Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ И ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 8
ГЛАВА I. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПОСОМ ДЛЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ /ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ/ 14
Введение о 14
I.Искусственные липидные мембраны 15
1.1. Типы липидных мембран 16
1.2. Характеристики липидных мембран. Фазовые переходы 19
1.3. Моделирование свойств клеточной мембраны с помощью липидных бислоев 21
И. Механизмы взаимодействия клеток с липидными мембра нами /липосомами/ 26
П.І. Взаимодействие жидко-кристаллических липосом с клетками 28
П.ІА. Связывание с поверхностью 28.
П.ІБ. Слияние липосом с клеткой 33
П.IB. Эндоцитоз 37
П.ІГ. Обмен липидными молекулами между липосо- мальной и клеточной мембранами 39
П.2. Взаимодействие "твердых" липосом с клетками... 40
П.З. Взаимодействие с клетками искусственно модифи цированных липосом 46
П.4. Липосомо-клеточные взаимодействия. Проблемы... 47
Ш. Использование липосом для введения различных веществ В КЛеТКИ in vitro И in viV0 ^9
Ш.І. Введение заключенных в липосомы веществ в клет ки in vitro 49
Ш.2. Введение зондов в клеточные мембраны 51
Ш.2А. Изучение компартментализации липидных мо лекул в клетках 52
Ш.2Б. Динамика липидов в клеточных мембранах... 55
Ш.З. Модификация клеточных мембран липосомами 57
Ш.4. Липосомы in vivo 68
ІУ. Заключение 74
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 77
I. Материалы 77
1.1. Липиды 77
1.2. Флуоресцентные вещества 77
1.3. Радиоактивные маркеры 77
1.4. Антитела 78
1.5. Среды для культивирования клеток 78
1.6. Прочие материалы 78
П. Аппаратура 80
Ш. Методы 80
Ш.І. Хроматография 80
Ш.2. Радиоактивный анализ 81
Ш.З. Электронная микроскопия 82
Ш.4. Световая микроскопия 82
Ш.5. Спектроскопические методы 82
Ш.6. Выделение и анализ липидов 83
Ш.7. Получение липосом 84
Ш.8. Клетки и их культивирование 85
Ш.9. Распределение связанного конканавалина по поверх ности клеток 87
Ш.І0. Агрегация и адгезия клеток 88
Ш.ІІ. Определение митостатического действия и накоп ления в клетках колхицина и колцемида JB8
Ш.І2. Связывание липосом с клетками и его оценка 89
Ш.ІЗ. Воспроизводимость результатов 90
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 91
Введение 91
I. Прикрепление клеток на плоские липидные мембраны. (Роль микровязкости) 92
1.1. Структура и свойства плоских липидных мембран, адсорбированных на твердом носителе 92
1.2. Адгезивность фосфолипидных пленок для фиброблас-топодобных и эпителиоидных клеток 98
1.3. Латеральное движение на клеточной поверхности в области контакта с липидной пленкой J04
1.4. Адгезия тромбоцитов к липидным пленкам .106
1.5. Адгезия тромбоцитов к пластам эпителиальных клеток 117
1.6. Резюме раздела 1 118
П. Связывание клетками липосом. (Роль микровязкости)...122
П.І. Связывание "твердых" липосом фибробластоподобны- ми клетками 122
П.2. Связывание "твердых" липосом эндотелиалышми и эпителиальными клетками J32
П.З. Взаимодействие "жидких" липосом с фибробластопо- добными клетками 150
П.4. Взаимодействие "жидких" липосом с эпителиальными клетками 154
П.5. Роль проницаемости связавшихся с клеткой липосом в проникновении их содержимого в цитоплазму 155
П.6. Использование "жидких" липосом для введения в резистентные клетки митостатических ядов J59
П.7. Конкуренция "твердых" и "жидких" липосом за свя зывание с клеточной поверхностью J66
П.8. Конкуренция между различными липосомами и липо- протеидами крови за связывание с липосомо-свя- зывающими центрами 169
П.9. Метод специфического связывания липосом с клетка ми 173
П.9А. Получение иммуноглобулин-содержащих липо сом 174
П.9Б. Связывание иммунных липосом с клетками...175
П.10. Магнитолипосомы и сортировка клеток в магнитном поле 183
П.І0А. Получение магнотичувствительных липосом /магнитолипосом/ 184-
П.І0Б. Получение иммуномагнитолипосом 184-
П.І0В. Сортировка клеток с помощью иммуномагни толипосом 185
П.II. Резюме раздела П 191
Ш. Переход липидных молекул между модельными и клеточны ми мембранами 194-
Ш.І. Введение радиоактивной метки в клеточные липи- ды 195
Ш.2. Переход липидов фибробластоподобных клеток на "жидкие" липосомы 195
Ш.З. Переход липидов эпителиальных клеток на "жид кие" липосомы 201
Ш.4-. Отсутствие перехода клеточных фосфолипидов на "твердые" липосомы 202
Ш.5. Влияние связывания "твердых" липосом на переход клеточных липидов на "жидкие" липосомы .204
Ш .6. Резюме раздела Ш 204
IV. Изменение струкхуры липосом в результате взаимодейст вия с клетками 207
ІУ.І. Образование крупных липидных агрегатов и их проницаемость 207
ІУ.2. Частичная характеристика клеточных компонент, ответственных за трансформацию липосом 212
ІУ.З. Резюме раздела ІУ 216
V. Влияние липосом на адгезивные и морфологические харак теристики клеток 218
УЛ. Влияние липосом на адгезию клеток к субстратам. 218
У.2. Угнетение липосомами межклеточной агрегации...223
У.З. Морфологические изменения клеток под действием липосом 223
У.4. Резюме раздела У 225
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 229
Введение 229
I. Адгезивность липидных мембран для клеток 229
П. Взаимодействие "твердых" и "жидких" липосом с клет ками 240
Ш. Взаимодействие иммуно- и иммуномагнитолипосом с клет ками 255
IV. Модификация липосом под действием клеток 259
V. Модификация адгезионных и морфологических свойств кле ток под действием липосом 2Ы
VI. Механизмы взаимодействия клеток с липосомами. Возмож ности и ограничения применения искусственных липидных мембран в фундаментальных и практических исследова ниях .271
VII. Заключение. Взаимодействие клеточной поверхности с окружающей средой .275
ВЫВОДЫ .282
ЛИТЕРАТУРА .286
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема контактных взаимодействий клеток является одной из центральных для современной биологии и медицины. Благодаря таким взаимодействиям возникает упорядоченная организация многоклеточных систем - органов и тканей. С контактными взаимодействиями клеток связано восстановление правильных структур при регенерации. Нарушение контактных взаимодействий при злокачественной трансформации клеток приводит к таким тяжелым,последствиям, как инвазивный рост и метастазирование.
Особое место занимает проблема контактных взаимодействий в кардиологии. Ключевую роль в образовании тромбов играет адгезия тромбоцитов к поврежденным участкам сосудистого эндотелия: ин-тактный эндотелий неадгезивен для тромбоцитов. Целостность эндо-телиального слоя обеспечивается прочными контактами между соседними клетками, хотя причины его не адгезивноети остаются во многом неизвестными.
Контактные взаимодействия клеток широко изучаются в последние годы на клеточных культурах. Однако, даже в таких системах, где сравнительно с целым организмом условия упрощены, контактные взаимодействия клеток остаются весьма сложным явлением. Дело в том, что контакт клеточных мембран быстро включает цепь внутриклеточных реакций: перестройку системы микрофиламентов, сборку и разборку микротрубочек, ретракцию и выбрасывание отростков, включение новых синтезов. Изменение цитоскелета и кортикальных белков клеток при межклеточных контактах широко изучаются. Между тем, хотя по определению контактные взаимодействия начинаются с контакта двух клеточных поверхностей, оставалось непонятным даже, какие свойства клеточных мембран определяют различные аспекты этих взаимодействий. Не была изучена роль основы биологических мембран - липидного би-слоя при контактных взаимодействиях клеток.
Липидная фаза определяет все динамические характере тики клеточных мембран. Плазматические мембраны в целом находятся в жидко-кристаллическом состоянии. Однако, в последнее время установлено существование в клеточной мембране более и менее вязких доменов. Значение тех и других для контактных взаимодействий клеток оставались совершенно неизвестными. Поэтому актуальной фундаментальной задачей представляется изучение зависимости различных аспектов межклеточных контактных взаимодействий от динамических характеристик липидного слоя клеточных мембран.
Изучение механизмов межмембранных взаимодействий актуально и с практической точки зрения. Эта проблема тесно связана с разработкой в последние годы методов направленной доставки лекарственных веществ с помощью искусственных мембран в форме липосом к клеткам и тканям организма, в частности, сердечно-сосудистой системы.
Предпринимались попытки моделировать межклеточные контактные взаимодействия на искусственных мембранах. Однако, результаты таких исследований часто трудно экстраполировать на взаимодействие живых клеток. Поэтому для решения поставленной задачи необходимо было разработать более адекватную экспериментальную систему, позволяющую исследовать как свойства мембран влияют на исход контактного взаимодействия клеток. Сказанное выше определило цели и задачи настоящей работы.
Цель и задачи работы. Цель работы состояла в исследовании роли липидного матрикса мембран в контактных взаимодействиях клеток. Мы поставили перед собой ел едущие задачи: I) разработать экспериментальную систему для изучения контактных взаимодействий клеток с модельными мембранами; 2) изучить зависимость таких взаимодействий от фазового состояния липидов мембран; 3) выяснить, какие структурные перестройки происходят в модельных и клеточных мембранах в про цевсе их взаимодействия; 4) проверить имеют ли место закономерности, обнаруженные в модельных системах, при реальных межклеточных взаимодействиях; 5) на основании изученных закономерностей взаимодействий клеток с липидными мембранами разработать практические методы воздействия на клетки, в частности, с помощью ли-посом.
Научная новизна работы. Разработан новый экспериментальный подход к исследованию контактных взаимодействий клеток, состоящий в том, что одна из взаимодействующих клеток заменена на модельную липидную (протеолипидную) мембрану. В такой системе мы, с одной стороны, имеем интактную живую клетку, а с другой - искусственную мембрану, свойства которой задаются экспериментатором. Система использовалась в двух модификациях: "клетка - плоская липидная мембрана" и "клетка - липосома".
Впервые для изучения контактных взаимодействий клеток с плоскими мембранами использована система липидных пленок, адсорбированных на твердом носителе. Показано, что пленки представляют собой анизотропную структуру, состоящую из мультислоев липидов; измерены температуры фазовых переходов в таких мультислоях. Изучена адгезия тромбоцитов, фибробластов и эпителия к адсорбированным на твердом носителе липидным пленкам.
Впервые обнаружена зависимость клеточной адгезии от микровязкости липидного субстрата: показано, что липидные пленки в жидкокристаллическом состоянии неадгезивны для тромбоцитов, а также для фибробластоподобных и эпителиоидных клеток.
Проведено первое систематическое сравнительное изучение взаимодействия с клетками липосом в разных фазовых состояниях. Впервые обнаружено существование на клеточной поверхности центров, связывающих липидные мембраны и изучено их распределение на эндотелиальных и эпителиальных пластах. Доказана концентрация таких центров в об ласти межклеточных контактов.
Впервые обнаружено, что блокирование центров, связывающих ли-пидные мембраны, с помощью липосом угнетает адгезию клеток к сформированным клеточным слоям.
Получены первые данные о конкуренции липопротеидов низкой плотности крови и липосом за связывание с липосомо-связывающими центрами на клеточной поверхности.
В процессе контактного взаимодействия происходят структурные изменения липосомальной и клеточной мембраны, которые впервые детально исследованы. Продемонстрирована агрегация и увеличение проницаемости липосом под действием клеточных мембран. Структура клеточной поверхности также подвергается перестройке под действием липосом. Показано, что липосомальная мембрана при контакте с клетками захватывает клеточные фосфолипиды, меняя таким образом свой состав. Этот процесс опосредуется липосомо-связывающими центрами на поверхности клетки.
На основе обнаруженных закономерностей взаимодействия липосом различного фазового состояния с клеточной поверхностью разработаны новые методы применения липосом для воздействия на клетки: а) липосомы впервые использованы для преодоления резистентности клеток к ингибирующему действию митостатика - заключенный в липосомы колхицин проникает в цитоплазму резистентных клеток; б) сконструированы липосомы, избирательно связывающиеся с антигенными мишенями на клеточной поверхности; в) получены иммуномагнитолипосомы, которые, связываясь избирательно с клетками, делают их подвижными в градиенте напряженности магнитного поля; продемонстрирована возможность сортировки клеток с помощью таких липосом.
Впервые высказана и подвергнута экспериментальной проверке гипотеза о непосредственном участии липидной фазы плазматических мембран в контактных взаимодействиях клеток друг с другом. Получено экспериментальное подтверждение этой гипотезы.
Научно"Практическая ценность работы. Представленные в диссертации экспериментальные данные и теоретические обобщения создают основу нового направления фундаментальных исследований межклеточных контактных взаимодействий. Результаты работы представляют также практический интерес для применения искусственных липид-ных мембран, в частности, липосом в медицине.
Данные о роли фазового состояния липидов в адгезии клеток позволяют по-новому подойти к фундаментальной проблеме - изучению неадгезивности сосудистого эндотелия.
Результаты экспериментов по переходу фосфолипидных молекул между искусственными и клеточными мембранами демонстрируют возможность модификации фосфолипидного состава клеточных мембран. Эти опыты указывают также на возможную физиологическую роль межмембранного липидного оомена в регуляции липидного состава эндо-телиальных клеток.
Структурная перестройка липосом в процессе контакта с клетками указывает на возможную роль липидов в формировании различных клеточных контактов.
Обнаруженное связывание липопротеидов крови липосомосвязы-вающими центрами клеточной поверхности показывает существование еще одного пути связывания липопротеидов, опосредуемого ИХ ЛИПИД-7 ной фазой.
Неадгезивностъ жидко-кристаллических липидных пленок для тромбоцитов, продемонстрированная в наших опытах, может стать основой для создания новых нетромбогенных материалов, имитирующих физические свойства таких пленок.
Угнетение адгезии клеток под действием липосом может быть использовано для разработки способов предотвращений повышенной агрегации и адгезии тромбоцитов при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Обнаруженные принципиальные различия в механизме взаимодействия с клетками липосом с жидко-кристаллической и "твердой" (гелеобразной) мембраной диктует необходимость строгого выбора липидных везикул в зависимости от цели их введения в организм. Для введения химических агентов в цитоплазму целесообразно использовать жидко-кристаллические, а для создания лекарственного депо - "твердые" липосомы. Агрегация липосом и нарушение их проницаемости при контакте с клеточной поверхностью указывают на возможные побочные эффекты "липосомотерапии", которые следует обязательно учитывать при введении липидных везикул в организм.
Описанные в диссертации липосомы, несущие иммуноглобулины, положили основу использования липидных везикул для целенаправленной доставки физиологически активных веществ к тканям и органам-мишеням.
Разработанный в диссертации метод получения иммуномагнито-липосом и разделения с их помощью клеточных популяций представляет собой новый принцип сортировки клеток - процедурні широко применяемой в лабораторной и клинической практике.
Для расшифровки фундаментальных механизмов контактных взаимодействий клеточных мембран необходима система, где в контролируемых условиях можно изучить роль отдельных мембранных компонентов в этих процессах. В настоящей диссертации предложена такая система. С ее помощью можно исследовать различные аспекты межмембранных контактных взаимодействий.
