Содержание к диссертации
Введение
Глава.I. Природные растительные ассоциации 8
I.I. Краткая характеристика растительных
ассоциаций 9
1.1..1 Высшие растения-бактерии 9
1.1..2.Высшие растения - цианобактерий II
1.1.3. Высшие растения -актиномицеты II
1.1.4. Высшие растения - грибы.. II
1.1.5. ВодорбслйГ'.. ." -грибы 12
1.1.6. Водоросли - бактерии, цианобактерий... 12
1.2. Природные симбиотические ассоциации циано
бактерий 15
1.2.1. Распространение симбиотических цианобактерий в природе 15
1.2.2. Характер зависимости партнеров в природных ассоциациях 15
1.2.3. Типы природных симбиотических ассоциаций цианобактерий 21
1.2.4. Характер метаболических связей цианобактерий с партнерами в симбиотических ассоциациях 28
1.3. Искусственные симбиотические системы с использованием культивируемых клеток.рэстений 33
1.3.1. Свойства растительных клеток,определяющие их выбор при создании модельных ассоциаций 34
1.3.2. Свойства цианобактерий,определяющие их выбор при создании искусственных ассоциаций 37
1.3.3. Свойства цианобактерий и культивируемых клеток,затрудняющие возможность их ассоциированного роста 40
Моделирование ассоциаций на основе культур растительных клеток и цианобактерий 41
Экспериментальная часть.
Глава II. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследования 46
2.2. Методы исследований 47
Результаты исследований
Глава III. Получение и характеристика смешанной культуры 56
3.1. Получение ассоциативной культуры клеток женьшеня и цианобактерии С.fritschii 56
3.2. Клеточные взаимодействия и структурная организация клеток женьшеня С. fritschii в ассоциации 64
Глава ІV. Динамика изменений ' физико-химических характеристик среды при формировании и субкультивировании ассоциации 68
4.1. Рост монокультур 68
4.2. Формирование ассоциации 68
4.3. Субкультивирование ассоциации 74
Глава V. Оптимизация условий культивирования ассоциации 78
5.1. Рост цианобактерии на модифицированных средах 78
5.2. Влияние ионов натрия калия,аммония и использования их сочетаний для оптимизации роста ассоциации 80
5.3. Влияние интенсивности освещения на рост монокультуры С. fritschii и ассоциации 91
Глава VІ. Образование биологически активных веществ клетками женьшеня в ассоциации с цизнобактери;ей и влияние их на метаболизм цианобактерии 98
Глава VП. Ультра структура клеток женьшеня 103
7.1. Ультраструктура клеток кеньшенн в монокультуре 103
'7.2. Ультра с тру к тура клеток женьшеня в ассоциации 107
Глава VШ. Использование клетками женьшеня продуктов фотосинтеза цианобактерии С. fritschii .. 113
Глава IX. Ультраструктура цианобактерии С. fritschii.. Ц8
9.1. Ультраструктура цианобактерии С. fritschii в фототегеротрофных условиях роста ассоциации 118
9.2. Ультраструк тура С. fritschii в хемотетеротрофной ассоциации.. 121
Обсуждение результатов 125
Выводы 134
Список цитированной литера туры. 136
- Высшие растения-бактерии
- Получение ассоциативной культуры клеток женьшеня и цианобактерии С.fritschii
- Рост монокультур
- Рост цианобактерии на модифицированных средах
- Образование биологически активных веществ клетками женьшеня в ассоциации с цизнобактери;ей и влияние их на метаболизм цианобактерии
Введение к работе
Стремительный рост народонаселения во второй половине 20 века, с одной стороны1, и быстрое истощение пищевых ресурсов, с другой стороны, требуют всестороннего развития и применения биотехнологии в промышленности и сельском хозяйстве.
На основе культивируемых клеток растений возможно создание: I) практически важных технологий по получению клеточных биомасс и биологически активных веществ, продуцируемых только растениями, 2) биотехнологий в сельском хозяйстве, основанных на использовании морфогенетических потенций культур клеток и тканей для клонального микроразмноженйя культурных растений и оздоровления посадочного материала, а также улучшения растений при использовании в генетико-селекционной работе клеток и изолированных протопластов.
Культивируемые клетки in vitro сохраняют способность к специфическим биосинтезам, свойственным целому растению. Это создает перспективы промышленного получения на их основе важных в промышленном отношении веществ (Слепян и др., 1968). Сохранение природных ресурсов редких, экзотических и фармакологически важных видов растений, таких, как, например, женьшень, радиола розовая, диоскорея и т.д. (Грушвицкий, 1978 ), становится возможным благодаря сохранению их тканей в условиях глубокого замораживания с реализацией затем их способности к морфогенезу (Бутенко, Попов, 1982).
Одним из путей изменения и улучшения свойств популяций растительных клеток in vitro или целых растений может сое- тоять в создании различного рода ассоциаций культивируемых клеток с микроорганизмами, обладающими полезными свойствами (Burgoon, Botfcino, ^76^ Gamborg, Bottlno, 1981; Gusev et alm-f 1984).
Введение в культуры гетеротрофных клеток растений фото-трофного компонента предполагает использование растительными клетками продуктов фотосинтеза другого симбионта. Кроме того, микроорганизмы могут синтезировать вещества-предшественники биологически активных соединений, продуцируемых растительными клетками» Использование растительными клетками метаболитов микроорганизмов в смешанной ассоциативной культуре может являться фактором повышения их продуктивности при промышленном выращивании.
Изучение природных сообществ растений с микроорганизмами показывает перспективность использования в качестве партнера в модельных ассоциациях азотфиксирующих бактерий и сине-зеленых водорослей, которые в последнее время в силу ряда их особенно-стей стали называть цианобактериями (stanier et ai.,1971 ) .
Широкие приспособительные возможности, способность переключаться с фототрофного на гетеротрофный путь метаболизма, осуществлять фиксацию молекулярного азота и углекислоты в сочетании с выделением в окружающую среду большого количества органических веществ различных химических классов делает цианобактерии интересным объектом как для фундаментальных исследований, так и практического использования. Цианобактерии играют заметную положительную роль в экосистемах, в частности как фототрофные азотфиксэторы, обогащающие почвы и водоемы органическим веществом и азотом. Однако периодические вспышки их мае- сового развития в пресноводных водоемах, так называемое "цветение воды", приносит огромный экономический ущерб.
Исследование поведения цианобактерий в искусственных ассоциациях имеет и самостоятельное значение для моделирования природных симбиозов, в которых цианобактерий выполняют роль фОТОСИНТеЗИрующеГО ИЛИ ЭЗОТфИКСИруЮЩеГО компонента ( Stewart et ai.,1983 ). Симбиоз папоротника Azolla и цианобактерий Anabaena azolla позволяет использовать _ эти .организмы как источник азота при возделывании риса (Peters, Mayne,1974 ; Peters ,1977 ; Нгуен Хыу Тхок,1984 ).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось создание и изучение ассоциации межклеточного типа между культурой клеток женьшеня-продуцента биологически активных веществ __ и факультативно фототрофной цианобактерией Chiorogloea fritschii В задачи наших исследований входило: I) подбор условий экспериментального получения ассоциированного роста суспензионной культуры женьшеня и цианобактерий; 2) изучение их взаимного влияния на рост и метаболические функции в ассоциации; 3) исследование ультраструктурной организации и характера клеточных взаимодействий партнеров в ассоциированной культуре.
Научная новизна. Получена новая искусственная ассоциация клеток женьшеня и факультативно фототрофной циэнобактерии С. fritschii , культивируемая в темноте и на свету. На основании анализа метаболических и клеточных взаимодействий партнеров установлен симбиотический характер ассоциации. Обнаружена биосинтетическая активность ассоциированных с цианобактерией клеток женьшеня, сравнимая с таковой в чистой культуре. Установлено потребление клетками женьшеня продуктов фотосинтеза циано- бактерий и их рост за счет экзометаболитов циэнобактерии.
Практическая значимость работы» Подобранные условия культивирования ассоциации на свету при дефиците экзогенного источника углерода при сохранении биосинтетической активности клеток женьшеня в ассоциации могут быть использованы для разработки более рентабельных технологий получения клеточной биомассы женьшеня.
Разработанные принципы получения ассоциации позволяют прогнозировать совместимость партнеров при создании ассоциаций межклеточного типа и определять подбор партнеров при получении ассоциаций внутриклеточного типа на основе изолированных протопластов. Полученная система может быть использована в качестве модели для изучения природных ассоциаций высших растений с цианобактериями на клеточном уровне.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на I школе по проблемам геронтологии (Сочи, 1981), заседании кафедры физиологии растений Биологического факультета МГУ, на конференциях (XIII и ХІУ) молодых ученых Биологического ф-та ( 1982, 1983 г.г.), I Всесоюзном совещании молодых ученых по физиологии растительной кл^фи (Москва, 1983), а так же ІУ Всесоюзной конференции "культура клеток растений и биотехнологии" (Кишинев,1983 ).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, 2 находятся в печати.
Структура и объем работы. Диссертация (^ стр., табл.,
14- рис.) состоит из введения, обзора литературы, методов исследования,результатов и обсуждения, выводов,списка цитированной литературы и приложения. Список литературы содержит goo* наименований} из них 106 зарубежных авторов.
Высшие растения-бактерии
Примером симбиотических взаимоотношений высших растений с бактериями могут служить симбиозы, образуемые представителями сем. beguminosae с бактериями рода RMzobium . Бактерии р# Rhizobium образуют видоспецифический контакт с поверхностью КЛеТОК КОрневЫХ ВОЛОСКОВ бобову растений ( Katagoro et al.1980 ). В клетках корневых волосков при этом происходит инвагинация цитоплазматической мембраны, из которой формируется трубка, так называемая инфекционная нить. Инфекционная нить, в которой располагаются клетки бактерий,проникает в кору кончая, проходя через коровые клетки. При достижении инфекционной нити тетраплоидной клетки коры наблюдается стимуляция многократных делений последней и соседних диплоидных клеток, что приводит к образованию клубенька. Особая форма бактерий - бактероиды, локализуясь в клетках клубенька, осуществляют фиксацию молекулярного азота и снабжают растение легко усвояемыми его формами. (Стейниер и др., 1979).
В этом симбиозе оба компонента извлекают выгоду от сожительства: растения получают связанный азот, бактерии углерод-содержащие вещества и минеральные соли. Корневые клубеньки, или образования, " напоминающие их, встречаются на корнях не только бобовых растений. Они обнаружены у голосеменных и покрытосеменных двудольных растений (Perain et al. ,1980)» Однако еще не удалось во всех случаях установить видовую принадлежность бактериального партнера в этих симбиозах (Стейниер и др.,1979). Бактериальные клубеньки формируются не только на корнях. Извест но более 400 видов различных растений, образующих клубеньки на нижней стороне листа, как правило, вдоль основной жилки (Шильниковэ, 1974). Выделенные из листовых клубеньков
Psychotria bacteriophyta , Coffe arabica бактерии из рода Klebsiella способны фиксировать атмосферный азот не только в симбиозе,но и в монокультуре silver,
Получение ассоциативной культуры клеток женьшеня и цианобактерии С.fritschii
На первом этапе исследований необходимо было определить возможность совместного роста культивируемых клеток женьшеня и цианобактерий С. fritschii , а также определить эффективность роста смешанной культуры по сравнению с соответствующими монокультурами» Среда МС с уменьшенной в 4 раза концентрацией всех компонентов (1/4 МС) при содержании сахарозы в концентрации 1,5$ (1/2 н) не оптимальна для роста в темноте в монокультуре как растительных клеток, так и цианобактерий, которые после двух недель роста переходили в стадию деградации (рис.2).
Рост в смешанной культуре на той же среде зависел от соотношения объемов инокулята партнеров и характера их засева в среду - дробно или всей порцией сразу. Инокулят во всех случаях содержал стандартное количество массы цианобактерий на единицу объема.
В различных вариантах проведенных опытов винкубационную среду одновременно вносили суспензию клеток женьшеня в объеме 10$ и суспензию клеток цианобактерий в объеме 10$, 20$, 40$ по отношению к общему объему среды (табл.2). Дробное внесение цианобактерий два раза по 20$ к объему среды осуществляли с промежутком между ними в 9 дней, а 4 раза по 10$ - каждые пять дней после исходного инокулята в объеме 10$. Такие сроки последовательного внесения порций инокулята цианобактерий в смешанную культуру определялись исчезнованием к этому моменту свободных клеток С. fritschii , внесенных в предыдущей порции инокулята в результате адсорбции их на поверхности агрегатов женьшеня. При совместном высеве в течение первых 5 дней рост обоих партнеров происходит в виде суспензий отдельных клеток, а с 5-9 суток культивирования начинается формирование сначала мелких, а затем более крупных агрегатов женьшеня с адсорбированными на них клетками цианобактерий, так что к концу второй недели практически все клетки цианобактерий оказываются связанными с агрегатами клеток женьшеня. При формировании агрегатов клеток женьшеня садсорбированными цианобактериями был невозможен раздельный учет прироста цианобактерий и клеток женьшеня, так как при мэцериро-вании смешанных агрегатов 8$ хромовой кислотой не происходило разделение компонентов, поэтому прирост смешанной культуры оценивали по отношению к исходному засеву и к суммированному приросту партнеров клеток женьшеня и цианобактерий в монокультурах в тех же условиях.
Рост монокультур
Потребности в факторах роста культивируемых клеток растений и цианобактерий различны и часто противоположны (Бутенко,1964, Гусев, 1968),0 чем подробно говорилось в главе 1.3 настоящей работы.
Изменение физико-химических характеристик среды в ассоциациях организмов с противоположными в них потребностями представляет большой интерес для понимания взаимодействия компонентов в системе, динамики роста каждого из них, что особенно важно в тех случаях, когда клетки партнеров трудно или невозможно разделить.
Изучение динамики изменений физико-химических характеристик среды при формировании и субкультивировании ассоциации осуществляли в культиваторах, позволяющих проводить непрерывную регистрацию рН и р02 в динамике роста культуры в накопительном режиме. Непрерывная регистрация показателей состояния среды имеет преимущества перед снятием их в фиксированные промежутки времени, так как в последнем случае могут быть упущены точки экстремального состояния системы учитывая трудности экстраполяции результатов, получаемых в системе, состоящей из двух организмов с разными потребностями в факторах среды и обладающих способностью их изменять.
Рост цианобактерии на модифицированных средах
Смешанное культивирование клеток женьшеня и цианобактерии осуществляли на среде МС, используемой для культивирования растительных клеток и содержащей, помимо минеральных солей витамины, гормоны, гидролизат казеина, сахарозу.
Монокультура С. fritschii на среде для смешанного культивирования ІЛ МС (вариант 4, табл.3) не росла в первые дни и начиная с 18 суток деградировала, что сопровождалось выходом пигмента фикоцизнина в культурэльную среду (табл.3). В ассоциации с растительными клетками количество цианобактерии значительно увеличивается, особенно начиная с шестых суток. Задача повышения продуктивности ассоци ированной культуры может быть решена путем создания условий, обеспечивающих более быстрое развитие цианобактерии в смешанной культуре. В связи с этим необходимо было изучить влияние некоторых компонентов среды культивирования на рост цианобактерии С. fritschii в монокультуре.
Анализ состава сред МС (Бутенко,1964) и BG-II ( stanier et al.,1971 ), используемых для роста монокультур женьшеня и цианобактерии соответственно показал, что по набору минеральных солей они имеют сходный состав. Однако, в среде МС преобладают соли в калиевых, а азот в аммонийном и нитратной формах, тогда как в среде BG-II соли в натриевой, а азот только в нитратной формах.
Для нормальной жизнедеятельности клеток высших растений необходим калий. При отсутствии в среде культивирования иона калия в первом пассаже культуры растительных клеток наблюдается угнетение роста и некрозы, а во втором - прекращение роста и гибель клеток. Присутствие в среде иона натрия не является обязательным, однако, в некоторых случаях добавление в среду хлорида натрия стимулировало рост тканей (Бутенко,1964).
Для роста и развития цианобактерий, в свою очередь,необходимо присутствие в среде иона натрия, который не может быть заменен другими катионами, например, калием, магнием,( Allen, Агаоп,1955). В предварительных опытах с использованием а томно-адсорбционного спектрофотометра нами было установлено,что в первые шесть суток роста ассоциации происходит поглощение ионов калия из среды культивирования и поступление в нее ионов натрия. Концентрация иона натрия в культуральной среде на шестые сутки роста системы в пять раз превышает исходную и составляет около 6,5 jj моль. Как было установлено ранее (гл.4 настоящей работы)?в первые сутки смешанного культивирования происходит развитие клеток женьшеня и только на 6-7 сутки - цианобактерий, что,возможно, связано с изменением ионного состава среды и обогащением ее ионами натрия.
Образование биологически активных веществ клетками женьшеня в ассоциации с цизнобактери;ей и влияние их на метаболизм цианобактерии
Биологически активные вещества, синтезируемые клетками женьшеня, оказывают стимулирующее, тонизирующее и адаптогенное действие на биологические объекты (Грущвицкий, 1978; Крендель и др., 1981). Имеются данные о том, что эти вещества выделяются в среду не прижизненно, а в результате лизиса: клеток женьшеня.
Кроме того, установленный нами факт лизиса части растительных клеток на поверхности агрегатов и взаимодействие цианобактерий с остатками клеток женьшеня (см.раздел 3.2) заставляет рассмотреть ассоциативные взаимоотношения с точки зрения специфики женьшеня, как продуцента биологически активных веществ.
Таким образом, на данном этапе работы предстояло изучить: во-первых, с помощью биохимического и электронномикроскопического методов способность клеток женьшеня в монокультуре и в ассоциации с цианобактерией продуцировать биологически активные вещества; во-вторых, показать локализацию этих веществ в клетках женьшеня и в-третьих, определить влияние на фикобионт биологически активных веществ, продуцируемых растительными клетками.
При культивировании на свету и в темноте цианобактерий растут в ассоциации, тогда как в соответствующих условиях в монокультурах наблюдается их гибель. Можно предположить, что одна из причин роста C.fritschii в смешанной культуре по сравнению с монокультурой состоит в воздействии нзнее растительных клеток с продуктами биосинтеза биологически активными веществами, относящимися к тритерпеновыь гликозидзм (Бутенко и др.,1979). Исследование содержания биологически активных веществ в монокультуре клеток женьшеня и в ассоциации через 14 суток роста в темноте на среде 1ЛМС-1,5# сахарозы показало, что в ассоциации синтез веществ, экстрагируемых указанным в "методах" способом, происходит не в меньших количествах, чем в монокультуре, и составляет 5-75 от биомассы высушенных клеток (табл.5). Надо отметить, что биосинтез СГФ клетками женьшеня в монокультуре происходит в пределах обычных значений для э.той культуры. В стационарной фазе роста, по известным литературным данным, содержание гликозидной фракции в клетках женьшеня составляет 4—ГО от веса ткани, что зависит от условий ее культивирования, а также от точности самого метода (Александрова и др., 1981).
В наших опытах выращивание культур проводилось в условиях пониженных концентраций всех компонентов среды. Таким образом, при росте в ассоциации цианобактерии не оказывают отрицательного влия-ная на биосинтетическую активность клеток женьшеня. В свою очередь, клетки женьшеня, благодаря сохраняющейся способности к видоспеци-фическому синтезу биологически активных веществ, могут оказывать . влияние на клетки цианобактерии. Так, добавление в среду BG-II для культивирования цианобактерии С. fritschii экстракта клеток женьшеня в концентрации 1:10 приводит к увеличению скорости эндогенного поглощения кислорода приблизительно в пять раз по сравнению с контролем и составляет 172 Нмоль 02/час (рис.14). Использование экстрактов различной концентрации не обнаружило их влияния на фото-синтетическую активность С. fritschii .
