Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. 7
1.1 Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.) 7
1.2. ДНК- маркеры растений 12
1.3. Полипептидный состав запасных белков зернобо- 16 бовых культур
1.4. Роль лектинов в метаболизме 20
1.5. Белки ингибиторы ферментов 29
1.6. Роль белковых компонентов в биотехнологии 33
2. Объект и методы исследования 38
2.1. Сортообразцы фасоли 38
2.2. Условия выращивания 39
2.3. Биохимические методы исследования 41
Результаты исследований 45
3. Скрининг образцов фасоли на содержание сырого протеина, антипитательных и токсичных веществ 45
3.1. Содержание сырого протеина в семенах фасоли 45
3.2. Биоскриниг семян фасоли на гемагглютинирующую 48 активность лектинов.
3.3. Биоскрининг семян фасоли на активность ингибито- 54 ров протеиназ и а- амилаз
3.4. Содержание цианогенных гликозидов (по синильной 59 кислоте) в семенах фасоли.
3.5. Методика выделения, очистки и изучения состава лектинов и ингибиторов гидролаз из семян фасоли 62
4. Характеристика суммарных белков фасоли 67
4.1. Формирование суммарного комплекса запасных бел- 68 ков семян фасоли в период созревания
4.2. Полипептидный состав суммарных запасных белков 73
4.3 семян фасоли и электрофоретические паспорта по белковым формулам
5. ДНК - маркеры 75
6. Испытания белковых компонентов из семян фасоли на биологическую активность 77
6.1. Гемагглютинирующая активность лектинов семян фасоли по отношению к четырем группам крови 78
6.2. Влияние лектинов и ингибиторов протеиназ на антиоксидазную активность гороха 80
6.3.Действие лектинов из семян фасоли на устойчивость гороха к биоте 84
бАДействие ингибиторов гидролаз из семян фасоли на жизненную активность взрослых особей Bruchus pisorum L. 92
Выводы 97
Предложения производству 99
Экономическая эффективность 100
Список литературных источников 101
Приложение 120
- Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.)
- Биохимические методы исследования
- Содержание сырого протеина в семенах фасоли
Введение к работе
Одной из приоритетных задач биотехнологии является обеспечение сельскохозяйственного производства дешевыми, экологически чистыми и эффективными препаратами для обработки посевного материала, гарантирующие формирование высоких и стабильных урожаев. С целью выявления дополнительного источника биологически активных веществ многие ученые мира занимаются биоскринингом растений. Фасоль является одним из таких объектов. По химическому составу семена фасоли уникальны и включены в группу важных продуктов, обеспечивающих население полноценным белком. Однако белковый комплекс фасоли содержит ряд токсичных и антиалиментарных факторов питания, блокирующих активность пищеварительных ферментов, которые, возможно, принимают участие в защитных механизмах растения. Наличие антипитательных веществ (ингибиторов гидролаз, лекти-нов и цианогенных гликозидов) с высокой активностью в семенах фасоли делает ее перспективной с точки зрения биотехнологической переработки и получения фитопрепаратов.
При увеличении удельного веса биопрепаратов по защите растений в сельскохозяйственном производстве до 35%, потери урожая от вредителей, болезней и сорняков - сократились бы до 15-20%. Грамотное комплексное применение таких препаратов позволит увеличить урожай на 10-36%, сэкономить до 60 г минерального азота на 1га и получить в условиях экологически чистого земледелия дополнительно около 4 млн. т биопродукции (Курдюков, 1982).
Диапазон применения белковых компонентов растений достаточно широк. В проспектах ведущих химических и биотехнологических фирм мира, специализирующихся в сфере выпуска биопрепаратов, можно найти большой перечень лектинов, меченых лектинов, ингибиторов и их производных, необходимых для производства лекарственных средств, диапюстикумов. Известно, что лектины используются в лабораторном деле для диагностики тех или иных наследственных заболеваний, идентификации некоторых микроорганизмов. Это уже само по себе делает высоким спрос на лектины. Кроме этого лектины в биотехнологии используются в качестве специфических реагентов, избирательно сорбирующих те или иные сложные вещества: гликопротеиды, гормоны, сиалопротеиды и т.д. Таким образом, при помощи препаратов лек-тинов можно получить ценные вещества, используемые при лечении многих тяжелых заболеваний. Перспективно создание нового поколения препаратов - своеобразных гибридов лектинов и антител для воздействия на органы и ткани. Лектины фасоли оказывают радиотерапевтическое действие, стимулируют пролиферацию лимфоидных клеток, обладают иммуностимулирующими свойствами. Ингибиторы также применяются в медицине и фармакологии. Генная инженерия широко применяет растительные ингибиторы про-теиназ для получения устойчивых к насекомым трансгенных растений (Мосолов, Валуева, 2000). Поэтому в настоящее время имеется большая потребность в новых источниках получения лектинов и ингибиторов и дальнейшей биотехнологической переработки.
Для разработки технологий получения в промышленных масштабах лектинов и ингибиторов фасоли необходимо не только выявить перспективные сорта и формы, но и установить фазу развития, их локализацию в органах растения, изучить химический состав сопутствующих веществ, рассчитать выход и дать конкретные рекомендации по методикам выделения. Решение этих проблем позволит дополнить знания в области биохимии фасоли, и будет способствовать дальнейшему повышению рентабельности сельскохозяйственного производства.
Цель исследований: охарактеризовать белковый комплекс семян фасоли и испытать его антипитательные компоненты: ингибиторы гидролаз и лектины на биологическую активность.
Задачи:
1. Провести биоскрининг сортов и форм фасоли на содержание бел ка, антипитательных и токсичных веществ и выявить наиболее перспективные для промышленного получения лектинов и ингибиторов гидролаз.
2. Изучить динамику накопления токсичных веществ: лектинов, ингибиторов гидролаз и цианидов по фазам развития семян у различных сортов и форм фасоли.
3. Выявить полиморфизм образцов фасоли по белковым и ДНК-маркерам.
4. Выделить и очистить ингибиторы гидролаз и лектины из семян фасоли.
5. Установить полипептидный состав ингибиторов гидролаз, лектинов и углеводную составляющую лектинов.
6. Провести испытание белковых компонентов фасоли на биологическую активность.
7. Сформулировать рекомендации по рациональному использованию лектинов и ингибиторов гидролаз фасоли.
Научная новизна_работы. Впервые проведен биоскрининг районированных сортов и форм фасоли на содержание и активность антипитательных и токсичных веществ: лектинов, ингибиторов гидролаз и цианидов, осуществлена регистрация местных сортов и форм фасоли по белковым и ДНК - маркерам. Выделены лектины и ингибиторы протеиназ и амилаз из семян фасоли, установлен полипептидный и углеводный состав, испытана их биологическая активность.
Практическая значимость работы. Выявлены сорта и формы фасоли с высокой активностью лектинов и ингибиторов с целью использования их в качестве сырья для промышленного получения препаратов различного назначения, в том числе и диагностикумов для определения групп крови человека. Предложены модифицированные и адаптированные к изучаемой культуре биотехнологические схемы выделения лектинов и ингибиторов. Установлено положительное влияние компонентов фасоли на урожайность и устойчивость к патогенам и фитофагам гороха Pisum saatium, что является перспективным направлением в создании биопестицидов.
Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.)
Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.) изменяется в зависимости от сорта и условий возделывания. В среднем он характеризуется следующими показателями: белка 20...30 %, у некоторых сортов фасоли до 40 %, жира 1,8...2,0 %, около 60 % углеводов (табл. 1). Углеводы бобовых (главным образом крахмал) хорошо всасываются и используются организмом. (Метлицкий, 1979 , Самарина, 1976, Кольман, Рем ., 2000). Фасоль является достаточно хорошим источником тиамина 3,1...5,0 мкг/г, никотиновой кислоты, кальция и железа (Самарина, 1976, Korytnyk et al.,1963).В семенах бобовых в среднем в 2-3 раза больше белков, чем в семенах злаков. В соломе и сене бобовых культур содержание белков также в несколько раз больше белков, чем в зерне злаков. Крахмала в семенах бобовых меньше, чем в злаках, Сахаров несколько больше, а количество других веществ не отличается от их содержания в семенах зерновых культур (Самарина, 1976, Жеруков и др., 2003, Devi, Kurup, 1972).
Анализ химического состава семян Phaseolus calcaratus показал, что небелковый азот составляет от 12 до 19,6 % от общего содержания азота (Chaterjee, Abrol, 1975). Исследованиями распределения различных фосфорных соединений в семенах фасоли установлено, что они характеризуются самым низким содержанием фосфора фитиновой фракции из всех исследованных видов бобовых (Erihsson, Abrol, 1975).
Белки бобовых состоят в основном из глобулинов и альбуминов. Так, у Phaseolus calcaratus на долю глобулинов приходится 80...90 % общего азота, тогда как альбумины, проламины и глютенины составляют соответственно 10...20 %. (Chatterjee , Pohhriyal, 1978). Белки семян бобовых культур почти полностью растворяются в воде и 10 % растворе хлористого натрия, на долю белков, растворимых в 0,2 % растворе гидроксида натрия в разных образцах семян фасоли приходится лишь 1 13 % общего содержания белков. Прола мины в семенах бобовых культур, как правило, отсутствуют. Более легкая растворимость белков бобовых культур в воде и растворах нейтральных со лей означает и более легкую их перевариваемость для человека и животных (Alekseeva, Kovarskay, 1979).
Установлена интересная закономерность между составом белков бобовых культур и филогенетическим возрастом вида. Показано, что физиологически более древние формы больше содержат хорошо растворимых белков — глобулинов, характеризующихся физиологически более активными молекулами, чем эволюционно более молодые формы (Элиот, Элиот, 1999). Из семян бобовых культур выделено большое число отдельных глобулинов, отличающихся по ряду свойств. Так, например, из фасоли выделили фазеолин. Глобулины имеют различный элементарный и аминокислотный состав, различаются по молекулярному весу, изоэлектрическим точкам и т. д (Ballester , et.al., 1980).
Известно, что бобовые, и в частности фасоль, содержат много белка, однако их питательная ценность определяется не только количеством белка, но и его качеством, которое, как известно, зависит от сбалансированности аминокислотного состава, содержания незаменимых аминокислот, перевари-ваемости белка и характера влияния на утилизацию белка факторов среды (Конарев , 1981). Аминокислотный состав белка бобовых исследован достаточно хорошо. Установлено, что белки бобовых лимитированы наличием серосодержащих аминокислот и триптофана, но имеют много лизина, которого сравнительно мало в зерновых культурах (табл.2). Общее содержание сво бодных аминокислот в семенах фасоли варьирует от 0,15 до 0,36 г (Фицев и др., 2003).
Биохимические методы исследования
Метод основан на минерализации навесок при нагревании с концен трированной серной кислотой в присутствии катализаторов (Ермаков, 1987).
Химическая реакция аммиака с борной кислотой идет с образованием метаборной кислоты из ортоборной кислоты. Сама серная кислота очень слаба и не оказывает влияния на концентрацию ионов водорода.
Устанавливают количество свободной серной кислоты, не связанной с аммиаком, после чего по разности серной кислоты, налитой в приемную колбу, и количеству свободной кислоты определяют, сколько кислоты связалось с аммиаком. Результат умножают на коэффициент 0,0014, так как известно, d\ что 1 мл децинормального раствора серной кислоты связывает 0,0014 г азота. В итоге получают количество азота в навеске (в граммах). Для вычисления содержания в анализируемом веществе сырого протеина показатель содержания азота умножают на 6,25. Определение гем агглютинирую ще и активности Гемагглютинирующую активность в семенах фасоли определяли по методу Э.И. Выскребенцевой (1983) титрованием на планшетах с U -образными лунками. Эритроциты получали путем 5-кратной промывкой крови 0.2 М растворм хлористого натрия.
За величину лектиновой активности принимали минимальную концентрацию белка, при которой происходит реакция гемаггл юти нации. Концентрацию белка определяли по методу Лоури фотоэлектрокол ори метрически. Определение активности ингибиторов а - амилаз (Ермаков, 1983г.). О степени ингибирования а - амилаз (активности ингибиторов) судят по процессу подавления их активности, т.е. разности количества расщепленного крахмала без и с внесением в реакционную смесь ингибитора фермента. Определение активности ингибиторов трипсина и химотрипсина Активность ингибиторов протеиназ определяли казеинолитическим методом М.Л. Какейда в модификации И.И. Бенкен (1982)
Метод основан на спектрофотометрическом измерении при 280 нм. величины оптической плотности продуктов распада белкового субстрата (казеина) под действием фермента (трипсина, химотрипсина). Добавление ингибиторов, которые связывают трипсин или химотрипсин в неактивные комплексы, сопровождается уменьшением экстинции. Ингибирующую активность вычисляли по формуле и выражали в мкг заторможенных трипсиновых (химотрипсиновых) единицах на 1 г муки.
Меркуролістрический метод определения цианогенных глнжозидов и синильной кислоты Меркурометрический метод определения синильной кислоты в растительном материале основан на удалении синильной кислоты при перегонке титрованным раствором азотнокислой ртути (Ермаков, 1987). Образующееся цианистое соединение ртути Hg (CN) % представляет собой единственное цианистое соединение тяжелых металлов, растворимое в воде.
Количество синильной кислоты (мг/100 г) вычисляют по формуле: х= 100-0,2703 а/н, где а — количество 0,01 н. раствора азотнокислой ртути, связанного синильной кислотой дистиллята, см ; и — навеска материала, г; 0,2703 — титр раствора Hg (N03)2, мг HCN; 100 — коэффициент пересчета на 100 г. Определение активности каталазы Метод определения активности каталазы в модификации А.И. Ермакова (1987) основан на измерении объема выделевшегося кислорода после прибавления к водному экстракту каталазы перекиси водорода. Определение активности пероксидазы Спектрофотомктрический метод определения активности пероксидазы (Ермаков, 1987) основан на измерении оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении гваякола за определенный промежуток времени.
Содержание сырого протеина в семенах фасоли
Фасоль отличается высоким содержанием хорошо перевариваемого, полноценного по аминокислотному составу растительного белка. Однако белковый комплекс фасоли в сыром виде содержит антипитательные или так называемые антиалиментарные вещества или токсины: лектины, ингибиторы протеиназ и амилаз.
Характерной особенностью всех бобовых, в том числе и фасоли, является их способность фиксировать азот воздуха при помощи клубеньковых бактерий. Благодаря этому зерно бобовых культур содержит наибольшее количество белка, по сравнению с зерновыми. Зернобобовые культуры фиксируют до 100 кг азота на гектар, из которых значительная часть остается в почве, что является важным условием повышения плодородия почв. Важнейшую роль в накоплении азота играет инокуляция бобовых растений соответствующими расами клубеньковых бактерий. При изучении динамики изменения количества азота в вегетационных органах растений было показано, что в первый период роста и развития в бобовых растениях сравнительно мало азота, но затем при усилении интенсивности фиксации N2 бактериями азота в растениях значительно повышается и достигает максимума в период бутонизации и цветения. На этих фазах развития растений клубеньковые бактерии обычно наиболее интенсивно фиксируют атмосферный азот. После цветения количество азота в вегетативных органах уменьшается. Исследования показали, что при созревании идет интенсивный синтез белков из поступающих в семена аминокислот и амидов. Наибольшее содержание белка наблюдается в стадии полной спелости. Именно поэтому содержание протеина определяли в стадии полной спелости.
Для определения содержания сырого протеина изначально было взято 24 образца фасоли из коллекции ВИРа, в 2001 году - 14 сортов и форм фасоли, в2002-24,ав2003-15.
Исследования показали, что содержание белка у фасоли по годам выращивания колебалось в довольно широких пределах, в среднем оно составляло 26%), с варьированием по образцам и годам изучения от 19,9до 29,3% (табл. 9).
В благоприятные по погодным условиям 2001 и 2003 г. г. содержание белка в семенах фасоли в среднем составило 27 %. В засушливых условиях 2002 г. этот показатель составил в среднем 23 %. В 2002 г. в связи с засухой по всем образцам наблюдалось значительное снижение накопления протеина. Такие резкие колебания в накоплении протеина связаны не только с условиями выращивания, но и генотипом растений
