Введение к работе
Актуальность проблемы. Клетки палочек сетчатки являются чрезвычайно чуствительными детекторами. Проводимые полвека назад физиологические исследования показали, что клетка палочек может быть возбуждена единичным фотоном. Обладая столь уникальной способностью к детекции единичного фотона, палочки сетчатки способны более чем в десять тысяч раз изменять свою чуствитель-ность, адаптируясь к разным уровням фоновой освещенности- Биохимические и физиологические исследования последующих десятилетий привели к открытию того, каким образом достигается такая высокая чуствительность. Фотоактивация родопсина приводит к обмену связанного с а-субьединицей трансдуцина ГДФ на ГТФ. ГТФ-форма а-субьединицы (Та-ГТФ) трансдуцина активирует фосфоди-эстеразу цГМФ (ФДЭ), состоящую из трех субьедениц: а (98 кДА), р (98 кДА) и 7 (Ю кДА). Активность каталитических ар субьеди-ниц (ФДЕар) неконкурентно ингибируется 7 субьединицей (ФДЕ7). Ингибирующий эффект 7 субьединицы реципрокно снимается (Та-ГТФ).Вызываемое светом снижение уровня цГМФ закрывает кати-онные каналы, что приводит к гиперполяризации плазматической мембраны и генерации потенциала действия.
В настоящее время определены первичные структуры ФДЭ7 из сетчаток быка, мыши и человека. Сравнение этих структур показало высокую степень гомологии между ингибиторными субъединицами ФДЭ7 (Две аминокислотные замены). ФДЗ7 является небольшим (87 аминокислотных остатков) сильноосновным белком (pl=10,5), содержащим большое количество остатков аргинина и лизина в центральной части молекулы (24-45).
Получение рекомОинантных мутантних форм методом направленного мутагенеза и изучение их функциональной активности представляется наиболее перспективным способом для идентификации функционально важных аминокислот ФДЭ7-
Цель работы. Эта работа является частью проводимого в ИБХ им. М.М.Шемякина Российской АН комплексного структурно-функционального изучения белков, участвующих в процессе восприятия и преобразования зрительного сигнала. Целью исследования явилось изучение структурно-функциональных свойств рекомбинант-ных мутантных форм ФДЭ7» полученных методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза.
Научная новизна и практическая ценность работы. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза впервые были получены 14 рекомбинантных мутантних форм ФДЗ7. Была получена экспрессия этих мутантных форы последовательной in vitro транскрипцией и трансляцией. Были изучены ингибиторные свойства этих мутантов, и их взаимодействие с каталитическими субьедапшцами ФДЭ и а-субьединицей трансдуцина. На основании полученных экспериментальных данных сделан вывод, что в процессе взаимодействия ФДЭу с каталитическими субьединицами существует две стадии: первичное связывание и ингибирование. В первичном связывании принимает участие центральный участок 7-субьединицы богатый основными аминокислотными остатками, а в процессе ингибирования основная роль принадлежит С-концевому участку. Важное значение для процесса ингибирования имеет пространственная ориетация С-концево-го участка 7-субьединицы - так замена пролина в полонений 69 привела к значительному снижению ингибиторных свойств ФДЗ7. Кроме того, С-концевой участок оказывает влияние и на процесс связывания с каталитическими субьединицами ФДЭ. Можно предположить, что при активации ФДЭ а-субьединица трансдуцина непосредственно взаимодействует с каталитическими субьединицами ФДЭ.
Публикации. По теме диссертации опубликованы четыре статьи, полученные результаты докладывались на Симпозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Белковая и фармацевтическая, инженерия" (Парк-Сити, США, 1989), Советско-Западногерманском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Западный Берлин, 1989), Симпозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Передача сигнала G-белками" (Тамарок, США, 1990), Международном симпозиуме по исследованию глаза (Хельсинки, Финляндия, 1990), Советско-Германском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991), Российско-Израильском по пептидам и белкам (Москва, 1992).
Обьеы работы. Диссертация излокена на 98 страницах машинописного текста. Она состоит из введения, литературного обзора "Методы олигонуклеотид-направленного мутагенеза", 4 глав, посвященных результатам и их обсуждению, экспериментальной части и выводов. Список цитируемой литературы включает Иб наименований. В обзоре литературы рассмотрены работы, посвященные методам олигонуклеотид-направленного мутагенеза.
