Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6
Детерминанты вегетативного полушария Xenopus laevis: локализация и функции 7
Перемещение детерминант на вегетативный кортекс ооцита 9
Половая плазма и митохондриальное облако 9
Детерминанты осевого комплекса 9
Вегетативно локализованные мРНК 10
Связь детерминант с кортексом ооцита после созревания 13
Кортикальный поворот 13
Волны поверхностного сокращения 14
Формирование первичных половых клеток 15
Индукция de novo 17
Половая плазма и закладка ППК 18
Насекомые 19
Бесхвостые амфибии 21
Рыбы и птицы 22
Гены, задействованные в формировании половых клеток 23
Drosophila 24
С. elegans 26
Xenopus laevis 27
Птицы и млекопитающие 30
Миграция первичных половых клеток 32
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35
Получение зародышевого материала 35
Клонирование гена Germes 35
Быстрая амплификация 5 '-конца кДНК (5 '-RACE) 35
Получение полноразмерной кДНК 36
Секвенирование, анализ последовательностей кДНК и белков 36
Нозерн-блот анализ 37
Гибридизация in situ 37
Подготовка матрицы 37
Синтез зонда 38
Гибридизация 38
Микроинъекции мРНК Germes, его мутантных форм или его партнеров в эмбрионы и ооциты шпорцевой лягушки 40
Гистологический анализ 41
Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК 41
Электрофорез в агарозном геле 41
Рестрикция 41
Зачистка концов фрагментом Кленова 42
Дефосфорилирование 42
Лигирование 42
Трансформация компетентных клеток 43
Получение мутантных форм Germes 43
Создание генетических конструктов в экспрессионных плазмидных векторах 44
Дрожжевая двугибридная система 47
Описание системы 47
Среды и растворы 49
Трансформация дрожжей 50
Трансформация библиотеки 51
Выделение плазмид из дрожжей 51
Колокализация белков в клетках млекопитающих 52
Культивирование клеток млекопитающих 52
Иммуноокрашивание клеток на покровных стеклах 53
Коиммунопреципитация 53
Иммуноблоттинг 54
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 55
Клонирование нового rena Xenopus laevis 55
Анализ временной и пространственной экспрессии гена 57
Анализ влияния оверэкспрессии Germes дикого типа и его мутантных форм на формирование и миграцию ППК 60
Получение мутантных форм Germes 60
Анализ влияния оверэкспрессии различных форм Germes на развитие ППК 62
Гистологический анализ зародышей, инъецированных мРНК GermesALZ 70
Germes - часть белкового комплекса, образование которого необходимо для нормального развития ППК 11
Поиск белковых партнеров Germes 78
Поиск партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы 78
Подтверждение взаимодействий 81
Анализ взаимодействия Germes с легкими цепями динеина с помощью ДДС 84
Возможная роль Germes в развитии ППК 86
ВЫВОДЫ 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 89
