Содержание к диссертации
Введение
2. Литературный обзор 7
2.1. Белки теплового шока, их индукторы и классификация. 7
2.2. Структура и свойства Hsp70 16
2.3. Молекулярные механизмы апоптоза и протективная функция Hsp70 20
2.4. Экспрессия белков теплового шока в опухолевых клетках 29
2.5. Hsp70 и иммуногенность опухолей 31
2.6. Роль шаперонов в нейропатологиях 33
3. Материалы и методы 45
3.1. Клеточные линии и их культивирование 45
3.2. Животные 46
3.3. Белки 46
3.4. Антитела. 46
3.5. Электрофоретические методы . 47
3.6. Очистка Hsp70 для иммунизации и использования в опытахпо введению в клетки и/или в культуральную среду. 47
3.7. Иммунохимические методы 49
3.8. Конфокальная микроскопия 50
3.9. Filter Trap Assay 50
3.10. Protein Interaction Assay (PIA) 51
4. Результаты 52
4.1. Работа шаперонного аппарата клетки в процессе реакции на тепловой стресс 52
4.2. Защитная роль Hsp70 в опухолевых клетках . 64
4.2.1. Диагностикум для определения концентрации Hsp70 в биологических жидкостях. 64
4.2.2. Анализ экспрессии белков-шаперонов, Hsp70 и Hdj1, в опухолевых клетках человека. 66
4.2.3. Зависимость устойчивости опухолевых клеток к индукторам апоптоза от уровня экспрессии Hsp70.
4.2.4. Вмешательство Hsp70 в сигнальные пути апоптоза, подавление действия эффекторных каспаз 94
4.2.5. Комплексы шаперона Hsp70 с членами семейства NF-KB.
4.2.6. Поверхностный белок клеток рабдомиосаркомы крыс, р58, ответственный за метастазирование в легкие, ассоциирован с
4.3.5. Введение животным препарата очищенного Hsp70 приводит к предотвращению формирования опухолевых узлов влегких при введении опухолевых клеток. 104
4.3. Hsp70 во внеклеточном пространстве.
4.3.1. В экспорт Hsp70 вовлечены сигнальные механизмы клетки.
4.3.2. Примеры интернализации белка клетками разного тканевого происхождения.
4.3.3. Защитные свойства экзогенного Hsp70.
4.4. Hsp70 и нейродегенеративные заболевания .
4.4.1. Формирование агрегатов мутантных белков в нервных клетках приводит к их гибели
4.4.2. Hsp70, проникая в нервные клетки, подавляет процесс образования агрегатов и отменяет апоптоз
4.4.3. Hsp70, введенный животным, корректирует поведение бульб- эктомированных животных (модель болезни Альцгеймера).
4.5. Защитное действие Hsp70 в моделях психо-физического стресса
Обсуждение 143
Выводы 152
Список литературы 155
- Молекулярные механизмы апоптоза и протективная функция Hsp70
- Электрофоретические методы
- Защитная роль Hsp70 в опухолевых клетках
- Hsp70 и нейродегенеративные заболевания
Введение к работе
Белок Hsp70 является индуцибельным представителем семейства белков теплового шока БТШ70 или Hsp70. HSP необходимы клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов, как ксенобиотических, так и естественного происхождения. Структура Hsp70, как и других HSP, очень консервативна; достаточно отметить, что бактериальный аналог Hsp70, DnaK, по своим свойствам очень напоминает соответствующий белок млекопитающих, а их гены содержат более 50% гомологичных последовательностей.
Hsp70 - первый белок, названный шапероном. Функция шаперонов в клетке заключается в том, что они связываются с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами и помогают им принять нативную конформацию; шапероны также участвуют в доставке белков в определенные органеллы. Шапероны способны находить в полипептидах-мишенях гидрофобные участки, которые открыты у поврежденных белков или могут открываться у нормальных, зрелых клеточных белков в момент изменения их конформации. Подобные конформационные изменения происходят, например, вследствие каскадных модификаций белков в процессе передачи клеточного сигнала. Белки семейства Hsp70 являются одними из основных элементов систем контроля за качеством белков, и участвуют в работе всех систем жизнеобеспечения клетки.
Шаперонную активность обычно связывают с защитной функцией Hsp70. То, что шаперон спасает клетки от огромного числа факторов, в том числе, вызывающих апоптоз, было подтверждено в многочисленных опытх in vitro и in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции.
Несмотря на огромное число исследований, посвященных различным аспектам функционирования Hsp70, нерешенным остается множество вопросов, имеющих принципиальное значение. Хотя Hsp70 и считается индуцибельным, что означает, что его экспрессия резко возрастает в ответ на стресс, в клетках человека его синтез, хотя и на невысоком уровне, происходит и в нормальных условиях. Надо отметить, что в разных тканях и клетках организма степень экспрессии Hsp70 различается. Например, она очень высока в тканях сердца, и крайне низка (и не запускается в ответ на стресс) в некоторых типах нейронов головного мозга. Уровень экспрессии Hsp70 высок в опухолях, особенно злокачественных. В связи с этим возникает ряд вопросов. Каковы последствия высокого уровня экспрессии Hsp70 в опухолевых клетках? Не ясно, каким образом нервные клетки защищаются от неблагоприятных факторов, к примеру, от формирования нерастворимых белковых агрегатов в нервных клетках головного мозга при некоторых наследственных нейродегенеративных заболеваниях, а также в клетках мозга пожилых людей.
Несколько лет тому назад появились данные о том, что Hsp70, ранее считавшийся исключительно цитоплазматическим белком, может находиться во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях человека. В этой связи имеет существенное значение ответ на следующие вопросы: каким образом белок может покидать клетку, какое действие он может оказать на другие клетки, находящиеся вблизи или в отдалении от клетки-донора, может ли он интернализоваться клетками-акцепторами? Цель настоящей работы была ответить на эти вопросы.
Молекулярные механизмы апоптоза и протективная функция Hsp70
Апоптоз - это активная генетически контролируемая программа саморазрушения, требующая участия специфических протеолитических ферментов (каспаз) и эндонуклеаз (Kerr et al., 1972; Sen, 1992; Thompson, 1995). Термин «апоптоз» (в переводе с греческого - «листопад») впервые использовали Керр и его коллеги (Kerr et al., 1972) для описания морфологических особенностей клеток, подвергающихся дегенерации в различных патологических ситуациях. Апоптоз представляет собой энергоемкий процесс, зачастую требующий синтеза новых белков в клетке, и сопровождается активацией клеточных сигнальных систем (Herget, Коек, 1999). Необходимо отметить, что морфологические изменения, сопровождающие программированную гибель клетки, резко отличаются от событий, происходящих при некрозе. Основные отличительные признаки некроза и апоптоза представлены в таблице 1.
Процесс апоптоза принято делить на несколько этапов. На начальной стадии происходит восприятие клеткой апоптотозного стимула. Стимулами могут стать нерепарируемые повреждения ДНК, избыток или недостаток гормонов и ростовых факторов, утрата контакта с базальной мембраной или соседними клетками, несвоевременная экспрессия генов - регуляторов клеточного цикла, вирусная инфекция и некоторые фармакологические агенты, в том числе противоопухолевые препараты, используемые в клинике (Ashkenazi, Dixit, 1998; Green, Reed, 1998; Evan, Littlewood, 1998). После восприятия апоптотического стимула клетка вступает в так называемую фазу коммитации - период, во время которого она может нормально жить и функционировать, но ее гибель уже предопределена. Эта фаза может длиться часы и дни. Финальная фаза, собственно фаза гибели, существенно короче (от 15 минут до 1ч) и сопровождается специфическими морфологическими и биохимическими изменениями, отсутствующими при некрозе. Эта фаза очень консервативна, т.е. протекает сходным образом у всех изученных к настоящему моменту типов клеток. Хроматин в ядре постепенно конденсируется, располагаясь вблизи ядерной оболочки, впоследствии он может распадаться на фрагменты. Общий объем клетки уменьшается, происходит компактизация клеточных органелл. Клетка теряет контакт с соседними клетками и базальной мембраной, происходит ее фрагментация и образование так называемых апоптозных телец. На поверхности клетки появляется фосфатидилсериновый маркер для фагоцитоза макрофагами или соседними клетками. Воспалительная реакция, типичная для некроза, в случае программируемой клеточной гибели отсутствует (Herget, Коек, 1999).
Одним из ключевых механизмов в процессе апоптоза является протеолиз. Существует несколько семейств протеаз, участвующих в осуществлении программированной клеточной гибели, но наиболее важными из них являются каспазы (caspase - cysteine-dependent aspartate-specific proteases). Фактически, каспазная активность служит маркером апоптоза. Каспазы синтезируются в клетке в виде неактивного профермента (прокаспаз или зимогенов) и способны активироваться вследствие протеолитического отщепления N-концевого продомена и расщепления по аспарагиновой кислоте. В результате образуются две субъединицы, большая и малая, которые немедленно ассоциируют друг с другом и образуют активный комплекс (рис. 2). Экспериментально доказано, что активация прокаспаз имеет каскадный характер и по своему принципу напоминает процесс, происходящий при последовательной активации факторов свертывания крови (Thornberry, Lazebnik, 1998; Herget, Kock, 1999).
В зависимости от своего положения в каскаде каспазы разделяют на две группы - инициирующие, действующие на верхних этажах каскада (каспазы 2, 8, 9 и 10), и эффекторные каспазы (3, 6, 7 и 14). Функция их сейчас хорошо изучена, и можно сказать, что каспазы 3 и 7, по-видимому, играют наиболее важную роль на последних этапах процесса.Существует, по меньшей мере, два канонических пути запуска апоптоза при активации «рецептора смерти». В первом из них сигнал с рецепторов, например, суперсемейства TNF-R или Fas инициирует каспазу 8, а та в свою очередь запускает активацию эффекторных каспаз 3 и 7 (рис. 3). Во втором, роль каспазы 8 в запуске каскада эффекторных каспаз очень мала по сравнению с ролью каспазы 9. В этом случае под действием активированной каспазы 8 происходит протеолиз белка Bid. N-терминальная часть молекулы отщепляется, а С-терминальный фрагмент tBid вызывает олигомеризацию белка Вах. Обычно Вах локализуется в цитоплазме. В неактивной форме он имеет такую конформацию, при которой домен ВНЗ (bcl-2 homology domain 3) скрыт. Под действием tBid этот домен открывается. Активированный Вах олигомеризуется с другими молекулами Вах и формирует поры в митохондриальной мембране, через которые высвобождается цитохром с (Green, Evan, 2002). Сходным образом tBid запускает олигомеризацию другого проапоптотического белка Вак, что тоже приводит к формированию пор и высвобождению цитохрома с (рис. 3).Высвобождение цитохрома с - ключевое событие митохондриального пути апоптоза, так как оно ведет к сборке высокомолекулярного комплекса, активирующего каспазы - апоптосомы. При этом цитохром с связывается с белком Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1). Этот белок содержит участок гомологии с белком Ced-4. Домен Ced-4 с одной стороны граничит с CARD - доменом, необходимым для связывания с прокаспазой 9 , а с другой - с повторами WD-40, участвующими в белок-белковых взаимодействиях.
Неактивный Apaf-1 находится в мономерной форме, и его N-терминальный CARD-домен маскируется С-терминальными WD повторами (рис.3). Формирование апоптосомы происходит следующим образом. Связывание цитохрома с с WD-повторами индуцирует конформационное изменение Apaf-1, высвобождающее доменов CARD и Ced-4. Ced-4 -домен участвует в процессе олигомеризации Apaf-1. Олигомеризация Apaf-1 сопровождается вовлечением в формирующийся комплекс прокаспазы 9 и ее аутокаталитической активацией.Активная каспаза 9 может высвобождаться из апоптосомы и запускать каскад эффекторных каспаз. Интересно, что часть зрелых
Электрофоретические методы
Моноклональные антитела к Hsp70 (клоны ЗВ5 и 2Н9), Hdj1 (клоны J25 и J32), Hsc70 (клон N69) были получены в Лаборатории защитных механизмов клеток с использованием стандартной гибридомной технологии. Поликлональные антитела к Hsp70 (R22), Bag-1, р58 также были получены в Лаборатории путем иммунизации кроликов соответствующими антигенами. Антитела к каспазам 3 и 7, а также субстрату их реакции белку PARP, были получены от д-ров Юрия Лазебника (Cold Spring Harbor Laboratory, США) и Бориса Животовского (Karolinska University, Швеция). SDS-электроФорез в полиакриламидном геле производился по Лаэммли (Laemmli, 1970); концентрация геля выбиралась в зависимости от массы разделяемых белков. Для окраски гелей на общий белок использовали Кумасси голубой G. Двухмерный электрофорез производился по протоколу О Фаррела (O Farrell, 1975) с небольшими модификациями. В первом измерении белки разделяли с помощью изоэлектрического Фокусирования (ИЭФ, IEF) в градиенте рН4.5-6.5, созданном с использованием систем Амфолин (Ampholine LKB, Швеция) или Фармалит (Pharmalyte, Pharmacia Biotec, Швеция) после чего окрашенные и инкубированные в растворе, содержащем SDS, цилиндрики геля переносили на гель второго измерения, т.е. SDS-диск электрофореза. Поскольку ранее было установлено, что бедренная (медленная, красная) мышца содержит значительные количества Hsp70 (Guerriero et al., 1989), препарат белка выделяли именно из такой мышцы.
Для очистки белка использовался протокол, включающий этап аффинной хроматографии на геле агарозы с иммобилизованным АТФ (Sigma, А2767). Сначала экстракт из мышцы после фильтрации подвергали анионообменной хроматографии с использованием DEAE-Sepharose 4В FF (Amersham/Pharmacia, Sweden), и фракции элюата, содержащие по данным иммуноблоттинга Hsp70, наносили на колонку АТФ-агарозы. После промывок колонки специфически связанные с матрицей белки элюировали раствором, содержащим 3 мМ АТФ (Welch, Feramisco, 1985; Guerriero et al., 1989; Margulis, Welsh, 1991). Если белковый препарат требовался для введения в культуральную среду, его шаперонную активность восстанавливли удалением Mg/АТФ и последующим осаждением сульфатом аммония. Для удаления возможных контаминации эндотоксинами раствор белка после повторного суспендироваиия в фосфатно-солевой буферной смеси пропускали через колонку с гелем DeToxi Gel (Pierce, США). Конечный препарат содержал по данным электрофореза два компонента семейства Hsp70, индуцибельный, Hsp70, и конститутивный, Hsc70, в соотношении приблизительно 7:3. Степень очистки Hsp70/Hsc70 составляла не менее 99%. Для получения поликлональных антител к полипептидам семейства Hsp70 получали смешанные образцы, состоящие из восстановленного белка (см предыдущий пункт), а также термоденатурированного белка и его же, иммобилизованного на нитроцеллюлозной мембране. Суммарная разовая инъекция составляла 100 мкг на животное (кролик).
Антитела из сыворотки иммунных животных преципитировали сульфатом аммония и далее пропускали через колонку с гелем Сефарозы, на котором был иммобилизован очищенный Hsp70/Hsc70. Фракцию иммуноглобулинов элюировали буфером глицин-НСІ, рН2.5. Очищенные антителатестировали с помощью методов методы иммуноблоттинга и иммунопреципитации. Для получения моноклональных антител использовали антиген, приготовленный аналогичным способом. Тестирование клонов проводили с помощью иммуноферментного анализа, и для определения специфичности антител использовали методы иммуноблоттинга, непрямой иммунофлуоресценции и иммунопреципитации. 3.7. Следующие иммунохимические методы применялись в работе. -Иммуноферментный анализ-для определения специфичности моно- и поликлональных антител, а также для построения иммуно-диагностических систем детекции Hsp70. -Иммуноблоттинг- в целях определения количеств Hsp70 в клеточных или тканевых пробах и для анализа межбелковых взаимодействий. -Иммунофлуоресценция - для локализации Hsp70 и связанных с ним белков в клетках. -Цитофотометрия в потоке - для определения количества клеток, содержащих определенные количества Hsp70. -
Иммунопреципитация - для определения способности антител связывать нативный антиген и для анализа межбелковых взаимодействий. Far-western blotting Лизаты клеток U-937 и U-937HSP, контрольные и после 6ч индукции ADR иммунопреципитировали с антителами против каспаз 3 и 7 с помощью Protein G- Sepharose. После электрофореза и переноса на нитроцеллюлозную мембрану, полоски фильтров инкубировали в растворе, содержащем 5 мкг/мл изолированного Hsp70 в TBS. Мембрану промывали TBS с 0.05% Tween-20 и переносили в раствор с антителами 2Н9. Чтобы уточнить позицию обеих каспаз на блоте, клеточные лизаты наносились в тот же электрофорезный блок и после переноса на нитроцеллюлозныи фильтр инкубировались с антителами к каспазе 3 или 9.
Защитная роль Hsp70 в опухолевых клетках
Для того чтобы определять количество Hsp70 в клеточных, тканевых экстрактах или биологических жидкостях, необходим простой и доступный инструмент. Метод иммуноблоттинга в данном случае представляется не применимым, поскольку количество детектируемого белка слишком мало, а белки, например, сыворотки крови с аналогичной молекулярной массой способны маскировать Hsp70 на блоте. Более подходящей является комбинация иммуноблоттинга с предварительной иммунопреципитацией, однако подобная стратегия требует высокой квалификации персонала, занимает много времени и достаточно трудоемка. Кроме того, иммуноблоттинг нельзя назвать количественным методом определения белка.
Наиболее перспективным, особенно для массового скрининга биологических жидкостей, представляется иммуноферментный анализ. Этот метод широко применяется в медицинской практике, например для определения уровня гормонов в крови. Как правило, подобный набор организован следующим образом: на дне лунки помещаются антитела (capture antibody) против интересующего белка. Далее в эти лунки вносится биологическая жидкость, и, если в ней искомый белок присутствует, он узнается и связывается антителами. После отмывки снова вносятся антитела к интересующему белку, но эти антитела (detection antibody) должны быть направлены к другому домену молекулы выявляемого белка. В случае Hsp70 получить подобную пару антител очень сложно, большинство существующих моно- и поликлональных антител направлены против С-терминальной части молекулы, и узнают участки между 420 и 560 аминокислотными остатками; поэтому между специфическими антителами существует конкуренция за близко расположенные сайты узнавания.
В течение последних 15 лет предпринимались попытки создать подобный набор. Один из таких наборов выглядел следующим образом: на лунки 96-луночной платы иммобилизовались поликлональные антитела к Hsp70, и после промывки лунок, в них вносили исследуемые образцы, смешанные с определенным количеством препарата очищенного и биотинилированного Hsp70; последний конкурировал с выявляемым белком за связь с антителами. После еще одной промывки в лунки вносился авидин, конъюгированныи с пероксидазои хрена, который связывался с биотинилированным шапероном, перекись водорода и хромоген. Интенсивность окраски была обратно пропорциональна количеству белка в пробе. Чувствительность этого метода была 40 нг/мл (Margulis et al., 1991).
В 2000 году канадская фирма StressGen объявила о создании набора для определения Hsp70. Принцип его работы представляет собой коммерческую тайну. Чувствительность этого набора - 200 пкг/мл, а стандартная кривая находится в промежутке 0.78нг/мл - 50 нг/мл. К сожалению, стоимость этого набора непомерно высока, и этот факт побудил нас к очередной попытке создать доступный аналог. Мы использовали свойство Hsp70 высокоспецифично взаимодействовать с иммобилизованным аденозинтрифосфатом (АТФ). АТФ пришивали к гексаметилендиамину и полученную таким образом производную конъюгировали с овальбумином, используя длинный гидрофильный спэйсер (SMBP, Pierce). Сконструированный белок иммобилизовали на поверхности лунок 96-луночного планшета платы, и после промывки в последние вносили исследуемые образцы биологических жидкостей или стандартные образцы очищенного белка. После дополнительных промывок в лунки вносили раствор поликлональных антител R22 и далее - антитела против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чувствительность нашего набора - 250 пкг/мл (Новоселов и др., 2004в).
Мы сравнили содержание Hsp70 и Hdj1 в клетках злокачественных и доброкачественных опухолей женской урогенитальной сферы и молочной железы, диагностированных с октября 2002 года по апрель 2003 г в Онкологическом городском диспансере Санкт-Петербурга. Для более точного количественного анализа содержания Hsp70 в опухолевых клетках мы использовали оригинальный диагностикум, основанный на принципе иммуноферментного анализа, который был описан в разделе 4.2.1. Результаты иммуноферментного анализа подтвердили данные, полученные с помощью иммуноблоттинга.
Было проанализировано 57 опухолевых образцов различных органов урогенитальной сферы (8 опухолей яичника, 19 опухолей эндометрия, 15 опухолей матки) и 15 опухолей молочной железы. 16 опухолей были доброкачественными, 41 - злокачественными. Пробы доставлялись не позднее 1 ч после операции, половину каждого образца замораживали при -20 С и хранили до момента иммунохимического анализа. Вторую половину пробы после фиксации в формалине использовали для постановки диагноза на основании морфологических изменений ткани.
Рисунок 11 демонстрирует распределение опухолевых образцов по содержанию Hsp70 и Hdj1. Данные представлены в нг/мг общего белка для Hsp70, определенные с помощью иммуноферментного набора, и О.Е. (относительные единицы, показывающие отношение уровня экспрессии Hdj1 к уровню экспрессии актина) -для Hdj1 (Новоселов и др., 2004а).Средний уровень экспрессии Hsp70 был повышен в злокачественных опухолях по сравнению с доброкачественными в тканях яичника (5000+600 и 2900+220нг/мг соответственно) и молочной железы (3600+190 и 2500+120 соответственно). Однако, это повышение не было статистически достоверным (Р=0,192 для опухолей яичника и Р=0,112 для опухолей молочной железы). Для опухолей матки не было отмечено повышение уровня Hsp70 в злокачественных новообразованиях по сравнению со доброкачественными (Р=0,035).
Уровень Hdj1, напротив, был значительно повышен в злокачественных образцах по сравнению с доброкачественными в тканях яичника (0,39+0,022 и 0,15+О.ОЮ.Е. соответственно) и матки (0,29+0,02 и 0,07+0,01 О.Е), см. рис.11. Такое повышение экспрессии Hdj-Ібьіло признано статистически достоверным (Р=0,02 для опухолей яичника и Р=0,04 для опухолей матки). В тканях молочной железы не было обнаружено корреляции между уровнем Hdj1 и злокачественностью.
Hsp70 и нейродегенеративные заболевания
Универсальность действия препарата Hsp70, показавшего защитный эффект во всех использованных нами моделях с применением разнообразных факторов, вызывающих апоптоз, побудила нас исследовать его поведение в моделях реальных болезней человека. Особый интерес представляли заболевания, в которых нарушения в работе шаперонного аппарата клетки могут иметь принципиальное значение. К таким заболеваниям относятся протеотоксические патологии, в которых патогеном являются неправильно свернутые полипептиды. В главе "Литературный обзор" был приведен список таких патологий (см. табл.3).
Типичная модель подобных заболеваний может быть получена, если трансфецировать клетки нейробластомы плазмидой, содержащей большое количество GAC-повторов. В наших экспериментах мы использовали подобную плазмиду, содержащую 103 GAC-повтора, Q103, и контрольную к ней - плазмиду, содержащую 25 повторов, Q25; в обеих конструкциях последовательность GAC-повторов были связаны с геном зеленого флуоресцирующего белка (EGFP), чтобы за процессом образования агресом можно было следить с помощью флуоресцентного микроскопа (см. рис.4). Обе плазмиды были предоставлены Д-ром Дэвидом Рубинштейном, Кэмбридж, Великобритания.
Белок, кодируемый короткой плазмидой, Q25-EGFP, был распределен в цитоплазме клеток SK-N-SH диффузно, и не влиял на жизнеспособность экспрессирующих его клеток. Если клетки были трансфецированы плазмидой Q103-EGFP, то через 48 час можно было наблюдать формирование ярких пятен, указывающих на формирование нерастворимых белковых агрегатов. Появление этих агрегатов приводило к изменениям в ядрах, характерных для процесса апоптоза, и через 72 час после трансфекции более 70% клеток, в которых экспрессировался мутантный белок, погибали по механизму апоптоза (рис.34).
Очевидно, что процесс образования нерастворимых белковых агрегатов связан с нарушениями в работе шаперонного и протеолитического аппаратов клетки. Почему шаперонная машина неудовлетворительно работает в нервных клетках? На этот вопрос есть несколько ответов. Во-первых, многие нейрональные клетки в терминальной стадии дифференцировки утрачивают способность к экспрессии Hsp70, в том числе и в ответ на стресс. Более того, клетки нейробластомы, индуцированные в нейрональную дифференцировку, утрачивают способность к базальной экспрессии Hsp70 (см. 4.3.2), или экспрессию в ответ на стресс (Dwyer et al., 1996). Поскольку глиальные клетки обладают способностью реагировать на стресс синтезом белков теплового шока и продуцируют солидные количества Hsp70, можно предположить, что нервные клетки получают шаперон из клеток глии, вместе с трофическими факторами (гл. 4.3.2). В-третьих, с возрастом работа шаперонного аппарата ухудшается. Хотя его базальныи уровень в клетках остается на довольно высоком уровне, способность к его экспрессии в ответ на стресс значительно ослабевает (Soti, Csermely, 2002).
Протективный эффект Hsp70 был показан в экспериментах с большим количеством цитотоксических факторов, включая и такие, как формирование полиглутаминовых трактов (Bonini, 2002; Adachi et а!., 2003). Эти данные заставили многих исследователей искать пути повышения уровня экспрессии Hsp70 в больных клетках. Действительно, одновременная трансфекция клеток полиглутаминовыми последовательностями большой длины и шаперонами Hsp70, Hdj1,2 вместе или отдельно, приводило к понижению образования нерастворимых белковых агрегатов и соответственно, спасало клетки от апоптоза (Sakahira et al., 2002; Zhou et al., 2001; Wyttenbach et al., 2002). Hsp70 был найден в составе агрессом, и его комплекс с нерастворимыми белками был динамичным (Kim et al., 2002).Из анализа литературных данных становится понятным, что повышение уровня шаперона в клетках должно стать основной целью терапии протеотоксических заболеваний. Однако трансфекция нейронов определенными генами в клинической практике представляется сомнительной, более вероятной видится доставка Hsp70 в больную клетку. Как было показано в предыдущей главе, белок способен входить в живые клетки, в том числе и в клетки нейробластомы SK-N-SH.
В наших опытах мы вносили очищенный препарат Hsp70 в разной концентрации в клетки SK-N-SH одновременно с трансфекцией их конструкциями, несущими 1 экзон хантингтина Q25 и Q103. Подсчет апоптозных ядер показал, что количество погибающих клеток значительно понижается, и защитный эффект Hsp70 является дозо-зависимым (рис.35а). Важно, чтобы шаперон находился в клетках до того, как агрессомы начнут формироваться, если вносить его позднее, то его защитный эффект заметно ослабевает. Чем позже после трансфекции вносили белок, тем слабее был его эффект (рис.356). Применение контрольного белка, сывороточного альбумина, а также инактивированного посредством кипячения в течение 2 мин препарата Hsp70/Hsc70 не оказывало влияния на количество погибших клеток. При введении в культуру клеток Hsp70 также снижалась активность эффекторных каспаз (рис. 35в).Чтобы проверить способность экзогенного Hsp70 связываться с полиглутаминовыми включениями, мы анализировали клетки с помощью конфокальной микроскопии. Биотинилированный Hsp70 детектировали с помощью стрептавидина, меченого TRITC (красный). В клетках, в которых не наблюдалось агрегатов, он был расположен диффузно, в то время как в клетках с агресомами он был колокализован с последними (рис. 37). В клетках, трансфецированных короткой последовательностью Q25 колокализации Hsp70 с EGFP не наблюдалось.
Мы заметили, что в культурах, трансфецированных длинной последовательностью (Q103), и в культуру которых препарат Hsp70/Hsc70 был добавлен, количество агрессом было меньшим, а клеток с диффузно распределенным EGFP - больше. Подсчет показал, что добавление Hsp70 на 25% понижало образование агресом (рис 37а). Это наблюдение было подтверждено биохимическими методами, и в качестве наиболее эффективного был выбранэ Filter Trap Assay и Western blotting. Экстракты клеток, трансфецированных Q103, после инкубации с Hsp70 или без нее, наносили на ацетатную нитроцеллюлозную мембрану, используя аппарат для дот-блоттинга, присоединенный к вакуумному насосу. Растворимые клеточные белки проходили через поры мембраны, а нерастворимые в SDS белковые агрегаты на ней задерживались. Чтобы их выявить, мембрану инкубировали с антителами против EGFP. Экстракты трансфецированных клеток дали положительный результат, в то время как белки экстрактов клеток, инкубированных с Hsp70, в основном проходили через мембранные поры (рис.376). Когда лизаты клеток SK-N-SH, трансфецированных Q25 или Q103, подвергали электрофорезу в системе с рыхлым концентрирующим гелем (концентрация акриламида составляла 3.6%), мы обнаружили, что через 72 ч после трансфекции нерастворимые полиО-агрегаты застревали в концентрирующем геле. Только в лизатах клеток, инкубированных с препаратами Hsp70/Hsc70, сохранялась фракция растворимого Q103.
Мы также измерили размеры агресом в клетках, трансфецированных плазмидой Q103. Если трансфецированные клетки были инкубированы с препаратом Hsp70 в течение 48 час, средний диаметр агрессом был меньше в два раза. Более того, при инкубации с Hsp70 примерно 60% клеток имели включения размером от 2,5 до 4 мкм, а крупных включений с диаметром более 7мкм не встречалось вообще. В тех клетках, которые с белком не инкубировались, более 30% имели агрессомы диаметром 4,5-5 мкм, 28% - 5,5-7 мкм и 13% включений были крупнее, чем 7 мкм (рис. 37в). Препараты контрольных белков, сывороточного альбумина, и инактиированного препарата Hsp70/Hsc70 на размеры агрегатов влияния не оказывали. Эти данные говорят в пользу того, что, хотя Hsp70 формирует динамические комплексы с нерастворимыми белковыми включениями (Kim et al.,2002), он скорее предотвращает их формирование, нежели разбирает уже готовые.
