Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 7
2. Цели и задачи исследования 9
3. Положения, выдвигаемые для защиты 10
4. Обзор литературы 11
4.1. Ген и белок Pdcd4 11
4.1.1. Ген и транскрипт Pdcd4 11
4.1.2. Структура белка Pdcd4 12
4.1.3. Молекулярные механизмы действия Pdcd4 15
4.2. Регуляция активности Pdcd4 20
4.2.1. Регуляция транскрипции Pdcd4 20
4.2.2. Регуляция трансляции Pdcd4 21
4.2.3. Регуляция стабильности белка Pdcd4 23
4.2.4. Внутриклеточная локализация Pdcd4 26
4.2.5. Регуляция активности Pdcd
4 4.3. Характер экспрессии Pdcd 4 30
4.4. Функции Pdcd4
4.4.1. Pdcd4, апоптоз и контроль пролиферации клеток 32
4.4.2. Влияние Pdcd4 на клеточный цикл 35
4.5. Pdcd4 и неопластическая трансформация 36
4.5.1. Pdcd4 и онкогенез: причинно следственная связь 36
4.5.2. Прогностическое значение Pdcd4 39
4.5.3. Pdcd4 и супрессия роста опухолевых клеток 40
4.5.4. Ангиогенез 41
4.5.5. Pdcd4 и прогрессия опухоли 42
4.5.6. Pdcd4 и хеморезистенция 45
4.5.7. Pdcd4 как интегральный маркер про-онкогенных изменений 47
4.6. Заключение 48
5. Материалы и методы 50
5.1. Реактивы 50
5.2. Культуры клеток, реагенты и трансфекция 50
5.3. Вестерн-блот анализ и антитела 51
5.4. Выделение РНК и ПНР в реальном времени
5.5. Ферменты 55
5.5.1. Гидролиз ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции 55
5.5.2. Обработка фрагментов ДНК фрагментом Кленова 55
5.5.3. Лигирование фрагментов ДНК 55
5.6. Получение плазмидных конструкций 55
5.6.1. Бактериальные штаммы, среды, реактивы, антибиотики 55
5.6.2. Приготовление компетентных клеток Е. coli 56
5.6.3. Трансформация клеток Е. coli 56
5.6.4. Секвенирование ДНК 56
5.6.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 57
5.6.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле 57
5.6.7. Очистка фрагментов ДНК 57
5.6.8. Полимеразная цепная реакция 57
5.6.9. Клонирование продуктов ПЦР 57
5.6.10. Получение плазмидных конструкций
5.7. Двойной люциферазный анализ 61
5.8. Статистическая обработка результатов 61
6. Результаты и обсуждение 63
6.1. Анализ экспрессии Pdcd4 в клетках меланомы человека 63
6.1.1. Уровень белка Pdcd4 в клетках меланомы и нормальных меланоцитах 63
6.1.2. Роль Akt и MEK/ERK сигнальных путей в супрессии Pdcd4 в клетках меланомы 6.2. Анализ уровней белка и транскрипта Pdcd4 в клетках линий рака легких 71
6.3. Роль Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в опухолевых клетках рака легких 73
6.4. Роль протеинкиназы GSK3P в регуляции экспрессии супрессора опухолевого роста Pdcd4 в клетках линии рака легких 75
6.5. Вклад протеолитической деградации белка Pdcd4 в супрессию Pdcd4 в клетках опухолей легких 77
6.6. Влияние ингибиторов Akt/mTOR/S6Kl-сигнального пути рапамицина и LY29002 на уровень транскрипта Pdcd4 78
6.7. Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках линии рака легких 79
6.8. mTOR-зависимая супрессия активности промотора гена Pdcd4 в клетках линии рака легких 84 6.8.1. Способность ингибитора mTOR рапамицина оказывать действие на активность промоторной области гена Pdcd4 85
6.8.2. Картирование минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, ответственного за влияние Akt-сигнального пути на транскрипционную активность промотора гена Pdcd4 86
6.8.3. Анализ участков связывания потенциальных транскрипционных факторов с делеционным мутантом промотора гена Pdcd4 87
6.8.4. Анализ активности репортерного гена под контролем делеционного мутанта минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, опосредующего эффект рапамицина
7. Заключение 92
6. Выводы 93
Личный вклад автора 94
Благодарности 95
Список литературы
- Ген и транскрипт Pdcd4
- Характер экспрессии Pdcd 4
- Выделение РНК и ПНР в реальном времени
- Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках линии рака легких
Ген и транскрипт Pdcd4
Впервые Pdcd4 {Programmed cell death-4) был изолирован как транскрипт Н731, продуктом которого является ядерный антиген пролиферирующих клеток Рг-28 [1-3]. Позже он же был изолирован как транскрипт, присутствие которого в мышиных кератиноцитах (клетки линии JB6) ингибировало их неопластическую трансформацию [4]. Другой группой исследователей он был описан как МА-3 - транскрипт, индукция которого, как показали последующие исследования, наблюдалась при апоптозе в исследованных клеточных линиях [5]. Вскоре после этого Ониши и Кизаки опубликовали гомологичную кодирующую последовательность, названную TIS - транскрипт (topoisomerase inhibitor suppressed gene), супрессия которого наблюдалась при обработке клеток лимфомы RVC ингибитором топоизомеразы камптотецином [4,6,7]. В последующие годы еще несколькими независимыми группами исследователей были идентифицированы человеческий (197/15а\ куриный (Pdcd4) и крысиный (DUG) ортологи [8]. Транскрипт 197/15а дифференциально регулируется интерлейкинами 2, 12 и 15 в NK- и Т-клетках [9]. Уровень транскрипта DUG значительно увеличивался в клетках крысиной инсулиномы INS-1, претерпевающих апоптотическую гибель [10]. Поскольку в ряде модельных систем экспрессия гена была сопряжена с индукцией апоптотического процесса, этот ген получил официальное название Pdcd4 (Programmed cell death-4).
Ген Pdcd4 мыши имеет длину приблизительно 21 т.п.н. включает 11 экзонов и присутствует в единичной копии [11]. Анализ 5 -фланкирующего участка гена показал наличие основных консенсусных последовательностей корового промотора - ТАТА и СААТ-боксов в позициях -21 и -81, соответственно [11]. В клетках линии COS-1 при помощи люциферазного анализа было показано, что функциональный участок промотора, содержащий эти два элемента, является транскрипционно активным. Чувствительность к камптотецину, ингибитору топоизомеразы I, была ассоциирована с участком промотора от [-13 2/+160] и обуславливает супрессию транскрипции гена Pdcd4 при воздействии на клетки ингибиторами топоизомераз. Более того, в промоторной области был идентифицирован потенциальный участок связывания транскрипционных факторов NFKB (в позиции от -488 до -470), NF1 [-326/-314], и два сайта связывания С/ЕВР [-424/-416] и [-254/-246]. Но остается неясным, функционируют ли эти последовательности при транскрипции.
Схематическое изображение транскриптов Pdcd4 и изоформ 1 и 2 белка Pdcd4. (А) Открытые рамки считывания (ORF) вариантов 1 и 2 транскрипта показаны штриховкой. Альтернативный экзон, присутствующий в варианте 2 транскрипта, показан черным цветом. Начала и концы открытых рамок считывания и положение альтернативного экзона в варианте 2 транскрипта приведены в нуклеотидах (нт). (Б) Показаны положения МАЗ-доменов в изоформах 1 и 2 белка Pdcd4. N-концевые области белков, различающиеся в изоформах 1 и 2, показаны черным цветом. Положения МАЗ-доменов приведены в аминокислотных остатках (ао).
Ген Pdcd4 человека картирован в локусе 10q24 [12], состоит из 12 экзонов и составляет около 28 т.п.н. Кроме транскрипта размером в 3591 п.н. (GeneBank Асе. NM_014456), кодирующего изоформу 1 белка Pdcd4 из 469 аминокислот (а.о.), существует альтернативно сплайсированный транскрипт Pdcd4 длиной 3675 п.н., кодирующий изоформу 2 (GeneBank Асе. NM_145341). Инсерция дополнительного экзона между экзонами 2 и 3 в транскрипте, кодирующем изоформу 2, сдвигает рамку считывания, что приводит к инициации трансляции с AUG-кодона, находящегося в альтернативном экзоне, и синтезу белка из 458 аминокислот, практически полностью идентичного изоформе 1 за исключением N-концевой области полипептидной цепи (Рис. 1). В настоящее время функциональные различия между двумя изоформами Pdcd4 неизвестны.
Белок Pdcd4 (изоформа 1) состоит из 469 а.о. Белковая молекула Pdcd4 имеет характерное строение и состоит из доменов, определяющих способность к узнаванию и связыванию с РНК и белками-партнерами. Полипептидная цепь включает два основных домена на N- и С- концах и два консервативных а-спиральных МА-3 домена [10,13] (Рис. 2).
МА-3 домен является высококонсервативным. Он присутствует в факторах инициации трансляции eIF4G человека и eIF(iso)4F растений, а также в изоформе eIF4G DAP-5/NAT-l/p97, но отсутствует в белке eIF4G дрожжей [14,15]. МА-3 домен в факторе eIF4G необходим для его взаимодействия с АТФ-зависимой РНК-хеликазой eIF4A, которая необходима для инициации трансляции и релаксации вторичных структур в 5 -нетранслируемых областях (НТО) [16]. И действительно, методами коиммунопреципитации, дрожжевой двугибридной системой, конфокальной иммунофлуоресцентной микроскопии было показано взаимодействие между Pdcd4 и еШ4А, и на основании такого взаимодействия был предложен механизм Рс1сс14-зависимой репрессии трансляции [10,17]. Механизм состоит в том, что Pdcd4 за счет МА-3 домена связывается с eIF4A и тем самым препятствует связыванию eIF4A с eIF4G и eIF4E. Таким образом, Pdcd4 не дает сформироваться комплексу eIF4F и тем самым блокирует трансляцию. В подтверждение предложенного механизма было показано, что хеликазная активность eIF4A ингибируется дозозависимым способом рекомбинантным белком Pdcd4, тем самым, репрессируя кэп-зависимую трансляцию [17].
Мутации в МА-3 домене белка Pdcd4 приводили к полной потере способности Pdcd4 связывать eIF4A и, как результат, ингибировать трансляцию, что указывает на критичную роль МА-3 доменов Pdcd4 в процессе подавления трансляции [16].
Рис. 2. Структура белка Pdcd4. Возможные сайты ядерной локализации (NLS) отмечены красным; сигналы ядерного экспорта (NES) зеленым; стрелками указаны сайты
фосфорилирования; два консервативных МА-3 домена обозначены сиреневым цветом; РНК-связывающий сайт обозначен голубым цветом; участок богатый аргинином отмечен желтым (адаптировано из [18]).
В последующие годы методом ЯМР-спектроскопии была определена структура С-концевого МА-3 домена (МА-3с) молекулы белка Pdcd4 [19,20]. Было показано, что МА-3 домен Pdcd4 эффективно конкурирует с eIF4G за взаимодействие с eIF4A. Pdcd4 обладает схожей или даже большей аффинностью связывыания с eIF4A, чем eIF4G, и такое связывание является достаточным для ингибирования инициации трансляции. Методом ЯМР-спектроскопии была также определена структура второго, МА-3 домена (МА-Зт), находящегося ближе к N-концу [21]. Домен МА-Зт структурно и функционально схож с МА-3 с и оба они действуют синергично. Оба МА-3 домена Pdcd4 необходимы для высокоаффинного связывания с еШ4А. Однако регуляция трансляции белком Pdcd4 может быть еще более сложной, так как было показано, что Pdcd4 может напрямую взаимодействовать с eIF4G, и к тому же обладает еще и РНК-связывающей активностью [22].
Интересно отметить, что гомологи Pdcd4 присутствуют и у низших эукариот, и у растений, но не у дрожжей. Pdcd4 в высших растения уникален тем, что состоит из четырех МА-3 доменов [23].
N-концевая часть домена Pdcd4, как было показано in vitro, обладает способностью связываться с РНК [22]. РНК-связывающий участок белка сильно гидрофилен и содержит протяженные участки основных а.о. Анализ РНК-связывающей активности участка N-концевого домена показал, что существуют две области, богатые остатками аргинина и лизина, с центрами, расположенными вокруг аминокислот 63 и 103 [24]. Эти участки, обозначенные как RBM1 и RBM2, демонстрируют значительную консервативность среди позвоночных, и даже между гомологами Pdcd4 сильно отдаленных видов, таких как S. domuncula, D. melanogaster, X. laevis, D. rerio, M. musculus и H. sapiens. Мутантный анализ показал, что для связывания РНК и Pdcd4 in vivo необходимы оба кластера. Аминокислотные остатки аргинина в позиции 73 и ПО, фланкированные остатками глицина и представляющие собой канонические сайты метилирования, играют роль в изменении активности Pdcd4 [25].
Характер экспрессии Pdcd 4
Частая потеря экспрессии Pdcd4 в опухолевых клетках и полученные экспериментальные данные, свидетельствующие о анти-неопластическом эффекте восстановления экспрессии Pdcd4, делают Pdcd4 привлекательной мишенью и для генной терапии опухолей, в основе которой лежит восстановление функций Pdcd4 в опухолевых клетках. Перспективность этого подхода подтверждается результатами, полученными на модели мышей, экспрессирующих трансген Pdcd4 в эпидермисе. Трансгенные по Pdcd4 мыши характеризовались значительным снижением частоты формирования папиллом и карцином и частоты перерождения папиллом в карциномы по сравнению с мышами дикого типа при экспериментальном канцерогенезе кожи [103]. Эти результаты демонстрируют потенциал экзогенной экспрессии Pdcd4 в предотвращении возникновения новообразований и ингибировании их злокачественной прогрессии. Потенциальная анти-неопластическая эффективность экспрессии экзогенного Pdcd4 была также продемонстрирована в работах Хванга с соавторами и Джина с соавторами [31,32] по аэрозольной доставке модуля для экспрессии Pdcd4 в легкие мышей, трансгенных по репортерному гену люциферазы под контролем АР-1-зависимого промотора, и в легкие мышей с K-Ras-зависимым канцерогенезом легких. Экспрессия экзогенного Pdcd4 в этих экспериментальных моделях приводила к увеличенному уровню апоптоза в легких, интерференции с пролиферативными сигнальными путями, а также к ингибированию ангиогенных сигнальных путей и АР-1-зависимой транскрипционной активности. В то же время остается неясным, будет ли экспрессия экзогенного Pdcd4 одинаково эффективна и в качестве профилактического средства, как это было продемонстрировано в работе Янсена и соавторов [103], и как способ терапии уже сформировавшихся опухолей. В пользу потенциальной эффективности как средства для терапии опухолей говорит ряд экспериментальных фактов, в частности, ингибирование подвижности и инвазивности опухолевых клеток в культуре [6,33,54,73,75,115], индукция их апоптотической гибели [96,98] и повышенная чувствительность к действию определенных химиотерапевтических агентов [116] в ответ на восстановление экспрессии Pdcd4. Однако, как упоминалось ранее, эффект экспрессии экзогенного Pdcd4 может сильно варьировать в зависимости от типа клеток. Кроме того, в опухолевых клетках супрессия Pdcd4 происходит не только на уровне транскрипции, но и посредством микроРНК-зависимого ингибирования трансляции белка и его пост-трансляционной деградации. Активация механизмов, ответственных за пост-транскрипционную супрессию уровня белка Pdcd4, которая часто происходит в опухолевых клетках, будет приводить и к снижению экзогенно продуцируемого белка Pdcd4, тем самым потенциально нивелируя ожидаемый эффект.
Кроме того, последние данные указывают на то, что трансляция многих мРНК, кодирующих важные онкогены и транскрипционные факторы зависит от РНК хеликазы eIF4A, которая требуется для того чтобы разрешить структуру G-квадродуплексов [129]. Было замечено, что 5" -НТО часто совпадают с предсказанными структурами G-квадродуплексов [130]. Таким образом, РНК хеликаза eIF4A является лимитирующим звеном в трансляции тех мРНК, которые несут G-квадродуплексы в составе своих 5" -НТО. Эти данные указывает на то, что ингибирование РНК хеликазы eIF4A может представлять собой эффективную антираковую терапию. A Pdcd4, как уже упоминалось, способен взаимодействовать с еШ4А, и тем самым приводить к ингибированию ее хеликазной активности. Помимо этого было показано, что eIF4F является причиной устойчивости к анти-BRAF и к анти-МЕК раковой терапии [131]. Авторы исследования показали, что комбинирование препаратов ингибирующих комплекс eIF4F либо за счет блокирования взаимодествия eIF4E и eIF4G, либо за счет воздействия на еШ4А, а так же препаратов ингибирующих BRAF и/или МЕК может привести к преодолению механизмов устойчивости к антираковой терапии при BRAF(V600) меланоме.
Процесс ангиогенеза является существенным для роста и прогрессии опухоли [132]. Кругом и соавторами было выявлено ингибирующее действие Pdcd4 на процессы ангиогенеза [133]. Авторы показали, что в нейроэндокринной клеточной линии Воп-1 и в клеточной линии колоректальной карциномы НСТ116 в результате нокаутирования Pdcd4 наблюдался повышенный уровень ангиопоэтина-2 (Ang-2) как на уровне белка, так и на уровне мРНК. Повышение экспрессии Ang-2 в клетках линии Воп-1 дикого типа приводило к повышению пролиферации, повышению скорости образования колоний, а так же снижало клеточную адгезию. Наиболее вероятно, что стимуляция Ang-2 вызвана повышенной активацией АР-1, однако это не исключает вовлечение и других сигнальных каскадов. Ang-2 является модулятором ремоделирования сосудов. Воздействие супернатантов, полученных от клеток, нокаутных по Pdcd4, на клетки эндотелия, приводило к снижению их адгезии и повышению уровня формирования колоний. Эти данные впервые продемонстрировали прямое ингибирующее влияние Pdcd4 на Ang-2 и соответственно, на процесс ангиогенеза. Новый механизм действия опухолевого супрессора Pdcd4 делает его еще более привлекательной мишенью для новых терапевтических стратегий в лечении раковых опухолей. Помимо этого, как уже упоминалось, аэрозольная доставка модуля для экспрессии Pdcd4 в легкие мышей с K-Ras-зависимым канцерогенезом легких приводила к увеличению числа клеток, претерпевающих апоптоз в легких, интерференции с пролиферативными сигнальными путями, а также к ингибированию ангиогенных сигнальных путей [31,32]. Авторы показали, что экспрессия индукторов ангиогенеза VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor - фактор роста эндотелия сосудов) и FGF-2 (Fibroblast Growth Factor - фактор роста фибробластов) была значительно понижена в легких мышей с K-Ras-зависимым канцерогенезом после аэрозольной доставки модуля для экспрессии Pdcd4 по сравнению с контрольной группой. VEGF является наиболее значимым ростовым фактором, вовлеченным в ангиогенез, так как в результате его действия улучшается обеспечение тканей, окружающих опухоль, питательными веществами, усиливается проницаемость сосудов, а так же индуцируется метастазирование [134,135]. Многими группами ученых показана связь между VEGF и ростом сосудов опухоли, а так же резистентностью к химиотерапии и плохим прогнозом при НМКРЛ [136]. FGF-2 так же является известным индуктором ангиогенеза и опухолевого роста [137]. Авторы показали, что аэрозольная доставка модуля для экспрессии Pdcd4 приводила к супрессии обоих вышеупомянутых ангиогенных факторов роста, что укзывает на то, что аэрозольная доставка модуля для экспрессии Pdcd4 может быть многообещающим агентом для лечения рака легких.
Выделение РНК и ПНР в реальном времени
Для исследования эффекта участка 3-НТО на экспрессию репортерного гена, клетки линии NCI-H1299 и Calu-I трансфицировали плазмидой pRL-CMV с клонированным участком 3-НТО Pdcd4 или его мутированной версией, а так же плазмидой pGL3-Control, которая кодирует люциферазу светлячка под контролем промотора и энхансера SV40. Активности люциферазы Renilla и люциферазы светлячка определяли через 48 часов после трансфекции при помощи набора реагентов «Dual-Luciferase Reporter Assay System» производства («Promega», США). Для каждого анализа каждая экспериментальная точка измерялась трижды. Активность люциферазы Renilla нормализировали на активность люциферазы светлячка для каждой лунки. Затем подсчитывали среднее значение активности и ± стандартное отклонение. Каждый эксперимент повторяли трижды для подтверждения достоверности полученных результатов.
Для анализа активности промотора Pdcd4 клетки линии NCI-H1299 и Calu-I трансфицировали плазмидой, содержащей люциферазу светлячка под контролем промотора гена Pdcd4, и плазмидой pRL-CMV, кодирующей люциферазу Renilla под контролем конститутивного промотора CMV. Относительные значения активности промотора подсчитывали, как описано выше, но люцифераза светлячка была нормирована на люциферазу Renilla.
Активацию промотора Pdcd4 детектировали с использованием набора реагентов «Dual-Luciferase Reporter Assay System» производства («Promega», США). Для проведения двойного люциферазного анализа клетки линий рака легких человека высевали в 24-луночный планшет, в количестве 1,5x10 клеток на лунку. Через 18-20 часов клетки трансфицировали 100 нг плазмидной ДНК pGL3 («Promega», США), 2 нг плазмидной ДНК pRL-CMV («Promega», США). Через 48 часов после трансфекции клетки лизировали и детектировали интенсивность биолюминесценции в образцах, используя люменометр Glomax 20\20 Luminometer («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Каждый эксперимент проводили 3 раза, после чего вычисляли арифметическое среднее значение и стандартное отклонение.
При обработке результатов двойного люциферазного анализа, ПНР в реальном времени, а так же при измерении интенсивности сигнала антител при Вестерн-блот анализе, использовали стандартные статистические методы. Измерения проводились как минимум в трех независимых экспериментах, после чего вычисляли арифметическое среднее значение для трех независимых измерений ± стандартное отклонение, показанное с помощью планок погрешностей. Оценку достоверности различий между исследуемыми группами проводили с использованием U-теста Манна-Уитни. Вычисление проводили с помощью онлайн программы статистической обработки http://www.psychol-ok.ru/statistics/mann-whitney/. Различия средних показателей считали достоверными при уровне значимости менее 0.05
Функциональная роль Pdcd4 как супрессора опухолевого роста впервые была показана на примере рака кожи, на модели мышиных эпидермальных клеток линии JB6, претерпевающих неопластическую трансформацию [4]. Меланома - одна из наиболее агрессивных форм опухолей, отличающаяся способностью быстро распространяться через лимфатические и кровяные русла организма [171,172]. Способность быстро метастазировать на ранних стадиях заболевания обуславливает высокую смертность больных, а также часто наблюдаемую неэффективность проводимого лечения, что делает актуальным поиск новых способов терапии меланомы, в том числе с учетом индивидуальных молекулярных особенностей опухоли.
Экспрессия супрессора опухолевого роста Pdcd4, как это было показано на примере рака толстой кишки [84], немелкоклеточного рака легких [108,109], глиомы [106], гепатоклеточной карциномы [96], плоскоклеточной карциномы полости рта [127], часто снижена в опухолевых клетках. Известно, что потеря экспрессии белка Pdcd4 в большинстве случаев связана с прогрессией раковых опухолей. Такая корреляция была показана для опухолей кишечника [84], яичников [128] и рака легких [109]. Однако изменение уровня экспрессии Pdcd4 в клетках меланом остается малоизученым. Так, в недавно опубликованной работе авторы показали, что уровень транскрипта Pdcd4 и его продукта белка Pdcd4 снижены в клетках мышиной меланомы линии В16 по сравнению с клетками нормальной ткани [173]. При экспериментальном повышении экспрессии Pdcd4 в этих клетках скорость их пролиферации и миграции снижалась. Все эти данные свидетельствуют о возможной роли сохранения уровня экспрессии белка Pdcd4 как фактора, препятствующему развитию и прогрессии меланом.
Поскольку роль Pdcd4 в прогрессии меланомы остается неизвестной, нами был проведен анализ экспрессии Pdcd4 на панели клеточных линий меланом человека. Сначала был проанализирован уровень экспрессии Pdcd4 в нормальных человеческих эпидермальных меланоцитах (НЕМ) с помощью Вестерн-блот анализа клеточного лизата и антител к белку Pdcd4. Антитела против белка Pdcd4 были получены ранее в нашей лаборатории, для них была показана высокая специфичность и способность детектировать белок Pdcd4 на эндогенном уровне [108].
Вклад микроРНК miR-21 и miR-183 в рапамицин-зависимую супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках линии рака легких
Известно, что пониженный уровень Pdcd4 в клетках рака легких может быть восстановлен ингибированием активности комплекса mTORCl ингибитором рапамицином, а так же ингибированием активатора mTOR PI3K киназы при помощи ингибитора LY294002 [97]. Однако, как показали результаты наших исследований, известные механизмы пост-транскрипционной регуляция Pdcd4 не могут полностью объяснить пониженный уровень Pdcd4, который наблюдается в клетках рака легких. Полученные ранее другими исследователями данные указывают на то, что изменение уровня транскрипции гена Pdcd4 может вносить вклад в общую супрессию Pdcd4 в опухолевых клетках. Модификации ДНК, такие как гиперметилирование CpG островков, может приводить к инактивации генов опухолевых супрессоров и, тем самым, к развитию раковых опухолей [194]. Так, аномальное гиперметилирование участка промотора гена Pdcd4 было продемонстрировано на примере глиом и приводило к понижению уровня его транскрипции, и такое понижение, в свою очередь, могло быть восстановлено ингибитором ДНК метилтрансферазы [59]. Не так давно было показано, что изменения содержания транскрипционного фактора ZBP-89 так же может приводить к изменению уровня экспрессии Pdcd4 [195]. Авторы показали, что транскрипционный фактор ZBP-89 играет важную роль в транскрипции Pdcd4, и уровни Pdcd4 и мРНК ZBP-89 в опухолевых клеточных линиях демонстрируют существенную корреляцию. Факт такой корреляции дает основание полагать, что понижение уровня экспрессии ZBP-89 в раковых клетках может играть заметную роль в процессе понижения экспрессии Pdcd4 в клетках рака легких на стадии транскрипции. Поэтому, для дальнейшего исследования механизма супрессии Pdcd4 в клетках линии рака легких, был проведен анализ влияния блокирования PBK/Akt/mTOR-сигнального пути на транскрипцию гена Pdcd4, которое может приводить к снижению уровня транскрипта Pdcd4 в клетках рака легкого. 6.8.1. Способность ингибитора mTOR рапамицина оказывать действие на активность промоторной области гена Pdcd4
Нами была исследована возможность реализации эффекта рапамицина на уровень транскрипта Pdcd4 через регуляцию транскрипции гена Pdcd4. Для этого мы проанализировали влияние действия рапамицина на активность репортерного гена люциферазы светлячка под контролем 5" -фланкирующего участка гена Pdcd4 размером около 3 т.п.н. (от позиции -2851 до +550 нт). В обеих исследованных клеточных линиях, Calu-I и в NCI-H1299, рапамицин приводил к увеличению промоторной активности исследуемого фрагмента 5" -области гена Pdcd4 в 2 и в 1.5 раза, соответственно (Рис. 26). Таким образом, ингибирование компонента Akt-сигнального пути, сигнального комплекса mTORCl, рапамицином вызывает индукцию транскрипции с промотора гена Pdcd4 в клетках рака легкого. Таким образом, нами выявлен новый ранее неизвестный механизм, при котором активация Akt-сигнального пути приводит к ингибированию транскрипции гена супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках, и ингибитор mTORCl рапамицин способен усиливать транскрипцию гена Pdcd4 через г/г/с-регуляторный элемент(ы), локализованный(ые) на участке гена Pdcd4 между нуклеотидами -2851 и +550.
Способность рапамицина блокировать активность mTORCl, в результате чего происходит повышение транскрипции Pdcd4, говорит о том, что активация проонкогенного mTOR-сигнального пути способна воздействовать на уровень продукции Pdcd4 на транскрипционном уровне. Наши данные указывают на то, что активация Akt-сигнального пути ингибирует транскрипцию гена супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках. Схожие данные, свидетельствующие о том, что рапамицин повышает уровень мРНК Pdcd4, были недавно получены и на клетках гепатоклеточной карциномы линии Huh7 [86], что подтверждает открытый нами феномен. Таким образом, Akt/mTOR/S6Kl-сигнальный путь может контролировать как деградацию белка Pdcd4, так и транскрипцию гена Pdcd4. Рис. 26. Анализ активности репортерного гена люциферазы светлячка под контролем фрагмента 5 -области гена Pdcd4 (нт от -2851 до +550) в клетках линии Calu-I и NCI-H1299, обработанных (светлые столбцы) или необработанных (темные столбцы) рапамицином. Клетки обрабатывали рапамицином в концентрации 20 нг/мл в течение 18 часов. Активность люциферазы светлячка нормализовали на активность люциферазы Renilla. Представлены данные трех независимых экспериментов в виде относительных единиц люминесценции (ОЕЛ), как среднее значение трех независимых измерений ± стандартное отклонение. Значение ОЕЛ в клетках, обработанных рапамицином, нормировали относительно необработанных клеток, в которых значение ОЕЛ было принято за 1,0. - Р 0.05.
Картирование минимального фрагмента промотора гена Pdcd4, ответственного за влияние Akt-сигнального пути на транскрипционную активность промотора гена Pdcd4
После установления того, что область от позиции -2851 до +550 нт гена Pdcd4 человека обеспечивает способность рапамицина вызывать увеличение транскрипционной активности, нами было проведено исследование, направленное на установление минимальной области использованного нами фрагмента 5У -области гена Pdcd4, обуславливающего этот эффект. Для этого из 5 -области гена Pdcd4 от позиции -2851 до +550 нт была получена серия из семи делеционных мутантов, сшитых с репортерным геном люциферазы светлячка (Рис. 27, левая панель). Анализ действия рапамицина на активность репортерного гена в клетках линии Calu-I под контролем различных делеционных мутантов 5"-области гена Pdcd4 между нуклеотидами -2851 и +550 показал, что участок, обуславливающий чувствительность к рапамицину, расположен внутри фрагмента от нуклеотидов в позиции -53 до позиции +196 (Рис. 27). Данный участок гена, содержащий нетранслируемый экзон 1 (от нт +1 до нт +182) и часть интрона А, сохраняет способность к увеличению транскрипции репортерного гена при обработке клеток рапамицином, в то время как дальнейшая 5" -концевая делеция и удаление экзона 1 приводила и к потере транкрипционной активности репортерного гена в целом, и к потере ее зависимости от обработки рапамицином.
Похожие диссертации на Исследование молекулярных механизмов дерегуляции супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках
