Введение к работе
Актуальность работы. Базидиомицеты являются перспективными микробиологическими объектами, которые привлекают внимание исследователей как источники профилактических и лечебных средств, оказывающих общеукрепляющее, тонизирующее и иммуностимулирующее действие на организм человека. Биологическая активность базидиомицетов определяется наличием в них ряда компонентов, важнейшими из которых являются гликаны (полисахариды) (Bao X.F., 2002; Wasser S.P., 2005). Одно из главных достоинств грибных гликанов заключается в отсутствии токсичности, при этом они способны оказывать стимулирующее действие на различные звенья иммунитета и корректировать патологические состояния, связанные с нарушением функций иммунной системы, приводя их к норме. (Akramiene D., 2007; Israilides C., 2008; Goodridge H., 2009). Помимо этого, гликаны некоторых базидиомицетов обладают противоопухолевой активностью (Lin Z., 2004; Chen J., 2007; Shimizu K., 2009). В настоящее время препараты на их основе не используют в онкологической практике в качестве единственных средств для лечения раковых заболеваний из-за недостаточной эффективности, но активно ведутся исследования по их применению в комплексной терапии раковых больных и в качестве средства поддерживающей терапии (Wasser S.P., 1999; Горовой Л.Ф., 2006). Существенным достоинством грибных гликанов, помимо действия на опухоли, является способность значительно снижать побочные эффекты химио- и радиотерапии (Gao Y. et al., 2002; Wang D.H., Weng X.C., 2006). Ранее, объектом исследования служили в основном плодовые тела грибов, часто дикорастущие, хотя, очевидно, что более перспективным является получение мицелия при глубинном культивировании грибов, когда удается осуществлять направленный синтез целевого продукта, стандартизовать условия его получения и показатели качества, сократить длительность процесса. В глубинной культуре грибы на протяжении всего жизненного цикла образуют микроскопические структуры, то есть являются микромицетами. Состав глубинного мицелия по всем важнейшим показателям, в том числе и по содержанию структурно-функциональных полисахаридов, качественно превосходит состав плодовых тел грибов (Бабицкая В.Г., 2005). В связи с возросшим интересом к базидиомицетам перспективно всестороннее исследование новых представителей данного класса, особенно в условиях погруженного культивирования, с целью получения на основе их мицелия профилактических и лечебных средств для поддержания иммунной системы в норме и при патологических состояниях.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей роста базидиомицетов Ganoderma applanatum, Fomes fomentarius и Flammulina velutipes в условиях глубинного культивирования; исследовании полисахаридных компонентов мицелия и экзополисахаридов, оценке их биологической активности.
В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие конкретные задачи:
1) изучить особенности роста базидиальных грибов в глубинных условиях и подобрать условия культивирования для накопления максимального количества биомассы мицелия грибов;
2) выделить полисахаридные компоненты мицелия и экзогликаны, исследовать их состав и физико-химические свойства;
3) оценить иммунобиологические свойства мицелия грибов, эндо- и экзополисахаридов по их влиянию на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей, отражающие стадии фагоцитоза;
4) исследовать в системе in vivo (на экспериментальных моделях опухолевого роста) противоопухолевую активность углеводных компонентов мицелия.
Научная новизна исследования. В работе впервые изучены особенности роста базидиальных грибов Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. штамм 9, Flammulina velutipes (Curtis: Fr.) P. Karst. штамм 20 и Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr. штамм 6 в условиях погруженного (глубинного) культивирования. Путем водной экстракции из мицелия выделены растворимые и нерастворимые полисахаридные фракции. Установлено, что нерастворимые фракции представляют собой хитин-глюкановые комплексы, а водорастворимые – смесь гетерополисахаридов, состоящих из глюкозных, маннозных и галактозных остатков. G. applanatum в глубинных условиях синтезирует внеклеточный гетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с растворимой полисахаридной фракцией мицелия.
Показано, что полисахаридные компоненты мицелия исследуемых грибов оказывают активирующее действие на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в частности перитонеальные макрофаги мышей, что проявляется в усилении хемотаксиса, адгезии, увеличении поглотительной способности и микробоцидности макрофагов. Растворимые фракции более активны по сравнению с нерастворимыми. Мицелий грибов при пероральном введении проявляет менее выраженное действие на функциональную активность макрофагов, чем углеводные фракции. Установлено, что растворимая углеводная фракция мицелия G. applanatum, наряду с высоким стимулирующим действием на макрофаги, обладает значительным и продолжительным противоопухолевым эффектом в отношении асцитной опухоли Эрлиха.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований выбрана культура G. applanatum штамм 9 для использования в качестве продуцента биологически активных углеводных полимеров, так как она обеспечивала достаточно высокий прирост биомассы, и компоненты мицелия обладали выраженной биологической активностью. Экспериментально подобраны состав питательной среды и условия культивирования для наибольшего накопления биомассы (выход вырос на 30% по сравнению с исходными условиями), при этом сроки ферментации сократили с 14 до 8 суток. Установлено, что растворимая полисахаридная фракция мицелия G. applanatum обладает выраженной противоопухолевой активностью, что, в сочетании с безвредностью, служит основанием для разработки на её основе средств, перспективных в комплексной терапии онкологических заболеваний. Разработан лабораторный регламент на получение биологически активной субстанции «Ганодермин».
Результаты работы внедрены в курсы лекций и лабораторные занятия по дисциплинам «Основы конструирования новых штаммов микроорганизмов» для студентов 3 курса и «Микробиология продуцентов БАВ» для студентов 4 курса факультета промышленной технологии лекарств СПХФА. Рабочие программы курсов утверждены 16.06.2009 г методической комиссией факультета промышленной технологии лекарств СПХФА.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Подбор условий культивирования базидиальных грибов G. applanatum, F. fomentarius и F. velutipes и изучение особенностей их роста в глубинных условиях привели к повышению выхода биомассы мицелия и сокращению сроков культивирования.
-
Растворимые углеводные фракции мицелия грибов, представляют собой смесь гетерополисахаридов, состоящих преимущественно из глюкозных, маннозных и галактозных остатков, нерастворимые – хитин-глюкановые комплексы. Основным углеводным компонентом фракций является глюкоза.
-
G. applanatum в условиях глубинного культивирования синтезирует экзогетерогликан, сходный по составу и физико-химическим характеристикам с растворимой полисахаридной фракцией мицелия.
-
Полисахаридные компоненты мицелия грибов G. applanatum, F. fomentarius, F. velutipes и экзополисахарид G. applanatum оказывают стимулирующее действие на клетки системы мононуклеарных фагоцитов, в частности на перитонеальные макрофаги мышей, что проявляется в увеличении показателей их функциональной активности, отражающих стадии фагоцитоза. Наиболее активны растворимые углеводные фракции мицелия.
-
Растворимый эндополисахарид G. applanatum обладает выраженной длительной противоопухолевой активностью в отношении асцитной опухоли Эрлиха; нерастворимые фракции G. applanatum и F. fomentarius обладают умеренной противоопухолевой активностью.
Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, обобщении и анализе полученных результатов.
Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседаниях кафедры микробиологии ГОУ ВПО СПХФА, доложены на VI и VII международных форумах «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2005 г, 2006 г), научной конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности» (Санкт-Петербург, 2006 г), региональной научной конференции СПХФА «Молодые ученые практическому здравоохранению» (Санкт-Петербург, 2007 г). Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры микробиологии ГОУ ВПО СПХФА.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования результатов диссертационной работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста (150 стр. вместе с приложениями) и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов, указателя литературы, включающего 100 отечественных и 115 иностранных источников. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 18 рисунками.
