Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3
ВВЕДЕНИЕ 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 5
Биологическая роль локализованных РНК 5
Локализующиеся РНК как детерминанты развития 6
Drosophila 6
Xenopus 7
Асцидии 9
Daniorerio 10
Роль локализующихся РНК в специализации клеток половой линии 14
Формирование зародышевой плазмы у Drosophila 15
Формирование зародышевой плазмы у Xenopus 16
Зародышевая плазма у других организмов 18
Механизмы локализации РНК в клетке 20
Свободная диффузия и локальное заякоривание 20
Локализация РНК с помощью деградации 21
Активный транспорт 22
Drosophila 23
Xenopus 24
Активный транспорт в соматических клетках 27
Регуляция транспорта и локализации РНК 27
Цис-действующие последовательности 28
Транс-действующие факторы 29
Staufen 31
Prrp 32
hnRNP 33
Регуляция трансляции локализующихся мРНК 34
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 35
Получение зародышевого материала лягушки 35
Анализ пространственной и временной экспрессии транскриптов,
соответствующих кДНК фрагментам, с помощью метода обратной транскрипции РНК
ПЦР амплификации (RT-PCR) 35
Клонирование полноразмерной кДНК Germes 37
Получение З'- области кДНК Germes с помощью 3 '-RACE 38
Получение 5'- области кДНК Germes с помощью 5 '-RACE 38
Клонирование полноразмерной кДНК Germes с помощью RT-PCR 39
Приготовление ДНК конструктов для синтеза РНК 39
Микроинъекции 41
Получение ооцитов для микроинъекций 41
Синтез флуоресцентной РНК 42
Получение конфокального изобраэюения живых ооцитов инъецированных
флуоресцентной РНК 43
Метод сшивки с помощью ультрафиолета 43
Получение белкового экстракта из ооцитов 43
Синтез радиоактивно меченой РНК 43
Связывание белковых факторов с РНК 44
Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК 45
Электрофорез в агарозном геле 45
Рестрикция 45
Зачистка концов фрагментом Кленова 46
Дефосфорилирование 46
Лигирование 46
Трансформация компетентных клеток 47
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ 48
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ 48
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49
Идентификация и клонирование кДНК нового гена, транскрипт которого
локализован на вегетативном полюсе ооцитов и ранних
эмбрионов Xenopus laevis 49
Исследование механизма локализации мРНК Germes на вегетативный полюс
ооцита 52
Поиск цис-действующих последовательностей мРНК Germes 54
Исследование белковых факторов, взаимодействующих
с З'НТО мРНК Germes 61
ВЫВОДЫ 68
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 69
Введение к работе
Асимметричное распределение цитоплазматических молекул РНК в клетке является одним из механизмов пространственной регуляции генной экспрессии. Это явление обнаружено во многих типах клеток различных живых систем от бактерий и дрожжей до растений и животных. Неравномерно распределенные РНК локализуются в специфических областях клетки, где принимают участие в различных биологических процессах, таких как локальная регуляция трансляции и сборка новых функциональных белковых комплексов, подвижность клетки и поддержание ее морфологии, полярность, асимметричное деление, синаптическая пластичность. Особенное значение этому явлению придается в биологии развития. Локализованные в ооцитах и эмбрионах РНК, часто функционируют как детерминанты развития, играя важную роль при формировании полярности и осей развития зародыша, детерминации и дифференцировки различных типов клеток и тканей.
Одной из главных задач локализующихся РНК является обеспечение белковой экспрессии транскрипта в специфической области клетки. Тот же результат может быть достигнут за счет локализации непосредственно самого белкового продукта РНК, однако именно процесс локализации РНК является наиболее распространенным, экономичным и эффективным способом доставки белкового продукта транскрипта в специфическую область клетки.
Для осуществления своих функции локализующиеся РНК должны быть своевременно и правильно доставлены в специфическую область клетки. С этой целью в клетках действуют различные механизмы локализации цитоплазматических РНК, описывающихся тремя основными моделями: (1) свободная диффузия РНК и ее "захват" в специфической области клетки; (2) свободная диффузия РНК и ее локальная защита от деградации; (3) активный транспорт РНК вдоль компонентов цитоскелетной сети. В основе механизмов локализации РНК лежит взаимодействие между цис-действующими последовательностями РНК, являющимися ее сигналами локализации, и трансдействующими белковыми факторами, составляющими молекулярную основу локализационной машины. Однако то, какие принципы заложены в основе организации сигналов локализации РНК, какие белковые факторы их узнают, и каким образом обеспечивается специфичность этого взаимодействия, остается во многом неизвестным. Исследование вопроса, при участии каких дополнительных факторов/моторов происходит транспорт РНК, и что его регулирует, является необходимым для полного понимания функционирования механизмов локализации РНК. Несмотря на продолжающиеся
исследования, идентификация новых локализующихся РНК и транс-действующих белковых факторов остается актуальной задачей.
В настоящей работе исследуется механизм локализации мРНК нового гена Germes в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis и цис- и транс- действующие факторы, принимающие участие в регуляции транспорта транскрипта.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
