- чуствительные, так и А- нечуствительные хитиназы [Wang et al., 1993].
Ферменты р- N- ацетил - глюкозаминидазы или хитобиазы (ЕС.3.2.1.30) относятся к семейству 20 гликозил- гидролаз. Они гидролизуют N,N-диацетилхитобиозу до N 48 .ацетилглюкозамина. Следует различать собственно хитобиазы и хитиназы, некоторые из которых способны отщеплять моносахар от молекулы олигосахарида. Они отличаются как своими свойствами, так и локализацией (хитобиазы в большинстве случаев содержатся в цитоплазме) в бактериальной клетке. Как правило хитобиазы обладают более широким спектром действия, так что правильнее говорить об Р- гексозаминидазах, которые присутствуют практически у всех живых организмов. Кроме того, эти ферменты демонстрируют высокую степень гомологии. Так Р- N- ацетил- глюкаминидазы Vibrio furnissii и Vibrio harveyi демонстрируют 30-25% идентичность аминокислотной последовательности с Р- гексозаминидазами бактерий, дрожжей, высших грибов и даже млекопитающих [Keyhani, Roseman, 1996; Lovatt, Roberts, 1994; Wu, Laine, 1999]. Между хитобиазами бактериального происхождения степень гомологии еще выше. Так внеклеточная N-ацетилглюкозаминидаза из Enterobacter sp. G-1 идентична хитобиазе Serratia marcescens на 97,3%, ІЯ -диацєтилхитобиазе Vibrio harveyi на 54,4%, N ацетилглюкозаминидазе (Exol) Vibrio furnissii на 42,7% [Matsuo et al., 1999]. Необходимо отметить, что вторичная структура еще более консервативна, чем аминокислотная последовательность. На схеме 6 приведено филогенетическое дерево Р- гексозаминидаз из различных организмов [Wu, Laine, 1999].
Ферменты деацетилазы (ЕС 3.5.1.41) катализируют гидролиз ацетамидных групп полимеров N- ацетил глюкозами на. Впервые деацетилаза обнаружена в грибе Миког гоихи, где она играет ключевую роль в образовании хитозана, входящего в состав клеточной стенки. Такую же функцию выполняет подавляющее большинство известных на сегодняшний день деацетилаз грибного происхождения.
Что касается бактериальных деацетилаз, то следует различать внутри и внеклеточные ферменты. Дело в том, что внутриклеточная N- ацетилглюкозамин- 6-фосфат деацетилаза черезвычайно широко распространена, так как кодирующие её гены входят в состав оперона, отвечающего за использование N- ацетилглюкозамина в . качестве источника углерода. Например nag оперон Е. coli состоит из генов nagE, кодирующего специфический транспортер N- ацетилглюкозамина, nagB кодирующего глюкозамин- 6- фосфат деаминазу, nagA кодирующего N- ацетилглюкозамин- 6- фосфат деацетилазу, nagC кодирующего репрессор nag оперона и nagD функции которого неизвестны. Аналогичный оперон обнарулсен, в частности, и у Vibrio choierae [Yamano et al., 1994; Yamano et al 1996; Yamano et al., 1997].
О структуре и функциях внеклеточных деацетилаз бактерий известно чрезвычайно мало. Так продукт гена nodB клубеньковых бактерий, который обладает деацетилазнои активностью, принимает участие в синтезе молекулы сигнального липохитоолигосахарида [Максимов и др., 1997].
По специфичности действия, известные деацетилазы довольно сильно различаются. Ниже приведены некоторые примеры: 1. Colletotrichium lindemitthiamim. Деацетилаза 31,5 кДа. He активна на Glu-N-Ac. Слабо активна на (GIu-N-Ac)2-3- Сильно активна на (Glu-N-Ac)4-5, которые полностью деацетилирует и на деацетилированном хитине.[Takuyasu et al., 1996]
Показано, что фермент из Rhodococcus rhodochrons способен отщеплять ацетильную группу, прилегающую к открытому фрагменту углеродной цепи молекулы Ph-CHNAc-CH2-COOH в D-, но не в L- форме [Kuboki et al, 1998]. Это позволяет использовать фермент для разделения рацемической смеси соответствующих веществ.
Накапливаясь в большом количестве, как побочный продукт морского промысла, хитин является легкодоступным возобновляемым ресурсом. Во всем мире изучаются возможности его рентабельной утилизации. Эти исследования ведутся в нескольких направлениях. Во-первых, разработаны способы конверсии хитина в ценные питательные , вещества, или другие биотехнологические продукты (например этиловый спирт) [Pranov et al., 1991; Smith et al., 1989]. Схема конверсии состоит в следующем: панцири креветок подвергаются гидролизу хитинолитическими бактериями, а продукты гидролиза хитина используются для роста биомассы дрожжей или сбраживаются в спирт. Во многих биотехнологических процессах может найти применение N-ацетилглюкозамин, как субстрат для роста микроорганизмов, служащий одновременно источником углерода и азота. Исследуются также комбинированные кислотно-ферментативные способы гидролиза хитина [Максимов, Смирнова, 1994]. Во вторых, хитин сам по себе находит применение как нетоксичный, химически стойкий и трудно гидролизуемый аналог целлюлозы. Из хитина делают ткань, волокна, материал для хирургических швов, основу для искусственной кожи применяемой при лечении ожогов, подложки для хроматографии и т. д. Для медицины и биологии представляет интерес свойство хитозана подавлять развитие бактерий и бактериальных вирусов [Sudarshan, Hoover, 1992; Григорьева, Азибекян, 1994]. В России прошел клинические испытания ранозаживляющий препарат «Микоран» на основе грибного мицелия. Содержание Glc-NH2 в нем составляет не менее 8% [Феофилова и др., 1999].
Выбор способа измерения хитиназнои активности
В таблице 15 приведены значения относительных активностей ферментативного препарата и различных хитиназ при действии на коллоидный и молотый хитин, а также микрокристаллическую целлюлозу, хитозан и хитн-гликановый комплекс из клеточной стенки Aspergillus niger.
В отличии от ферментативного препарата чистые хитиназы «В» и «D» практически не способны гидролизовать молотый хитин. Это может служить косвенным подтверждением экзо-механизма действия хитиназ «В» и «D», так как доступность свободных концов молекул у молотого хитина существенно затруднена. Близкие результаты действия ФП и хитиназы «В» на хитозан допускают двойное толкование. Возможно хитиназа «В» способна с некоторой эффективностью гидролизовать деацелированную форму хитина - хитозан, тогда она определяет работу всего хитиназного комплекса в этом случае. Другое объяснение может быть связано с качеством субстрата (хитозана), а именно со степенью деацетилирования хитина, то есть хитиназы работают на тех концах субстрата, которые сохранили исходные ацетильные группы. Как и следовало ожидать, ни чистые ферменты, ни ферментативный препарат не способны гидролизовать микрокристаллическую целлюлозу.
Любопытно также отметить, что по своей эффективности на молотом хитине хитиназа «D» превосходит хитиназу «В» (см табл.15). Возможно этим объясняется тот факт, что при выращивании на средах с молотым хитином в качестве источника углерода, этот фермент обнаруживается в культуральной жидкости раньше других.
Априори молено сказать, что основными продуктами гидролиза хитиш эндохитиназой должны быть олигосахариды со степеныо полимеризации свыше двух Основным продуктом действия экзохитиназ должна быть хитобиоза. Продукты гидролиз? коллоидного хитина хитиназами «А, В, С и D» были проанализированы при помошт тонкослойной хроматографии. Результаты приведены на рисунках 35-37. Видно, что среди продуктов гидролиза хитина хитиназой «В» присутствует в основном хитобиоза (димер N- ацетилглюкозамина) с незначительной примесью N- ацетилглюкозамина, чте соответствует сделанному ранее предположению об экзо- механизме ее действия Основным же продуктом действия хитиназ «А» и «С» являются олигосахариды со степенью полимеризации выше 4-х. Среди продуктов действия хитиназы «А» присутствует хитобиоза в незначительных количествах, что может быть объяснено действием хитиназы «А» на короткие олигосахариды со степенью полимеризации
Среди продуктов гидролиза коллоидного хитина хитиназой «D» преимуществен наблюдается N- ацетилглюкозамин. Присутствие в составе реакционной смеси хитиназь «С» влияет на его количество в сторону увеличения, а также приводит к появлении небольших количеств хитобиозы. При совместном действии хитиназ «В» и «D» основныл продуктом также является N-ацетилглюкозамин, а хитобиозы, продуцируемой хитиназоі «В» при действии в одиночку, среди продуктов гидролиза смесью «В» и «D» практическр не наблюдается. Эти результаты хорошо объясняются в рамках предположений о эндо механизме действия хитиназы «С» и хитобиазной активности хитиназы «D». Однакс следует отметить, что помимо хитобиазной, хитиназа «D» проявляет и заметнук экзохитиназную активность. Как и следовало ожидать относительная активность хитиназ экзо - действия на молотом хитине по сравнению с активностью на коллоидном значительно ниже, чем у эндохитиназ.
Прежде всего, выяснили, что полученный белок, названный нами хитиназой «А» пр совместном действии его на хитин с хитиназой «В» значительно увеличивает активност смеси по сравнению с суммой их активностей при раздельном действии на тот же субстра (рис 38).
Видно, что на порошковом хитине эффект проявляется ярче, чем на коллоиднол Так как мы считаем, что хитиназа «А» относится к эндохитиназам - это предсказуемые результат. Действительно, получение коллоидной формы связано с кислотной обработкоі порошкового хитина [Balasubramanian, Manocha, 1992], что является источникол увеличения концентрации концевых группировок в результате частичного химического гидролиза полисахарида, и зависимость действия хитиназы «В» от активносте эндохитиназы на этом субстрате естественно снижается. Некоторое уменьшение величинь приращения активности с увеличением объемного соотношения аликвот фракций «А»
Содержание белка и активности в пробах: "хитиназа А"- 0,095 мг/мл, белка с активностью 1,22 ед/мл и уд. активностью 12,9 ед/мг; "хитиназа В"- 0,38 мг/мл белка с активностью 56,4 ед/мл и уд. активностью 148 ед/мг.
Так как очищенные экзохитиназы «В» и «D» практически не активны в отношении порошкового полисахарида, то его эффективный гидролиз может осуществляется только при наличии эндохитиназ в реакционной смеси. Естественно, что в составе исходного препарата (сконцентрированной КЖ) есть ферменты, обладающие эндохитиназной активностью, поэтому он активен в отношении порошкового хитина.
По нашему мнению близкие значения относительных активностей на молотом хитине (таблица 15) для ферментного препарата и хитиназ «А» и «С» не случайны, так как скорость всего процесса гидролиза хитина зависит от эффективности действия эндохитиназы. Действительно, когда концентрация субстрата не лимитирует процесс и отсутствует эффект ингибирования субстратом, то ферментативная реакция идет с максимальной скоростью и, очевидно, скорость процесса будет определять эндохитиназа, если скорость ее действия будет выше или сравнима со скоростью действия экзохитиназ. Но она же будет определять скорость процесса и в том случае, если скорость отделения концевых Сахаров экзохитиназами будет много выше скорости образования концевых участков эндохитиназой. А именно, после использования всех концевых участков коллоидного хитина для своего действия в начальной стадии реакции, дальнейший его гидролиз экзохитиназами опять же будет зависеть от активности эндохитиназы, то есть от скорости образования концевых участков. То, что эффект усиления активности смеси двух хитиназ (рис. 38, табл. 17, 18) значительно усиливается при их действии на молотый хитин, подтверждает сделанное предположение.
В таблицах 11 и 12 приведены результаты экспериментов по измерению усиливающего эффекта на коллоидном и молотом хитине, с участием всех четырех обнаруженных хитиназных ферментов Vibrio sp. X. Характеристики использованных препаратов хитиназ приведены в таблице 16.
Изменение рН ростовой среды в процессе культивирования
Накопление хитиназной активности при росте Vibrio sp. X значительно меняется в зависимости от начального значения рН ростовой среды (рис 15). При переходе рН среды от 6 к 7 зависимости выхода хитиназной активности в ростовую среду претерпевают качественные изменения. При рН 7 и 8 по сравнению с ростом при рН 6, концентрации бактерий в стационарной фазе практически равны, но рост биомассы сопровождается накоплением хитиназной активности, которая достигает в максимуме 30-40 ед/мл. При рН-6 концентрация клеток в стационарной фазе примерно такая же, как и при рН 7 и 8, однако накопление активности хитиназы значительно отстает от роста биомассы; более того, в максимуме она достигает только 3-4 ед/мл. За время наблюдения она быстро снижается почти до нуля (рис 15). Похожие результаты были получены при выращивании Vibrio sp. X на 0,2% коллоидном хитине (рис 11).
Необходимо отметить, что по нашим наблюдениям при выращивании на средах с глюкозой Vibrio sp. X в процессе интенсивного роста снижает концентрацию глюкозы в миллилитре культуральной жидкости за сутки на 1,5 мг (около 10 мМ). Следовательно, уровень хитиназной активности в 4-5 ед/мл является вполне достаточным для обеспечения растущей бактерии питательными веществами, так как активность в 1 ед/мл активности препарата хитиназы за сутки генерирует необходимые сахара в количестве порядка 0,5 мг/мл. Уровень же в 30-40 единиц является явно избыточным, даже с учетом того, что гидролизу подвергается не коллоидный, а кристаллический хитин, что подтверждается накоплением в ростовой среде свободных
Сахаров, концентрация которых на третьи сутки культивирования достигает 0,1% (по N ацетилглюкозамину). Этот результат можно объяснить в рамках двух предположений.
Первое: известно, что Vibrio sp. X секретирует в среду фермент деацетилазу, который деацитилируя хитин переводит его в хитозан и(или) деацетилированные хитоолигосахариды. Необходимо также иметь в виду, что при рН выше нейтральных, которые устанавливаются в культуральной жидкости, растворимость даже частично деацетилированных хитоолигосахаридов резко снижается [Максимов и др.. 1997]. Выпадая в осадок, они могут становиться труднодоступными для действия экзоферментов, в результате чего концентрация их субстрата (олигосахаридов) в растворе будет значительно снижена по сравнению с ожидаемой исходя из уровня активности эндоферментов. Это необходимо учитывать при рассмотрении механизма действия хитинолитического комплекса.
Установлено, что Vibrio sp. X не может использовать хитозан в качестве ростового субстрата (пп. 3.9.).
Большинство хитиназ являются индуцибельными ферментами. Индуцировать их могут водорастворимые хитоолигосахариды со степенью полимеризации 2- 4 (продукты частичного гидролиза хитина). Известно, что имеется также механизм обратной связи; когда концентрация индуктора превышает некую максимальную концентрацию, синтез фермента прекращается за счет катаболитной репрессии. Возможной причиной гиперпродукции хитиназы в нашем случае может являться подавление механизма обратной связи при рН ростовой среды выше 6. В этих условиях образующиеся частично деацетилированные хитоолигосахариды выпадают в осадок и перестают быть ростовым субстратом. В результате концентрация хитоолигомеров (индукторов хитиназы) может не достигать пороговой концентрации, после которой прекращается синтез хитиназ.
Другим возможным объяснением увеличения хитиназной активности может быть подавление активности хитиназ при переходе рН среды от 6 к 7. Однако это предположение экспериментально не подтверждается (рис 29-32). Активность ферментативного препарата в интересующем нас диапазоне значений рН меняется незначительно (рис 30). Эффективность же действия эндохитиназ «А» и «С» на молотый хитин значительно увеличивается при росте рН (рис 29, 31). Именно действие эндохитиназ на нерастворимый субстрат определяет скорость всего процесса гидролиза молотого хитина, то есть концентрация продуктов гидролиза за счет этого механизма может только возрасти.
Так как исследуемый микроорганизм привлек к себе внимание как перспективный продуцент хитинолитических ферментов, для оптимизации биотехнологических процессов представлялось полезным построение математической модели роста клеток и накопления ферментативной активности Vibrio sp. X. Эта модель должна отражать особенности исследуемого штамма Vibrio sp. X. За основу была взята кинетическая модель роста клеточной популяции, описываемая уравнением Ферхюльста: где через N выражена концентрация бактериальных клеток, а через \i удельная скорость роста биомассы. Значение Nmax известно из экспериментов и составляет около 510 мл" . no Для описания зависимости удельной скорости роста биомассы от концентрации ростового субстрата мы использовали уравнение Моно, то есть предполагали, что кинетика потребления ростового субстрата соответствует кинетике ферментативной реакции: где S-концентрация ростового субстрата. Предельная максимальная скорость роста цы и константа сродства Ks выбраны исходя из наблюдаемых параметров роста клеточной культуры на N-ацетилглюкозамине равными 0,6 час" и 50 мкг/мл.
Рассматривали рост на нативном хитине, не доступном для непосредственного использования клеткой. Ростовым субстратом S считали продукт действия фермента на кристаллический хитин (считали гидролиз хитина одностадийным процессом). Изменение S описывается следующим уравнением:
