Введение к работе
Актуальность проблемы. Система, осуществляющая передачу зрительного возбуждения, является уникальной по своей чувствительности. Она способна, как показано Зелигом Хечтом около 50 лет назад, стимулироваться дакв одним квантом света. Однако, кроме такого совершенства в детекции света, у этой системы есть еще и способность изменять свою чувствительность более чем в десять тысяч раз, адаптируясь'к различным уровням фоновой освещенности. Это, наряду с высокой воспроизводимостью при передачи информации, делает понятным важность исследований, направленных на понимание механизмов, лежащих в основе восприятия и трансдукции светового сигнала.
Большая часть этих процессов происходит в наружных сегментах палочек сетчатки - специальных клеточных компартмен-тах, отделенных от остальной части палочек (внутренних сегментов) перетяжкой. Хорошо понят к настоящему времени основной путь передачи зрительного сигнала у позвоночных. Квант света, попадая в молекулу родопсина, изомеризует ее хромофор - 11-цис-ретиналь, вследствие чего образуется активный интер-медиат - метародопсин II, который обладает способностью активировать следующий белок каскада - трансдуцин, относящийся к классу G-белков. Активация заключается в обмене ГДФ на ГТФ у а-субъединицы трансдуцина, которая после этого становится способной взаимодействовать с фосфодиэстеразой цГМФ, либо образуя с ней комплекс, либо приводя к удалению ингибиторной 7-субъеди-ницы от каталитических ар-субъединиц.
К настоящему времени в лаборатории химии белка ИБХ им.М.М. Шемякина АН СССР определены первичные структуры всех трех субъединиц бычьей фосфодиэстеразы ЦГМФ и встал вопрос о механизме их взаимодействия мевду собой и с а-субъединицей трансдуцина. Решение этого вопроса позволило бы объяснить особенности структуры фосфодиэстеразы, делающие ее уникальной среди ферментов этого класса и обеспечивающие столь важную функцию как быструю передачу зрительного сигнала со значительным коэффициентом усиления.
Одним из подходов к выполнению такой задачи является химическая кросс-сшивка субъединиц фосфодиэстеразы и анализ получаемых белковых комплексов с целью определения их субъединичного состава. Этот метод, наряду с методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза молекулы фосфодиэстеразы, позволяет локализовать участки первичной структуры ее субъединиц, ответ ственные за взаимодействие.
Цель работы. Настоящая работа является частью проводимого в Филиале ИБХ им.М.М.Шемякина АН ССОР структурно-функциональн го изучения белков, отвечающих за передачу зрительного возбуж дения.
Целью исследования являлась разработка метода химической кросс-сшивки субъединиц фосфодиэстеразы цГМФ в дисках нарузкны сегментов палочек сетчатки быка, определение состава полученн комплексов и идентификация участков ингибиторной у-субъединии важных для образования таких комплексов.
Научная новизна и практическая ценность работы. ФункционЕ льно активная ингибиторная 7-субъединица фосфодиэстеразы и се ее мутантних форм экспрессированы in vitro в системе экстракт зародышей пшеницы. Подобраны оптимальные условия их экспресс! Получены моноспецифические поликлональные кроличьи антитела к обеим каталитическим субъединицам фосфодиэстеразы, используя качестве антигенов синтетические пептиды, соответствующие уш кальным участкам каждой из субъединиц. Разработан метод химической кросс-сшивки фосфодиэстеразы бифункциональным реагенте - N-гидроксисукцинимидным эфиром 3-малеимидобензойной кислоть мембранах дисков наружных сегментов палочек сетчатки.
С помощью антител к каталитическим субьединицам и авторадиографии меченой ингибиторной 7~субъединицы и ее мутантних форм определен субъединичный состав кросс-сшитых комплексов. Показана возможность раздельного существования каталитически? субъединиц в мембранах дисков. Каждая из каталитических субъ« диниц оказалась способна к образованию гомодимеров ( и р2> лс связыванию с 7-субъединицей.
Методом олигонуклеотиднаправленного мутагенеза показано, что замена в структуре 7-субъединицы Arg 24 * Gly приводит к
практически полной потере способности этого мутанта связывать
ся с каталитическими субъединицами. Мутант Arg 33 *- Gly теряет
эту способность только частично. Сравнение способности мутан
тов связываться с каталитическими субъединицами фосфодиэстера-
зы с их ингибиторными свойствами позволило локализовать участ
ки в молекуле 7-субъединицы, ответственные как за ту, так и за
другую функцию. ;.- . .
Публикации. По теме диссертации опубликовано две статьи, результаты докладывались на Советско-Западноберлинском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Западный Берлин, 1989), на Всесоюзном симпозиуме по химии белка (Тбилиси, 1990) и на э Международном конгрессе по исследованию глаза (Хельсинки, 1990).
Объем работы. Диссертация содержит 107 стр.. машинопис-ного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (131 назв.). В обзоре литературы рассмотрены работы, посвященные механизмам регуляции фосфодиэс-теразной активности в наружных сегментах палочек сетчатки, значению такой регуляции для передачи светового сигнала.
