Содержание к диссертации
СОДЕРЖАНИЕ 2
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Структурная организация SMC-белков. 8
Функции SMC-белков: 10
SMC2/SMC4: конденсация митотических хромосом. 10
SMCI/SMC3: когезня сестринских хроматид. 12
SMC-белки: репарация и рекомбинация ДНК. 15
SMC-белки: регуляция генной экспрессии..
Компенсация дозы гена. 15
Ядрышко: 17
Структурно-функциональная организация ядрышка. 17
Белки ядрышка. 19
Кольчатые тельца. 21
Структура и динамика ядрышек ооцитов морского ежа
Paracentrotus lividus в оогенезе. 22
Особенности организации ооцитов шпорцевой лягушки
Xenopus laevis. 25
Хромосомы типа «ламповых щеток». 26
SMC-белки в мейозе. 29
Задачи работы. 30
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 31
/. Объекты исследования 31
2. Выделение хромосом типа «ламповых щеток»
из ооцитов XJaevis. 31
-
Воздействие актиномицина Д. 33
-
Иммуіюцитохимическая окраска препаратов хромосом типа «ламповых щеток» X. laevis. 34
-
Получение фракции изолированных ооцитов морского ежа. 34
-
Получение фракций 2-4 бластомеров и поздней гаструлы PAividus. 35
-
Диссоциация клеток гаструлы P. lividus. 35
-
Получение хромосомных препаратов из бластомеров. 36
-
Гибридизация in situ. 36
10. Электрофорез белков и иммуноблотинг. 37
11. Иммуноцитохнмический анализ локализации кондепсинов в клетках
морского еоюа. 39
12. Иммуноэлектро}1пая микроскопия ооцитов и клеток
гаструлы морского еоюа с применением метода серебряного
усиления сигнала от ианочастиц золота. 39
13. Выявления ядрышкового организатора
по методу окрашивания AgN02. 41
14. Развитие морского ежа P.lividus в присутствие
глутарового альдегида. 42
15. Выделение тотальной РНК и полимеразная г^епная реакция
с обратной транскрипцией. 43
РЕЗУЛЬТАТЫ. 44
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 88
ВЫВОДЫ. 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 99
БЛАГОДАРНОСТИ. 114
Введение к работе
Хромосомы эукариотических организмов состоят из молекул ДНК, которые находятся в сложных межмолекулярных взаимодействиях с многочисленными белками. В процессе исследования этих взаимодействий был открыт новый класс негистоновых белков, получивших название SMC-белки (Structural Maintenance of Chromosomes) (Stnmnikov et al., 1993; Hirano and Mitchison, 1994). Показано, что SMC-белки существуют в виде гетеродимеров различного состава - SMC2/SMC4 и SMC1/SMC3. В клетках дрожжей, амфибий и млекопитающих гетеродимер SMC2/SMC4 участвует в митотической конденсации хромосом (Hirano and Mitchison, 1994; Saka et al., 1994), а гетеродимер SMC1/SMC3 - в когезии сестринских хроматид и в репарации ДНК (Jessberger et al., 1998).
Впервые SMC-белки были выделены в составе белкового комплекса из экстракта яиц шпорцевой лягушки Xenopus laevis, который назвали конденсиновым комплексом. I3S-кондепешювый комплекс состоит из двух субкомплексов: 8S (коровый) и 11S (регуляторный). SS-комплекс представлен двумя SMC-субъединицами (SMC2YXCAP-E и SMC4\XCAP-C), которые образуют димер. llS-комплекс представлен тремя белками, не относящимися к классу SMC-белков (XCAP-D2\Eg7, ХСАР-Н и XCAP-G) (Stnmnikov et al., 1995; Hirano et al., 1997; Kimura et al., 1997; Losada et al., 1998). ІЗБ-конденсиновьій комплекс локализуется в осевых районах сестринских хроматид митотических хромосом, и, по-видимому, принимает участие в поддержании их компактной структуры (Hirano and Mitchison, 1994).
В то же время, представления о функциональной роли конденсинов противоречивы.
Их участие в конденсации хромосом в митозе было показано в системе in vitro с использованием экстракта яиц Xenopus laevis и в делящихся клетках дрожжей (Hirano and Mitchison, 1994; Saka et al., 1994; Strunnikov et al., 1995; Lavoie et al., 2000; 2002). Однако в некоторых организмах инактивация конденсинов не приводит к видимым нарушениям в структуре хромосом, что свидетельствует о возможном существовании альтернативных путей компактизации ДНК в митозе (Steffensen et al., 2001; Hangstrom et al., 2002; Hirota et al.,
2004).
Также существует ряд работ, которые указывают на возможную ключевую роль конденсинов в процессах конденсации хромосом в мейозе у дрожжей S. cerevisiae (Yu et al., 2003) и у X.laevis (Beenders et al., 2003). Таким образом, не смотря на имеющиеся данные, вопрос об участии конденсинового комплекса в компактизации как митотических, так и мейотических хромосом остается открытым.
Ситуация осложняется тем, что функции SMC-белков не исчерпываются их участием (косвенным или прямым) в конденсации хромосом и когезии сестринских хроматид. Недавно было показано, что субъединицы конденсинового комплекса полифункциональны. В частности, они могут играть роль в регуляции транскрипции, контролируя структурное состояние хроматина: комплекс, содержащий SMC-белки, специфически связывается с X-хромосомами нематоды C.elegans, что приводит к снижению уровня экспрессии генов (Chuang et al., 1994). Кроме этого, представители конденсинового комплекса обнаружены в составе ядрышек интерфазных клеток (Cabello et al., 2001; Тимирбулатова и др., 2002; Beenders et al., 2003). В настоящее время существуют две основные гипотезы, объясняющие присутствие конденсинового комплекса в ядрышках интерфазных клеток. По одной из гипотез конденсины участвуют в структурных модификациях хроматина, связанных с активацией генов, кодирующих рибосомпую РНК (рРНК) (Cabello et al., 2001). Эта гипотеза согласуется с данными, полученными методом иммунопреципитации, по которым в клетках S.cerevisiae конденсины ассоциированы с рибосомальной ДНК (рДНК) (Freeman et al., 2000). Альтернативная гипотеза предполагает, что белок конденсинового комплекса, ХСАР-Е, рекрутируется в виде комплекса на частицах, содержащих малые ядерные РНК (мя РНК) в гранулярном компоненте ядрышка, для участия в одном из этапов процессинга рРНК (Тимирбулатова и др., 2002; Uzbekov et al., 2003). К сожалению, нет однозначного ответа на вопрос с какими биологическими молекулами (ДНК, РНК или белки) связан конденсиновый комплекс или отдельные субъедииицы конденсинового комплекса в ядрышке интерфазных клеток.
Подводя итог краткому изложению данных о роли конденсинов, можно заключить, что на сегодняшний день их функции, как в процессе конденсации митотических и мейотических хромосом, так и в интерфазных ядрах, остаются не выясненными.
В связи с вышесказанным, основной целью настоящей работы явилось исследование структурно-функциональной роли копденсинового комплекса в ядрышках и в мейотических хромосомах.
