Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Систематика, морфология, экология и распространение вешенки обыкновенной 12
1.1.1. Систематика вешенки обыкновенной 12
1.1.2. Экология и распространение грибов 13
1.1.3. Особенности питания древоразрушающих грибов 14
1.1.4. Использование разными штаммами Pleurotus ostreatus источников углерода 15
1.1.5. Использование разными штаммами Pleurotus ostreatus источников азота 16
1.2. Источники углерода 17
1.2.1. Краткая характеристика лигнина 17
1.2.2. Целлюлоза 20
1.3. Лигнолитический комплекс. Состав ферментов, механизм действия
1.3.1. Лигнинпероксидаза 24
1.3.2. Амилаза, ксиланаза и пектиназа 25
1.3.3. Мп- зависимая пероксидаза (Мп-ПО) 26
1.3.4. фенолоксидазы высших базидиомицетов и их свойства (ЛАК КФ. 1.14.18.1) 26
1.4. Ферментативный гидролиз целлюлозы 29
1.5. Регуляторы роста: их действие на растениях и грибах 34
1.5.1. Действие элиситоров на ферментативные системы живых организмов
1.5.2. Многоцелевой стимулятор защитных реакций, роста и развития растений - иммуноцитофит 39
1.5.3. Брассиностероиды. Свойства брассиностероидов 43
1.5.4. Функции брассиностероидов 45
1.6. Физиологическая роль элементов минерального питания и витаминов в процессе развития растительного организма 47
1.6.1. Элементы, необходимые для растительного и грибного организма 47
1.6.2. Физиологическая роль витаминов в процессе развития 51
грибного организма
1.7. Варианты усовершенствования технологии производства
зернового мицелия 54
ГЛАВА II. Экспериментальная часть 56
2.1. Цель и задачи исследования 56
2.1.1. Объект и методы исследований 56
2.2. Методы исследований 57
2.2.1. Приготовление жидкой сусло среды ( 4 по Баллингу)... 57
2.2.2. Приготовление питательной среды с факторами роста 57
2.2.3. Питательные среды и условия выращивания культуры
гриба вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) 58
2.2.4. Методика определения скорости роста культуры гриба вешенки обыкновенной: а) на чашках Петри, б) на жидкой среде... 59
2.2.5. Анализ биомассы и культуральной жидкости 60
2.2.6. Приготовление агаризованной солодовой среды 61
2.3. Определение ферментативной активности 61
2.3.1. Качественное определение активности ферментов 61
2.4. Подготовка ферментативного препарата 63
2.4.1. Определение активности ферментов лигнолитического комплекса 63
A) Определение активности тирозиназы (ТИР). Тирозиназа или монофенол-монооксигеназа (К.Ф. 1.14.18.1) 63
Б) Определение общей активности пероксидазы (ПО). (КФ 1.11.1.7.) 66
B) Определение Мп-зависимой пероксидазы (КФ 1.11.1.1.) (Мп-ПО) 66
Г) Определение активности полифенолоксидазы лакказы (ЛАК). (КФ 1.14.18.1). 67
Д) Определение активности целлюлазы (ЦЕЛ). (КФ 3.2.1.4).
Количественный метод определения целлюлозолической активности 68
2.4.2. Определение белка по методу Брэдфорда 69
2.5. Электрофоретические исследования 70
2.6. Специфическое окрашивание фермента 72
2.7. Статистическая обработка 73
2.8. Полученные результаты и их обсуждение 74
2.8.1 Влияние факторов роста (витаминов, питательных добавок и минеральных солей) на рост и развитие мицелия вешенки обыкновенной 74
2.8.2. Изучение влияния питательных добавок на рост мицелия вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus 74
2.8.3. Влияние витаминов на рост и развитие мицелия Pleurotus ostreatus 77
2.8.4. Влияние минеральных добавок на рост и развитие гриба вешенки обыкновенной 32
2.9. Влияние биорегуляторов на рост и развитие мицелия вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Fr). Kumm 93
2.9.1. Изучение действия биорегуляторов на рост мицелия вешенки (агаризованная среда) 93
2.9.2. Действие биорегуляторв эпина и иммуноцитофита на рост и развитие культуры вешенки обыкновенной на жидкой сусло среде 4% по Баллингу и зерновой среде
2.9.3. Изучение действия биорегуляторов роста на плодоношение вешенки обыкновенной і оз
2.10. Оптимизация состава питательной среды для роста мицелия вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus) 106
2.10.1 Агаризованные среды. Изменение на них скорости роста культуры (Pleurotus ostreatus) 106
2.10.2. Влияние питательных добавок на скорость роста культуры вешенки обыкновенной при переходе с одной среды (агаризованной) на зерновую среду (зерно овес)
2.11. Изменение активности ферментов лигнолитического комплекса под действием регуляторов роста
2.11.1 Качественный метод определения активности ферментов
2.11.2 Количественный метод активности ферментов 115
2.11.3 Зависимость удельной активности фермента ЛАК от стадии роста мицелия на жидких средах разного состава..
2.11.4 Электрофоретические исследования 119
2.11.5 Определение субстратной специфичности фермента лакказы j 24
2.11.6 Влияние биорегуляторов на активность целлюлозолитических ферментов 126
2.12. Разработка способа выращивания мицелия в полимерных пакетах 6
Заключение 133
Выводы 136
Список литературы
- Особенности питания древоразрушающих грибов
- Многоцелевой стимулятор защитных реакций, роста и развития растений - иммуноцитофит
- Приготовление питательной среды с факторами роста
- Влияние биорегуляторов на рост и развитие мицелия вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Fr). Kumm
Особенности питания древоразрушающих грибов
Важной составной частью питания грибов являются вещества витаминного характера и стимуляторы роста. На их значение в своих работах обращает внимание Вакин А. Т. [20-25]. Он пишет, что типичные «паразиты» или дереворазрушающие грибы быстро отмирают после рубки ствола, так как прекращается синтез веществ, стимулирующих рост, хотя химический состав древесины, ее физическое состояние сохраняются.
Некоторые грибы используют органические остатки любого рода (убиквисты), но другие предпочитают совершенно определенные субстраты: например, часть Dothideaceae обитает только на растениях определенного рода или вида (специализированные сапробионты). В естественных условиях вешенка поселяется на ослабленной или мертвой древесине, относится к группе ксилотрофов (дереворазрушающих грибов). Основным источником питания дереворазрушающих является древесина. Отчасти такая специализация зависит от того, располагает ли гриб ферментами для разложения нерастворимых источников углерода (например, крахмала, целлюлозы, лигнина) или же он способен перерабатывать только растворимые органические вещества. На здоровых деревьях, как правило, грибы, относящиеся к этой группе, не встречаются. Характерно вертикальное расположение вешенки по стволу дерева, центрическое расположение опенка на пне.
В группе ксилотрофов выделяют две подгруппы: ксилотрофы-паразиты и ксилотрофы-сапрофиты [49-53]. Вешенка относится ко второй подгруппе. Рост и развитие вешенки, как и других дереворазрушающих грибов, находятся под влиянием природных условий: температуры, освещения, влаги [56].
Соединения, содержащие углерод, играют основную роль в питании, поскольку участвуют как в конструктивном, так и в энергетическом процессах гетеротрофных организмов. К наиболее богатым углеродом органическим веществам принадлежат углеводы, которые при окислении способны расщепляться на более простые соединения с освобождением энергии. Утилизация источников углерода высшими базидиомицетами в основном зависит от следующих факторов: физической доступности, условий культивирования, присутствия в среде других питательных веществ, времени культивирования, адаптации штамма к субстрату [128,129,174].
Глюкоза считается биологически самой важной из гексоз, она используется практически всеми видами грибов [1,3,10]. Однако, согласно наблюдениям Бисько и Дудки [8-11], при поверхностном выращивании глюкоза как единственный источник углеводов редко является наилучшей для накопления биомассы вешенки. Это подтвердили и другие исследователи [49-52].
Вопреки существующему в литературе мнению [48-50] о предпочтительном использовании видами рода вешенка моносахаридов по сравнению с дисахаридами, было показано, что биомасса, накапливаемая штаммами на лактозе и сахарозе, а также штаммами на сахарозе, превышала значения биомассы этих штаммов на моносахаридах [9]. Вместе с тем, на среде с лактозой штаммы накапливали наименьшую биомассу по сравнению с другими источниками углерода [9]. Для всех штаммов, исследованных в аналогичных условиях, мальтоза и сахароза явились наилучшими источниками углерода [55-58]. Изученные штаммы наименьшим образом отличались по накоплению биомассы при росте на арабинозе и галактозе. Наибольший разброс наблюдался среди изученных штаммов вешенки на среде с лактозой.
Азот очень важный элемент питания для дереворазрушающих грибов. Он необходим не только для построения хитиновой клеточной стенки, но и, прежде всего, является основой белковой части протопласта, входит в состав молекул аминокислот, белков и ферментов. Содержание его в древесине относительно небольшое, обычно 0.1-0.3 %, находится он главным образом в составе органических соединений остатков цитоплазмы внутри пустых клеточных полостей. [1,5].
Азот в органических соединениях - белках и пептонах более доступен для грибов, чем азот нитратов или аммонийных солей [1, 5]. С увеличением азота в древесине увеличивается скорость роста грибов и интенсивность их деятельности.
Основными источниками неорганического азота являются нитратные и аммонийные соли [128,129]. В. Лилли и X. Барнет также отмечали, что аммонийные соли обеспечивают лучший рост грибов, чем нитраты и аминокислоты [58,128]. Вместе с тем в литературе представлены данные о слабом использовании штаммами вешенки неорганических источников азота [1,5,10,128].
Питательная ценность различных аминокислот неодинакова и зависит как от состава, так и от конфигурации молекул [211,212]. Предполагается, что только естественные L-изомеры аминокислот могут быть использованы высшими базидиомицетами [53]. Утилизация аминокислот является специфической особенностью штамма. Из алифатических кислот, не содержащих функциональных дополнительных групп, соединения с более короткой цепью -валин, глицин, аланин - в среднем обеспечивают более интенсивный рост грибов, чем аминокислоты с большим количеством атомов [7,8,128]. Это положение подтверждается полученными данными для многих штаммов P.ostreatus [8,9]. Для штаммов, изученных Бисько и Дудкой, глицин является оптимальным источником азота. Наименьшую биомассу все изученные ими штаммы вешенки, кроме 525, накапливали на средах с аспарагиновой кислотой. Только два штамма-476 и 482-образуют большую биомассу на средах с аминокислотами, чем на средах с неорганическими источниками азота.
Дереворазрушающие грибы в природе сопутствуют древесине, вызывая ее разложение (декомпозицию), которое называется гнилью. Эта деятельность грибов определяется их физиологией. Своими гифами грибы прорастают в древесину и разлагают не только ее, но и лигнин.
Лигнин (lignum- древесина)- смешанный аморфный полимер фенольного ряда (производный ароматических спритов) нерастворимый в воде. Он является одним из компонентов клеточной стенки. Он является самым распространенным после целлюлозы полимером древесных клеток. Лигнин увеличивает жесткость клеточной оболочки и обычно содержится в клетках, выполняющих опорную, или механическую, функцию [7,8,20-25]. Лигнин - сложное вещество, повышающее твердость, а также прочность на сжатие и на разрыв[33,36,38,40]. Он откладывается на поверхности первичной целлюлозной клеточной стенки и в микроцеллюлярных пространствах целлюлозы [50,53].
Многоцелевой стимулятор защитных реакций, роста и развития растений - иммуноцитофит
Грибы, так же как и бактерии, по отношению к витаминам разделяются на две группы: витаминоауксогетеротрофные, то есть не обладающие способностью синтезировать необходимые для них витамины (для роста этих грибов необходимо внесение в питательную среду витаминов), и витаминоауксоавтотрофные, обладающие способностью синтезировать при росте в минеральноуглеводной среде необходимые для роста витамины [40,48,52]. Большинство сапрофитных видов грибов относится к витаминоауксоавтотрофной группе. Многие виды облигатных паразитных грибов являются представителями витаминоауксогетеротрофной группы. Однако это распределение на группы несколько условно, так как при добавлении в питательную среду витаминов усиливается рост мицелия и ауксоавтотрофных грибов [86,113]. Например, типичным сверхсинтетиком рибофлавина являются Eremothecium ashbyi, используемый в качестве продуцента этого витамина при промышленном получении, однако при добавлении рибофлавина в определенной концентрации рост его усиливается. Многие корнеобитающие виды фузариев могут синтеризовать витамины группы В, главным образом никотиновую кислоту и пиримидин [113,118,136].
Потребность в витаминах и синтезирующая способность у грибов зависят от возраста культуры и условий культивирования, например, для ауксоавтотрофного гриба Aspergillus niger при повышенной температуре культивирования (до 42 С) на среде с рамнозой необходим биотин, тогда как для Pythium butleri при культивировании на питательной среде с повышенной концентрацией минеральных солей необходим тиамин [17].
Биологическая роль витаминов еще мало изучена на базидиомицетах, но судя по имеющимся данным, она весьма значительна. В связи с этим целесообразно исследовать влияние витаминов для дальнейшего их практического использования при культивировании съедобных грибов.
Таким образом, анализ литературных данных показал, что питательные элементы имеют большое значение для роста и развития грибов, так как они: 1) входят в состав биологически важных органических веществ. 2) Участвуют в создании определенной ионной концентрации, стабилизации макромолекул и коллоидных частиц. 3) Участвуют в каталитических реакциях, входя в состав или активируя отдельные ферменты. 1.7. Варианты усовершенствования технологии производства зернового мицелия Проведенный обзор литературы по влиянию регуляторов на рост мицелия базидиальных грибов показал, что этой теме посвящено довольно много работ. Существует много статей, где исследовались различные свойства регуляторов, среди которых эпибрассинолид, кинетин и другие. Разными авторами показано, что регуляторы обладают мощным ростстимулирующим действием не только на растения, но и на грибы, в частности, на рост мицелиальной культуры [8].
Интересной в этом отношении является и более поздняя работа этих же авторов по влиянию БС на плодообразование шампиньона двуспорового Agaricus bisporas [11,114,125, 148].
Так, ими было показано, что ЭБ в определенной концентрации вызывает при культивировании шампиньона увеличение плодовых тел.
В последнее время проводилось немало работ по изучению ростстимулирующих свойств витаминов и минеральных веществ. Многие исследователи пытались усовершенствовать технологию производства зернового мицелия с применением витаминов, минеральных веществ, регуляторов [161,162,164,166]. В ходе экспериментов было выяснено, что витамины и минеральные вещества увеличивают секрецию ферментов как у высших растений, так и у бактерий, микробов, дрожжей, плесневых грибов [62,71,167,168,184]. Поэтому полученные этими исследователями результаты являлись веским доводом в пользу изучения данных регуляторов, минеральных солей, витаминов и применения их в технологии производства зернового мицелия гриба вешенки [196,208-222].
Используемые нами препараты: биорегуляторы, гумминовые добавки, минерально-питательный комплекс обладают ростстимулирующими свойствами, они способны активизировать работу ферментов лигнолитического комплекса, что, в свою очередь, может привести к более быстрому освоению субстрата мицелием, и повысить конкурентоспособность культуры к другим I.JJS I; ; рибам (Mucor, Penicillium, Trixoderma). Это может явится существенным для технологии выращивания вешенки, так, как на первом критическом этапе обрастания субстрата увеличится скорость роста мицелия и его конкурентная способность [1-11,167,168,184,187].
Возможно, с помощью исследуемых нами препаратов удастся повысить конкурентоспособность мицелия к посторонней микрофлоре и увеличить его скорость роста. Это в полной мере может относиться и к изучаемому в данной работе процессу усовершенствования технологии выращивания мицелия вешенки.
Приготовление питательной среды с факторами роста
1. Бедная среда (голодный агар) [17,118] готовилась следующим образом. Агар -18 г, вода (водопроводная, дистиллированная) 1 л. Раствор стерилизовали 25 мин при 121 С.
2. Бедную среду (голодный агар) готовили вышеуказанным образом. В среду стерильно вносили витамины группы «В» (Вь В6, Ві2, раздельно) в следующих концентрациях: 0,2 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,8 мг/мл, 1,0 мг/мл, 1,2 мг/мл, 1,4 мг/мл.
3. Комплексная среда - готовили как указано выше. В среду стерильно вносили витамин В] в концентрации 2 мг/л, МІЖ в концентрации 1,0-10"2 мг/мл, биорегулятор иммуноцитофит, который подвергали стерилизации через мелкопористый фильтр, затем стерильно вносили в автоклавированную агаризованную питательную среду. Концентрации последнего составляла 5,2 х 10" 5 мг/л. Добавляли в среду сахарозу 20 г на 1 л. Разливали в стерильные чашки. Затем производили посев культуры. Измерения проводились в первом и во втором случае в двух взаимно-перпендикулярных направлениях с интервалом в трое суток. Эксперимент длился 14 суток.
4. В агаризованную среду (сусло 4 по Баллингу) стерильно вносили минеральные соли: сульфаты железа, магния, меди, цинка и комплекс МПК, который представляет собой смесь микроэлементов (железа, магния, цинка и меди), конечные концентрации которых были - 0,0001-0,1 мг/мл. Диаметр колонии измеряли с интервалом в двое суток, в двух взаимно-перпендикулярных направлениях.
В предварительных исследованиях было показано, что прорастание мицелия на агаризованной сусло-среде (4 по Баллингу) составляет 11 дней. С целью сокращения срока прорастания были проведены исследования с добавлением в среду гумминовых веществ, в качестве которых были взяты гуммикс, гумат, а так же использовались экстракты, содержащие гумминовые вещества и микроэлементы (препараты, выпускаемые нашей промышленностью -"Буцефал", "Идеал", "Эффектон").
Скорость роста измерялась в двух взаимно-перпендикулярных направлениях с периодичностью в два дня. В среду стерильно вносились растворы гумминовых веществ или питательных добавок различных концентраций.
Культуру Pleurotus ostreatus поддерживали на косяках сусло-агар. (4 по Баллингу). Культуру выращивали на чашках Петри диаметром 10 см. Культивировали до полного обрастания поверхности чашки культурой в стационарных условиях при 25С или каждые 2-3 сут в течении 30 сут измеряли диаметр колонии в 3 направлениях, а также высоту колонии (мм). Отмечали плотность колонии по трехбалльной системе (1-редкая, 2-средняя, 3-плотная). На основании полученных данных вычисляли ростовой коэффициент (РК) по предложенной формуле [10,11]: PK=dhg/t, где, d -диаметр колонии, мм; h- высота колонии, мм; g- плотность колонии, балл; t - возраст колонии, сут.
РК позволяет сравнивать рост культур разного возраста и колоний с различной текстурой. Его определяли, когда колония достигала максимального размера или дорастала до краев чашки Петри. При исследовании роста культур при разных температурах в качестве питательной среды использовали агаризованное пивное сусло. Инокулированные мицелиальной культурой чашки Петри помещали в термостат при температуре 22, 28С и других температурах. По скорости роста различали быстрорастущие (РК 00), растущие со средней скоростью (РК 50 si 00), медленнорастущие (РК 0) [8,47].
Жидкий инокулят получали выращиванием в 750 мл колбах Эрленмейера, содержащих 100-мл сусло - среды (4 по Баллингу) в течение 5 суток при температуре 25 С поверхностным способом без качания. Среду стерилизовали в автоклавах в режиме стерилизации сред 1 атм, температура 120 С 40 мин . Методика определения скорости роста культуры гриба вешенки обыкновенной: а) на чашках Петри, б) на жидкой среде а) Стерильную агаризованную среду разливали в чашки Петри диаметром 10 см, охлаждали. В центр чашки Петри помещали культуру вешенки, выращенную на скошенной агаризованной среде в пробирке. Скорость роста колонии измеряли, выращивая мицелий на чашках Петри. Диаметр колонии измеряли один раз в двое суток, в двух взаимно-перпендикулярных плоскостях. Измерения проводили до полного обрастания поверхности чашки культурой. б) Скорость роста мицелия на жидкой среде определяли по накоплению биомассы выращенной на определенные сутки.
Жидкую среду готовили, как описано выше. В стерильную среду помещали вырезку культуры с чашки Петри. Количество биомассы определяли через каждые двое суток. Для этого мицелиальные клетки отфильтровывали, тщательно промывали дистиллированной водой, затем высушивали при температуре 105С до постоянной массы.
Наличие у исследуемого штамма высших базидиомицетов оксидаз (лакказы, тирозиназы, пероксидазы) устанавливали с помощью качественных цветных химических реакций. 2.2.6. Приготовление агаризованной солодовой среды. Приготовление солода (зеленого). 1 день - замочить вымытое зерно (ячмень) 10 г 1% раствором перманганата калия КмпС 4 на 2 часа. Затем раствор слить и залить водой на 4 часа. После этого набухшее зерно оставить на ночь без воды. 2 день - замочить в воде на 4 часа. Воду слить. Последующие 3-4 день набухшее зерно находиться без воды в термостате при температуре 16-18 С. Готовый солод слили в колбу на 500 мл, довели водой до объема 250 мл, добавили 70 г. агара. Проавтоклавировали. Разлили по стерильным чашкам Петри.
Для определения активности ферментов был использован метод Бавендамма. Метод Бавендамма [10] используется для разделения грибов на целлюлозоразрушающие и лигнинразрушающие на основе того, выделяет гриб оксидазы или нет. К агар-солодовой среде добавляют ОД-0,5% танина или галловой кислоты. Выделение фенолоксидаз характеризуется появлением коричневой окраски в субстрате вблизи растущего мицелия. Лир [11,37,44-48,178-183] применял более низкие концентрации танина (0,08-0,1%), так как большее их содержание тормозит рост гриба и влияет непосредственно на выделение ферментов. Исходя из этого, мы брали пониженные концентрации этих веществ. Другие авторы [1,4,5] считают, что танин и галловая кислота дают различный эффект и их нельзя считать физиологически равноценными тестами [10,11], поэтому мы изучили оба способа Метод Йоргенсена-Вайбли [11] - основан на окислении антоцианов. Грибы, выделяющие фенолоксидазы, изменяют красный или синий цвет антоциана на желтый под действием фенолоксидаз. Тихи и Сханел рекомендуют смесь диэтиленпарафенилендиамина с а-нафтолом или ментолом. При совместной методике эту реакцию можно использовать и для количественного определения фенолоксидаз, как частный случай лигнинразрушающих ферментов [8,10,11]. Реакцией Бавендамма обнаруживают не менее трех ферментов: п-дифенолоксидазу, пероксидазу и о-дифенолоксидазу. Комплексную реакцию Бавендамма можно заменить другими цветными реакциями (Табл. 4) [10]. Наличие у исследуемого штамма вешенки оксидаз (лакказы, тирозиназы, пероксидазы) устанавливали с помощью качественных цветных химических реакций, которые проводили путем нанесения капли реактива на поверхность растущей на агаризованной среде колонии [10]. Изменения окраски отмечали через 30 мин, 3,24,72 часа
Влияние биорегуляторов на рост и развитие мицелия вешенки обыкновенной Pleurotus ostreatus (Fr). Kumm
В задачу нашего исследования входило выявление действия биорегуляторов на рост мицелия вешенки обыкновенной на жидкой и зерновой среде.
В эксперименте на жидкой сусло среде регуляторы роста стерильно вводили в среду непосредственно перед посевом. В качестве инокулята для жидкой среды использовали культуру, выращенную на чашках Петри без биорегуляторов. Выращивание проводили в стандартных условиях. В колбах объемом на 250 мл находилось 100 мл среды с 1-2 г. посевного материала. Колбы оставались без качания в течение всего эксперимента (20 суток), при стандартных условиях (температура 25 С) [199].
Количество биомассы определяли через каждые 2 дня, для этого мицелиальные клетки отфильтровывали, тщательно промывали дистиллированной водой, затем высушивали при температуре 105С до постоянной массы.
При изучении влияния разных концентраций эпина и иммуноцитофита на рост мицелия было установлено, что максимальный рост мицелия вешенки на агаризованной среде с эпином достигается в концентрации 2.5 х 10 -8 мг/мл, иммуноцитофита -5.2 х 10 5 мг/ мл. В жидкой среде стимулирующий эффект наблюдался в тех же концентрациях (Рис.25). При этом количество биомассы по завершению эксперимента составило 12.02 г/л в варианте с добавлением эпина, а в контрольной пробе 7 г/л. Концентрация эпина в жидкой среде 2.5 х 10 5 мг/мл и выше вызывала ингибирование роста мицелиальных клеток.
При добавлении в среду иммуноцитофита в концентрации 5.2 х 10"5 мг/мл наблюдалось максимальное накопление биомассы и оно составило 16.0 г/л. С повышением концентрации иммуноцитофита 10" -10" мг/мл наблюдалось ингибирование роста культуры.
Таким образом, добавление в среду биорегуляторов эпина и иммуноцитофита приводит к увеличению роста мицелия, а соответственно, к увеличению биомассы при определенных концентрациях. время экспозиции, сутки Рис.24 Изменение количества биомассы культуры вешенки обыкновенной в процессе роста на жидкой среде с добавлением биорегуляторов в течении8 суток.
Важно отметить, что биорегуляторы достаточно внести в среду на начальной стадии, а именно в агаризованную сусло среду, в чашку Петри. Биорегуляторы сохраняют свое действие при пересевах с агаризованной среды на зерновую, и с зерновой на соломистый субстрат. В ходе исследований были выявлены пороги ингибирования для каждого из данных биорегуляторов. Так, для эпина на всех исследуемых нами средах эта концентрация составила 2.5 х 10"5 мг/мл. Для иммуноцитофита пороги ингибирования были определены в концентрации 5.2 х 10" мг/мл, что касается твердых сред: (зерно (овес) и зерно с гуммиксом)), то ингибирование наблюдалось в концентрации - 5.2 х 10" мг/мл.
Таким образом, изученные нами биорегуляторы могут оказывать на культуру вешенки обыкновенной как стимулирующее действие, так и ингибирующее, в зависимости от концентрации на всех изученных типах сред.
Наши дальнейшие исследования по выявлению действия регуляторов касались их влияния на плодоношение вешенки обыкновенной.
Посевной материал получали в присутствии биорегуляторов эпина и иммуноцитофита по описанной выше методике. После зарастания всей поверхности чашки Петри проводили инокуляцию следующего субстрата - зерна. Свежеинокулированные бутылки оставляли в камере инкубации до полного зарастания мицелием [215,216]. Далее зерновой мицелий использовали для выращивания грибов по стандартной технологии на соломистом субстрате (злаковые - пшеница, ячмень, рожь, овес). Влажность субстрата 75 %. Результаты представлены в таблице 8,9.
Из таблиц 8, 9 видно, что скорость роста мицелия на агаризованной среде увеличивается при добавлении иммуноцитофита по сравнению с контролем на 84.4%, при добавлении эпина на 82%. После внесения биорегуляторов в агаризованную среду на первом этапе их свойства сохраняются и дальше. При этом на зерновой среде скорость роста с иммуноцитофитом увеличивается на 37.7%, при введении эпина - на - 27.9 %. Биорегуляторы влияют не только на скорость роста культуры, что способствует быстрому освоению субстрата и повышению конкурентоспособности, но и на плодоношение - увеличивают урожайность. Так, при добавлении иммуноцитофита на первом этапе повышение урожайности составило 38.0 % по сравнению с контролем, а эпина - 37.6 %. На наш взгляд, это может быть важным для технологии выращивания вешенки обыкновенной P. ostreatus. Положительное влияние регуляторов на рост мицелия возможно связано со стимуляцией ферментов лигнолитического комплекса: целлюлазы и полифенолоксидазы, которые в основном участвуют в разложении и утилизации целлюлозосодержащих субстратов.
Во многих лабораториях для культивирования высших базидиомицетов используют самые различные среды: агаризованное пивное сусло (СА), картофельно-глюкозный агар (для культивирования, например, шампиньонов; КГА), синтетическую среду Норкса (СН), мальц - агар и другие. [1,2,11]. Для некоторых видов, особенно представителей порядка Boletales, отмечается хороший рост на КГА, хотя другие виды значительно хуже растут на этой питательной среде [118].
Для культивирования вешенки обыкновенной также используют различные питательные среды: среда Чапека, Виноградского, Чапека-Докса, среда Сагуро и другие [8,11, 118], при этом скорость роста мицелия на них невысокая.
В связи с этим в задачу дальнейшего исследования входило: сравнительное изучение роста мицелия вешенки обыкновенной, на разных средах: агаризованная сусло - среда, бедная агаризованная и синтетическая среда. При исследовании скорости роста вешенки обыкновенной на разных средах учитывался диаметр колонии, плотность колонии и ее высота [9-11].
Ранее [8,11,102-104] нами было установлено, что объект нашего исследования гибридный сорт НК-35 относится к штамму со средней скоростью роста (РК = 50 - 100). Поэтому данный сорт мог быть удобен для проведения сравнительных анализов при росте на разных средах.
Для оценки роста культуры вешенки на агаризованных средах нами был использован предложенный ранее способ определения ростового коэффициента [8, 11] . Ростовой коэффициент (РК), который учитывает не только диаметр колонии d, но и высоту ее h (мм), плотность g, которая оценивается по трех-бальной системе: 1-редкая, 2-средняя, 3-плотная, возраст t (сут.).
