Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Пути клеточной смерти 8
1.1.1. Апоптоз 8
1.1.2. Некроз: нерегулируемый и программир уемый 22
1.1.3. Аутофаговая клеточная смерть 29
1.1.4. Другие типы клеточной смерти 30
1.1.5. Участие лизосом в механизмах клеточной смерти 32
1.2. Основные лиганды и рецепторы запуска запрограммированной клеточной смерти... 36
1.2.1. Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти 36
1.2.2. Общие сигнальные процессы, запускаемые рецепторами смерти 39
1.2.3. Рецептор TNF-R1 и его лиганд TNF- 43
1.2.4. Рецептор Fas и его лиганд FasL 49
1.2.5. Рецепторы TRAIL-R и лиганд TRAIL 50
1.3. Белок Tag7 как представитель семейства PGLYRP 52
1.4. Цитотоксический белковый комплекс Tag7-Hsp70 54
1.5. Белок-шаперон Hsp70 55
1.6. Белок HspBP1 – кошаперон Hsp70 60
2. Результаты и обсуждение 62
2.1. Влияние белка HspBP1 на цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-
2.2. Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70 . 68
2.3. Выявление рецептора на поверхности клеток L-929, способного взаимодействовать с комплексом Tag7-Hsp70. 79
3. Материалы и методы 87
3.1. Белки, ферменты и реактивы. 87
3.2. Получение и очистка белков 87
3.3. Получение белковых комплексов. 92
3.5. Мечение биотином 94
3.6. Культивирование клеточных линий, использованных в работе . 95
3.7. Получение отдельных клонов клеток L-929. 95
3.8. Аффинная хроматография. 96
3.9. Элетрофорез и вестерн-блоттинг 97
3.11. Иммуноферментный анализ (ИФА) 100
3.12. Выделение мембранного рецептора.. 101
3.13. Определение цитотоксической активности. 102
3.14. Микроскопия.. 103
Выводы. 105
Список литературы
- Некроз: нерегулируемый и программир уемый
- Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти
- Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70
- Культивирование клеточных линий, использованных в работе
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Баланс между клеточным делением и клеточной смертью играет важную роль в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов. При этом нарушения в любом из этих процессов могут иметь патологические последствия для организма, вызывая нарушения эмбриогенеза, нейродегенеративные заболевания или же возникновение и развитие опухолей. Именно поэтому критически важную роль играют механизмы регуляции клеточного цикла и, в частности, механизмы запуска программы клеточной смерти. В настоящее время вызывает несомненный интерес исследование регуляции процессов, запускаемых под действием цитотоксических белков в клетках. Охарактеризовано множество цитотоксических белковых факторов, секретируемых клетками иммунной системы и способных запускать программу клеточной смерти, взаимодействуя с рецептором на поверхности клетки. В число этих факторов входят TNF-, FasL, TRAIL и другие. Описаны случаи, когда стимуляция одного и того же рецептора может, в зависимости от физиологического состояния клетки, приводить к запуску двух альтернативных программ клеточной смерти: апоптоза и некроптоза. Такая ситуация, в частности, имеет место для рецептора TNFR1: стимуляция лигандом TNF- может приводить к запуску как апоптоза, так и некроптоза. При этом продолжают обнаруживаться всё новые цитотоксические факторы, а также новые регуляторные белки. Регуляция механизма цитотоксического действия важна для предотвращения неконтролируемого уничтожения клеток, при этом белки-регуляторы могут проявлять функциональную активность, конкурентно связываясь с цитотоксическим фактором или с рецептором, препятствуя запуску цитотоксического сигнала.
В лаборатории молекулярной иммуногенетики рака, где и была проведена настоящая работа, ранее было показано, что Tag7/PGLYRP1, представляющий собой пептидогликан-распознающий белок, и главный белок теплового шока, шаперон Hsp70/Hsp70-1A, способны взаимодействовать, формируя устойчивый белковый комплекс Tag7-Hsp70 – новый цитотоксический агент, проявляющий активность в отношении клеток некоторых опухолевых линий. Было также показано, что этот же самый комплекс способны секретировать лимфокин-активированные киллерные клетки CD8+–типа, культивируемые в отсутствии клеток-мишеней. Кроме того, было установлено, что в роли белков-регуляторов цитотоксического действия Tag7-Hsp70 могут выступать Ca2+-связывающий белок метастазин-1 (Mts1/S100A4), способный взаимодействовать как с Tag7, так и с Hsp70, препятствуя формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70, а также ингибитор
АТФазной активности Hsp70, его кошаперон HspBP1. При этом оставались невыясненными механизмы запуска цитотоксических процессов в клетках-мишенях под действием Tag7-Hsp70, как и характеристика самих процессов. Исследование механизма действия новых цитотоксических агентов, как и поиск новых белков-регуляторов их активности, представляют значительный интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в расширении представления о механизмах регуляции цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и выяснении механизмов цитотоксических процессов, запускаемых под действием Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи:
-
изучить взаимодействие внеклеточного HspBP1 с Tag7 в кондиционной среде опухолевых клеток линии CSML-0 и в сыворотке крови человека;
-
охарактеризовать цитотоксические процессы, индуцируемые комплексом Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках;
-
выявить рецептор на поверхности опухолевых клеток, участвующий в индукции цитотоксических процессов под действием Tag7-Hsp70.
Научная новизна работы. В диссертационной работе впервые продемонстрировано, что белок Tag7 образует с белком HspBP1 стабильный комплекс в супернатантах опухолевых клеток и в сыворотке крови человека. При этом взаимодействие Tag7 с HspBP1 препятствует формированию цитотоксически активного комплекса Tag7-Hsp70 и может служить защитной мерой организма от воздействия этого комплекса. Установлена идентичность цитотоксических процессов в опухолевых клетках, индуцированных воздействием Tag7-Hsp70 и TNF-. Показано, что Tag7-Hsp70, подобно TNF-, индуцирует в опухолевой клетке два альтернативных механизма клеточной смерти: быстро протекающий каспазозависимый апоптоз и медленно протекающий RIP1-зависимый некроптоз. Из гетерогенной культуры L-929 выделены клоны, в которых под действием Tag7-Hsp70 запускается только один механизм клеточной смерти. Установлено, что антиоксидант ионол, ингибитор лизосомальных ферментов хлорохин и хелатор кальция EGTA ингибируют некроптоз, запускаемый под действием комплекса Tag7-Hsp70. Показано, что Tag7-Hsp70 индуцирует цитотоксические процессы в опухолевых клетках, взаимодействуя с рецептором TNFR1.
Практическая ценность исследований. Раковые заболевания в настоящее время занимают лидирующую позицию в ряду основных причин смерти среди населения планеты. Поиск новых цитотоксических препаратов, а также исследование механизмов гибели опухолевых клеток под действием этих препаратов чрезвычайно важны для развития новых
стратегий специфической противоопухолевой иммунотерапии. Установление молекулярных механизмов цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки может быть использовано для разработки противоопухолевых лекарственных препаратов на его основе. При этом расширение представления о регуляции цитотоксической активности Tag7-Hsp70 и выяснение роли HspBP1 в этом процессе может способствовать разработке препаратов, корректирующих иммунный ответ, а также систем для диагностики состояния иммунной системы организма и восприимчивости клеток организма к вакцинам, разработанным на основе Tag7-Hsp70.
Апробация результатов диссертационной работы. Результаты работы были доложены
на международных школах и конференциях: XXV Международная зимняя молодёжная
научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии», посвящённая 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, Россия, 2013), 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Москва, Россия, 2012), 1st EATI & 3rd ERI-ICP Conferences “Death, Danger, Inflammation and Immunity” (Париж, Франция, 2012).
Публикации. По материалам диссертационной работы было опубликовано 6 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах – 3, материалов конференций – 3.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 17 рисунков, 1 таблицу и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты и обсуждение», «Материалы и методы», «Выводы» и «Список литературы», содержащий 139 ссылок.
Некроз: нерегулируемый и программир уемый
А по птоз (от греч. «» – отделение и «» – падение) – это процесс запрограммированного уничтожения клетки, вызванный внутренними или внешними физиологическими и патологическими факторами, активирующими генетическую программу гибели клетки и ее удаления из ткани. Термин «апоптоз» происходит от греческого слова «», обозначающего «опадение лепестков цветка» и «опадение листвы с дерева осенью». Действительно, в процессе старения в листьях растений обнаруживается фрагментация ДНК, характерная для апоптоза, которая не обнаруживается в зелных листьях (Cheng-Hung and Chang-Hsien, 1998). Характерными признаками апоптотической клетки являются изменения морфологии ядра, включающие конденсацию ядерного хроматина (кариопикноз) и его фрагментацию (кариорексис), межнуклеосомальные разрывы ДНК, сморщивание и пузырчатая морфология плазматической мембраны, уменьшение клетки в объме и е последующая фрагментация на мембранные везикулы с внутриклеточным содержимым, так называемые апоптотические тельца, фагоцитируемые макрофагами и клетками-соседями, в которых они утилизируются при участии лизосом. Характерным признаком апоптотической клетки является также транслокация остатков фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю сторону плазматической мембраны, что служит сигналом для привлечения фагоцитов. Макрофаги выделяют особый гликопротеин MFG-E8, который специфически связывается с фосфатидилсерином на поверхности апоптотических клеток, служа меткой для узнавания и фагоцитоза макрофагами этих клеток (Hanayama et al., 2002). Весь процесс от инициации апоптоза до элиминации апоптотических клеток обладает высокой кинетикой и протекает в течение 1-3 ч (Gavrieli et al., 1992).
Апоптоз наблюдается у всех эукариот, начиная от одноклеточных простейших и вплоть до высших организмов. Одной из основных функций апоптоза является уничтожение дефектных (поврежднных, мутантных, инфицированных) клеток. На основе генетического анализа, проведнного для нематоды Caenorhabditis elegans, была также установлена ключевая роль апоптоза в регуляции клеточной смерти в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов (Ellis and Horvitz, 1986; Metzstein et al., 1998). Апоптоз играет также важную роль в обеспечении развития и функционирования иммунной системы. В клетках позвоночных апоптоз обычно протекает по одному из двух сигнальных каскадов, один из которых запускается при стимуляции рецепторов клеточной поверхности (рецепторный путь), а другой запускается внутриклеточно, при участии митохондрии (митохондриальный путь). В обоих случаях в осуществлении программы апоптоза ключевую роль играют каспазы (за исключением случаев каспазо-независимого апоптоза, которые также рассмотрены ниже).
Каспазы (семейство Cys-Asp-протеаз) принадлежат семейству эволюционно консервативных протеаз – ферментов, катализирующих ограниченное расщепление клеточных белков. Слово каспаза произошло от англ. caspase, где буква c соответствует цистеину (cysteine), корень asp – аспартату (aspartate), ase – суффиксу в названиях ферментов. В активном центре каспаз находится остаток цистеина, при этом каспазы узнают тетрапептидные мотивы белков вида X-X-X-Asp (X соответствует произвольной аминокислоте) и расщепляют пептидную связь по карбоксильному концу остатка аспарагиновой кислоты, отщепляя тетрапептидные мотивы. В настоящее время насчитывают не менее 15 видов каспаз, пронумерованных в порядке их открытия (Eckhart et al., 2005). Из них в человеческом организме экспрессируются каспазы 1-10, 12 и 14, причм каспаза 12 в большинстве человеческих популяций экспрессируется в нефункциональной укороченной форме (Saleh et al., 2004). В апоптозе, индуцированном цитотоксическим фактором гранзимом B или лигандами TNF-, FasL или TRAIL, принадлежащими семейству TNF (фактора некроза опухоли), участвуют каспазы 2, 3 и 6-10. Остальные каспазы выполняют иные функции, не связанные с запуском клеточной смерти: каспазы 1, 4 и 5 принимают участие в активации противовоспалительных цитокинов (Martinon and Tschopp, 2004), а прокаспаза 14 активируется при созревании кератиноцитов эпидермиса (Lippens et al., 2000; Eckhart et al., 2000).
Каспазы, принимающие участие в осуществлении программы апоптоза, подразделяют на две группы: инициаторные (каспазы 2, 8, 9 и 10) и эффекторные (каспазы 3, 6 и 7). Инициаторные каспазы присутствуют в клетке в форме неактивных проферментов – прокаспаз (32-56 кДа), представляющих собой мономеры, состоящие из N-концевого продомена, большой (17-21 кДа) и малой (10-13 кДа) субъединиц и коротких связующих областей (Earnshaw et al., 1999). При активации инициаторных каспаз происходит димеризация мономерных прокаспаз, после чего N-концевой продомен и связующие области в составе каждого из мономеров расщепляются, при этом большая и малая субъединицы формируют гетеродимеры (Рис. 1) (Liang and Fesik, 1997). Активная каспаза представляет собой тетрамер, состоящий из двух таких гетеродимеров (Kohler et al., 2002). Этот тетрамер структурно состоит из центральной части, сформированной двенадцатью -листами, которую окружают -спирали (MacKenzie and Clark, 2012).
Общие сведения о лигандах и рецепторах клеточной смерти
На сегодняшний день известно множество факторов, которые способны индуцировать LMP. В их число входят АФК, сфингозин и другие лизосомотропные агенты, липиды, белки семейства Bcl-2, каспазы, катепсины, а также лизосомальный белок LAPF (Boya and Kroemer, 2008).
Одним из основных факторов, вызывающих LMP, являются АФК. Под действием АФК происходит перекисное окисление липидов мембран лизосом, что приводит к дестабилизации мембран и выходу лизосомальных протеаз в цитозоль клетки, приводя к клеточной смерти (Vanlangenakker et al., 2008). Показано, что АФК, генерируемые NADPH-оксидазой, могут вызывать выход катепсина D из азурофильных гранул нейтрофилов независимо от активности каспаз (Conus et al., 2008; Blomgran et al., 2007). После выхода из лисосом катепсин D приводит к активации каспазы-8 и инициации апоптоза (Conus et al., 2008). Другим фактором, приводящим к LMP, может выступать молекула сфингозина.
Лизосомальный фермент сфингомиелиназа после своей активации расщепляет сфингомиелин, основной сфинголипид клеточных мембран, до церамида. Церамид может быть преобразован в сфингозин за счт отщепления жирных кислот ферментом церамидазой. Будучи лизосомотропным агентом, сфингозин накапливается в лизосомах, вызывая дозо-зависимую пермеабилизацию лизосомальных мембран (Vanlangenakker et al., 2008). Стоит отметить, что церамид способен блокировать работу комплекса III дыхательной цепи митохондрии, приводя к повышению выработки АФК. При этом синтетические аналоги церамида вызывают в опухолевых клетках запуск механизмов клеточной смерти (Granot et al., 2006). Накопление церамида наблюдается в случае программируемого некроза, запущенного через рецептор под действием Fas и TNF, при этом в последнем случае накопление церамида является RIP1-зависимым (Vanlangenakker et al., 2008).
Активация фосфолипазы PLA2 может также способствовать LMP. Было показано, что добавление ингибитора PLA2 4-бромофенацил бромида снижает повреждения лизосомальных мембран и апоптоз в клеточной линии лимфомы мыши J774 (Zhao et al., 2001). При этом сами лизосомальные ферменты способны активировать PLA2, обеспечивая тем самым положительную обратную связь в процессе LMP (Zhao et al., 2001). Таким образом, PLA2 способна воздействовать как на митохондрию, индуцируя MOMP, продукцию АФК и выход цитохрома C, так и на лизосому, стимулируя LMP.
LMP может быть также вызвана воздействием кальпаинов – Ca2+-зависимых цистеиновых протеаз. Известно 2 подсемейства кальпаинов: -кальпаины и m-кальпаины, для активации которых требуются, соответственно, микромолярные и миллимолярные концентрации ионов Ca2+. Активация кальпаинов может быть вызвана воздействием АФК, кроме того, кальпаины способны к самоактивации за счт протеолитической модуляции Na+/Ca2+-насоса плазматической мембраны, приводящей к необратимому нарушению Ca2+-гомеостаза. После активации -кальпаин транслоцируется в лизосомальную мембрану, нарушая е целостность и вызывая выход лизосомальных катепсинов в цитозоль клетки, что приводит к запуску клеточной смерти (Vanlangenakker et al., 2008).
Белки семейства Bcl-2, регулирующие индукцию MOMP, способны также участвовать в запуске LMP. Так, белок Bax способен транслоцироваться из цитозоля в лизосомальную мембрану, индуцируя LMP (Kgedal et al., 2005; Feldstein et al., 2006). При этом с помощью иммунного окрашивания и с использованием конфокального и электронного микроскопов было показано, что в человеческих фибробластах, культивируемых в присутствии староспорина, тирозинкиназного ингибитора широкого спектра действия, происходит транслокация Bax в мембраны лизосом, что вызывает LMP и выход катепсина D из лизосом в цитозоль (Kgedal et al., 2005). Ингибирование экспрессии Bax методом РНК-интерференции защищает клетки от LMP и апоптоза, вызванных воздействием H2O2, что также подтверждает участие Bax в индукции LMP (Castino R. et al., 2007). Другой член семейства Bcl-2, белок Bid подсемейства BH3-only, также может быть задействован в запуске LMP. Исследование на клетках с генотипом Bid–/– продемонстрировали, что LMP и клеточная смерть в гепатоцитах, вызванные воздействием TNF-, являются Bid-зависимыми (Guicciardi M.E. et al., 2005). Все эти данные указывают на то, что белки Bax и Bid семейства Bcl-2 способны непосредственно вызывать LMP, независимо от активации MOMP.
Каспазы также могут участвовать в индукции LMP. В частности, стимуляция клеток цитокином TNF- может индуцировать LMP при участии каспазы-8, что вызывает транслокацию катепсина B из лизосом в цитозоль, индуцируя клеточную смерть (Werneburg et al., 2004). При этом активация каспаз может как предшествовать LMP, как это было показано для клеток ME-180, так и происходить после LMP, как в случае клеток WEHI-S (Foghsgaard et al., 2001). Для клеток эмбриональных мышиных фибробластов было показано, что рецепторный путь апоптоза может вызывать активацию каспазы-8, которая участвует в активации каспазы 9, индуцирующей LMP и выход лизосомальных катепсинов в цитозоль, осуществляя программу клеточной смерти (Gyrd-Hansen et al., 2006). Белок Hsp70, ассоциированные с лизосомой мембранные белки LAMP-1 и LAMP-2 и эндогенные глигоаминогликаны могут защищать от LMP (Kirkegaard et al., 2010; Fehrenbacher et al., 2008; Yue et al., 2009). Последствия LMP
Нарушение целостности лизосомальной мембраны приводит к выходу лизосомальных катепсинов в цитозоль, что приводит к расщеплению различных белковых субстратов и вызывает апоптоз. Катепсины B, K, L и S не вызывают непосредственной активации каспаз, классических эффекторов апоптоза, а проявляют свой эффект опосредованно, взаимодействуя с белками семейства Bcl-2: приводя к протеолитической активации белка BID, а также за счт деградации анти-апоптотических членов семейства Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-XL и MCL-1). Кроме того, цистеиновые катепсины могут участвовать и в осуществлении запускаемого митохондрией митохондриального пути апоптоза, вызывая деградацию белка XIAP, а также, возможно, других белков-членов семейства IAP, тем самым способствуя активации эффекторных каспаз (Repnik and Turk, 2010).
Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70
Исследование кинетики цитотоксических процессов, запускаемых в клетках L-929 под действием Tag7-Hsp70. Далее мы исследовали, как осуществляется передача цитотоксического сигнала в клетки L-929 при их контакте с белковым комплексом Tag7-Hsp70. Следовало установить: 1) какие процессы, приводящие клетку к гибели, активируются под действием исследуемого комплекса; 2) участвует ли в передаче цитотоксического сигнала рецептор клеточной поверхности или же Tag7-Hsp70 попадает в клетку путм эндоцитоза, после чего активирует комплекс реакций, приводящих к клеточной гибели.
При исследовании кинетики цитотоксического действия Tag7-Hsp70 мы обнаружили, что добавление Tag7-Hsp70 к инкубационной среде клеток опухолевой линии L-929 приводит к появлению двух пиков гибели в культуре: один из пиков наблюдался через 3 ч, а другой – через 18-24 ч после добавления белкового комплекса.
Известно, что в клетках L-929 классический цитокин TNF- способен запускать два альтернативных механизма клеточной смерти: апоптоз и некроптоз. При этом первый механизм развивается очень быстро, в течение 1-3 ч, а второй развивается значительно медленнее. В связи с этим мы решили сравнить цитотоксическое действие нашего комплекса Tag7-Hsp70 с цитотоксическим действием TNF- на опухолевые клеточные линии по двум параметрам: субстратной специфичности и характеру запускаемых цитотоксических процессов.
Для сравнения субстратной специфичности Tag7-Hsp70 и TNF- исследовался цитотоксический эффект, наблюдаемый при добавлении каждого из этих агентов к клеткам опухолевых линий L-929, Jurkat и HeLa спустя 20 ч инкубации. В результате было обнаружено, что Tag7-Hsp70 проявляет такую же, как и TNF-, специфичность в отношении различных опухолевых клеток-мишеней: клетки L-929 и Jurkat оказались хорошими мишенями, проявляя до 30 % гибели в популяции, а клетки HeLa – плохими, с гибелью менее 5 % спустя 20 ч инкубации с цитотоксическим агентом (рис. 5).
Рис. 5. Цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp70 и цитокина TNF- на различные опухолевые клеточные линии. Каждый из цитотоксических белковых агентов, Tag7-Hsp70 и TNF-, добавлялся к инкубационным средам клеток линий L-929, Jurkat и HeLa до конечной концентрации 10-9 М, после чего клетки инкубировались на протяжении 20 ч. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим.
Сравнение кинетики цитотоксического действия Tag7-Hsp70 и TNF- на клетки L-929 также обнаружило аналогию: кривые зависимости величины клеточной смерти от времени инкубации клеток с цитотоксическим агентом коррелируют, при этом в каждом случае обнаруживается 2 пика цитотоксической активности: через 3 ч и через 18-24 ч (рис. 6). Можно предположить, что и под действием Tag7-Hsp70, и под действием TNF- в клетках активируются сходные механизмы цитотоксичности. Рис. 6. Кинетика цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и цитокина TNF- на клетки опухолевой линии L-929. Клетки L-929 инкубировались с Tag7-Hsp70 (10-9 М) или с TNF- (10-9 М). Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим.
Мы обратили внимание, что в культуре L-929 клеточная смерть под действием Tag7-Hsp70 не превышала 25 %. Этот факт может объясняться гетерогенностью клеток-мишеней по отношению к цитотоксическому действию белкового агента: известно, что генетически гомогенные клеточные линии, выделенные из тканевых культур, могут содержать субпопуляции, обладающие разной чувствительностью к действию цитотоксических агентов. Так, было показано, что культура клеток линии L-929, чувствительная к цитотоксическому действию TNF-, может содержать в свом составе клетки, устойчивые к TNF- (Vanhaesebroeck et al., 1991). Авторы получили отдельные клоны клеток, которые были названы L929r1 и L929r2, устойчивые к цитолизу под действием TNF-. При этом резистентность клона L929r1 была обусловлена отсутствием на поверхности клеток соответствующего рецептора, а резистентность клона L929r2 – нарушением внутриклеточного пути передачи цитотоксического сигнала.
Нелинейный характер кривой, отражающей зависимость величины клеточной смерти от времени инкубации клеток с комплексом Tag7-Hsp70, а также дискретность цитотоксического действия комплекса позволяют предположить, что и в нашем случае в культуре L-929 присутствует по меньшей мере две субпопуляции клеток, в каждой из которых под действием Tag7-Hsp70 запускается свой механизм передачи цитотоксического сигнала, приводя к клеточной гибели через соответствующий временной интервал. Используя метод предельного разведения, нам удалось получить отдельные клоны клеток L-929: был получен клон L-929s1, который проявлял гибель только в течение первых 4 ч, а также клон L-929s2, который проявлял гибель не ранее чем после 16 ч инкубации с Tag7-Hsp70 (рис. 7). Уровни гибели клеток в этих клонах были существенно выше, чем в клетках гетерогенной популяции, как видно из графиков на рисунке 7. Кроме того, некоторые клоны оказались устойчивыми к цитотоксическому действию Tag7-Hsp70 (L-929r на рис. 7). Но при культивировании клонов, высокочувствительных к цитотоксическому действию Tag7-Hsp70, через 7-10 дней их чувствительность по отношению к комплексу снижалась, видимо, отражая возникновение в культуре признаков гетерогенности, что сильно затрудняло работу с этими клонами и препятствовало воспроизводимости результатов. Такое же снижение чувствительности отобранных клонов к цитотоксическому действию цитокина TNF- можно встретить в литературе (Vanhaesebroeck et al., 1991). В результате в дальнейших исследованиях мы использовали стабильную культуру клеток L-929 с относительно низким цитотоксическим эффектом, наблюдаемым при добавлении Tag7-Hsp70, но с высокой воспроизводимостью результатов. Рис. 7. Чувствительность различных клонов клеток опухолевой линии L-929 к цитотоксическому действию белкового комплекса Tag7-Hsp70 в сравнении с чувствительностью клеток гетерогенной культуры. Клоны клеток L-929 были получены методом предельного разведения. Полученные клоны инкубировались с Tag7-Hsp70 (10-9 М) в течение 24 ч. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим.
В клетках L-929 запускается каспазозависимый апоптоз, приводящий к пику клеточной смерти через 3 ч инкубации с Tag7-Hsp70. Появление двух пиков гибели в культуре L-929, обнаруживаемых после добавления Tag7-Hsp70, позволило предположить, что под действием Tag7-Hsp70 в этих клетках запускаются два цитотоксических процесса, протекающие с различной скоростью. Самой известной программой клеточной смерти является программа апоптоза. При этом все ключевые пути классического апоптоза протекают при непосредственном участии каспаз. В результате ингибиторного анализа мы выяснили, что клеточная смерть, детектируемая через 3 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, протекает с участием каспаз: добавление каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO полностью блокировало цитотоксическую активность комплекса (рис. 8А). Аналогичный эффект блокирования клеточной смерти был обнаружен и в случае цитокина TNF (рис. 8Б).
Культивирование клеточных линий, использованных в работе
Для приготовления белковых комплексов очищенные белки тщательно диализовались против PBS pH 7,4 (100-кратный объм PBS, буфер меняли 3-5 раз); затем смешивались в эквимолярных концентрациях и инкубировались в течение 30 мин при 37 C в PBS pH 7,4. Для очистки полученного комплекса от несвязавшихся белков проводили иммуноаффинную хроматографию на колонках с иммобилизованными антителами к каждому из белков комплекса.
Первичные антитела: Антитела к Tag7 и к Hsp70, полученные из сыворотки кролика, использовались в разведении 1: 10 000. Антитела кроличьи к HspBP1 и козлиные к TNFR1, любезно предоставленные профессором Тоневицким А.Г. (Российский исследовательский институт физического образования и спорта), использовались в разведении 1: 10 000. Каждое из антител проверялось на перекрстную реактивность с каждым из исследованных белков.
Вторичные антитела: Поликлональные козлиные антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, (GE Healthcare) (анти-кроличьи антитела) использовались в разведении 1: 40 000. Поликлональные кроличьи антитела к иммуноглобулинам овцы, конъюгированные с пероксидазой хрена, (Имтек) (анти-овечьи антитела), использовались в разведении 1: 40 000, при этом первичными антителами могли служить иммуноглобулины как овцы, так и козла из-за перекрстной реактивности антител по отношению к иммуноглобулинам этих животных.
Для получения антител к Tag7 и к Hsp70 проводили иммунизацию кроликов полученными рекомбинантными белками Hsp70 и Tag7. Для первой иммунизации по 200 мкг белка в 0,5 мл 0,15 М NaCl и смешанного с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда в виде стабильной эмульсии вводили подкожно в подушечки стоп и вдоль хребта 4 кроликам (по 2 кролика на исследуемый белок). Повторную иммунизацию тем же раствором проводили через месяц в верхнюю часть бедра. Следующие иммунизации проводили через каждую неделю в течение месяца: по 100 мкг белка в 0,5 мл 0,15 М NaCl и смешанного с 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда в виде стабильной эмульсии вводили подкожно вдоль хребта. Через 2 месяца после первой иммунизации провели забор крови из ушной раковины кроликов и провели проверку полученных сывороток методом иммуноферментного анализа (ИФА).
По данным проверки были отобраны все сыворотки, которые затем использовались для выделения специфичных иммуноглобулинов на иммуноадсорбционных колонках с иммобилизованными рекомбинантными белками Tag7 и Hsp70. Сыворотки кроликов объединили попарно и осадили фракцию иммуноглобулинов раствором сульфата аммония. Для этого к 100 мл сыворотки добавили 50 мл насыщенного раствора сульфата аммония, центрифугировали при 2 500 g, супернатант устранили, а осадок растворили в 50 мл воды и снова осадили добавлением 25 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Осаждение повторяли 4 раза. Затем препараты растворили в 25 мл PBS и нанесли на соответствующие колонки с иммобилизованными рекомбинантными белками. Количество белка в связавшихся фракциях определяли по методу Bradford (с использованием реактива Bradford, Sigma). Фракции с максимальным количеством белка объединяли и диализовали против PBS в течение ночи. Полученные образцы подвергли электрофорезу в денатурирующих условиях (10 % SDS-PAGE) по Лэммли в камере для вертикального электрофореза (Hoefer Scientific) для установления чистоты образца.
Полученные специфические антитела к белкам Tag7 и Hsp70 анализировались при помощи вестерн-блоттинга. Для этого белки Tag7 и Hsp70 подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях, при этом наносили по 0,2 мкг белка на дорожку. Электроперенос с геля осуществляли на мембрану PVDF (Hibond-P, Amersham Biosciences), после чего проводили вестерн-блоттинг по стандартной методике, рекомендуемой фирмой-изготовителем мембраны, используя набор реагентов для анализа (Amersham Biosciences, код RPN2132 и RPN2133). В качестве блокирующего агента использовали 1-5 % BSA. В качестве первичных антител использовали поликлональные антитела, выделенные из сыворотки кролика, к рекомбинантному Tag7 в разных разведениях (от 1:5 000 до 1:40 000), рекомбинантному белку Hsp70 в разных разведениях (от 1:5 000 до 1:40 000). В качестве вторичных антител использовали поликлональные антитела, выделенные из сыворотки козла, к иммуноглобулинам кролика (разведение 1:40 000), конъюгированные с пероксидазой хрена (GE Healthcare). Для проверки специфичности антител на дорожки геля при электрофорезе также наносили рекомбинантный BSA. В результате было установлено, что детекцию белков можно проводить при разведении антител до 40 000 раз. В дальнейшем в нашей работе использовали разведение 1: 10 000.
