Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 9
2.1. Молекулярно - генетические аспекты взаимодействия растения и патогена 9
2.2. Восприятие, передача и преобразование сигналов у растений при патогенезе 16
2.2.1. Элиситоры 16
2.2.2. Иммуносупрессоры 33
2.2.3. Экзометаболиты, продуцируемые бактериями рода clavibacter 39
2.2.4. Рецепторы 43
2.2.5. G-белки 51
2.2.6. Сигнальные системы клеток растений 53
Выводы из обзора литературы.
Цель и задачи исследования 62
3. Материалы и методы исследования 65
3.1. Объекты исследования 65
3.2. Выделение и очистка эпс cms (штамм 5369) 66
3.3. Определение химического состава эпс cms 66
3.4. Гель-фильтрация эпс cms 67
3.5. Газожидкостная хроматография эпс cms 67
3.6.13с-ямр-спектроскопия эпс cms 67
3.7.ик-спектроскопияэпсст 68
3.8. Конъюгация полисахаридов с флуоресцентным красителем 68
3.9. Выделение клеточных стенок 68
Зло. Аффинная хроматография 69
3.11. Выделение мембран 69
3.12. Электронная микроскопия 71
3.13. Ддс-na-naat - электрофорез белков микросомальных мембран 71
3.14. Обработка образцов мембран конъюгатом эпс-дхтаф 72
4. Результаты исследований 73
4.1. Изучение состава экзополисахаридов возбудителя кольцевой гнили картофеля и структуры их основного компонента 73
4.2. Микросомальные фракции мембран суспензионных клеток картофеля 80
4.3. Изучение белковых спектров микросомальных мембран 85
4.4. Рецепция эпс cms на плазмалемме клеток картофеля 88
5. Обсуждение 95
Взаимодействие эпс cms с рецепторами клеточной стенки и плазмалеммы растения в фитопатосистеме «картофель - возбудитель кольцевой гнили» 95
6. Выводы 106
Список литературы
- Восприятие, передача и преобразование сигналов у растений при патогенезе
- Экзометаболиты, продуцируемые бактериями рода clavibacter
- Выделение и очистка эпс cms (штамм 5369)
- Микросомальные фракции мембран суспензионных клеток картофеля
Восприятие, передача и преобразование сигналов у растений при патогенезе
Элиситоры играют роль первичных сигналов и приводят в действие сложнейшую сеть процессов индукции и регуляции фитоиммунитета, что проявляется в синтезе так называемых "средств защиты" растений: PR-белков, растительных антибиотиков - фитоа-лексинов, антипатогенных летучих соединений и др. (Тарчевский, 2002).
Термин "элиситор" (от англ. elicit - выявлять, вызывать) впервые был предложен Кином для обозначения химических сигналов, возникающих в местах инфицирования растений патогенными микроорганизмами, и получил в дальнейшем широкое распространение.
Существует две группы элиситоров: абиогенные и биогенные. К абиогенным элиситорам относятся ионы тяжелых металлов, УФ-радиация, ингибиторы отдельных звеньев метаболизма, некоторые антибиотики и фунгициды. Абиогенные элиситоры индуцируют защитные реакции растений в относительно высоких концентрациях, тогда как биогенные активны в чрезвычайно малых дозах. Биогенные элиситоры разделяют на экзогенные для растения (выделены из патогенов или сред их культивирования) и эндогенные (изолированы из тканей самого растения) (Озерецковская, Васюкова, 2002).
Кроме того, некоторые авторы подразделяют элиситоры на первичные и вторичные (Тарчевский, Чернов, 2000). Первичные продуцируются непосредственно микроорганизмами как до, так и после контакта с растением-хозяином, вторичные образуются при ферментативном расщеплении высокополимерных соединений кутикулы и полисахаридов клеточных стенок растений и микроорганизмов. Еще один тип элиситоров, синтез которых индуцируется как патогенами, так и абиогенными стрессорами, представлен стрессовыми фитогор-монами. К последним относят этилен, абсцизовую, жасмоновую, салициловую кислоты, полипептид системин и перекись водорода. Они образуются в клетках растений в местах поражений и распространяются в другие ткани и органы, вызывая появление системной устойчивости (Тарчевский, 2000).
Первый биогенный элиситор был открыт в 1968 году и с тех пор регулярно появлялись сообщения об открытии новых элиситоров и синтезе их синтетических аналогов (Озерецковская, Васюкова, 2002).
В настоящее время охарактеризована структура множества природных элиситоров (Sharp et al., 1984; Hahn, 1996). Их химическая природа оказалась весьма разнообразной. Это белки, полипептиды, гликопротеины, полисахариды, липидсодержащие соединения или вещества иной природы.
Элиситоры белковой природы. К числу важнейших элиситоров относятся белковые соединения, экскретируемые патогенными бактериями и грибами (Cervone et al., 1997), а также структурные белки оболочки вирусов, например, вируса табачной мозаики (Toedt et al., 1999).
Примером грибных элиситоров пептидной природы являются элиситины, секретируемые всеми исследованными видами Phytoph thora и Phytium. Это консервативные, гидрофильные, обогащенные цистеином белки, с молекулярной массой около 10 кДа (Kamoun et al., 1993, 1997, 1998; Pallaghy et al, 1994; Huet et al, 1995; Lloyd, 1995). Наиболее интенсивный синтез элиситинов фитофторой происходит при росте мицелия и при споруляции гриба, когда наблюдаются некрозы в листьях растения-хозяина. Показано, что элиситины вызывают СЧ-реакцию, образование фитоалексинов и активных форм кислорода в инфицированных клетках растений.
Элиситины гриба Cladosporium fulvum интенсивно образуются внутри листа растения томата, тогда как в условиях in vitro синтез пептидного элиситора не наблюдался. Поэтому было предположено, что экспрессия генов авирулентности и образование элиситоров может происходить только в условиях inplanta, а значит, их поиск в условиях in vitro маловероятен (Van den Ackerveken et al., 1994).
Обнаружено, что элиситины имеют стеролсвязывающий сайт и могут переносить стеролы через мембраны, что важно как для питания микроорганизмов, не способных к синтезу данных соединений, так и для индукции защитных реакций растений (Mikes et al., 1998).
По степени токсичности выделяют два класса элиситинов: 1) кислые ос- элиситины - менее токсичны и включают капсицеин и пара-зитицеин; 2) основные р- элиситины - более токсичны и включают криптогеин и циннамонин (Cervone et al., 1997). Наиболее изучен из них криптогеин - элиситин, продуцируемый фитопатогенным грибом Phytophthora cryptogea (Ricci et al., 1989; Keller et al., 1999; Foissner et al, 2000).
Экзометаболиты, продуцируемые бактериями рода clavibacter
По современной номенклатуре род Clavibacter представлен группой родственных микроорганизмов, объединенных на основании особенностей морфологии и цикла развития и характеризующихся широким спектром биохимических свойств. Род Clavibacter содержит в себе грамположительные и неподвижные бактерии, обладающие коринеморфной морфологией, при которой делящиеся клетки соединены под углом (V-образная форма). Бактерии этого рода вызывают у растений болезни увядания - вилт, хлорозы, некрозы, а также рак. К факторам патогенности этого рода, как считают некоторые авторы, относятся нативные плазмиды (Metzler et al., 1997).
Большинство видов этого рода системно инфицируют только несколько видов растений: Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus (Cmi) вызывает вилт люцерны и других кормовых бобовых (Vidaver, 1982), Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), вызывает бактериальный рак томатов (Варбанец и др., 1986) и Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Cms) - вызывает кольцевую гниль клубней картофеля (Westra, Slack, 1992).
Для бактериоза картофеля, вызываемого Cms, характерны следующие симптомы (рис. 1): снижение энергии, задержка роста растений, хлороз и завядание листьев, разрушение сосудистой ткани клубня, некроз стебля и кольцевая гниль клубня (Янович, 1971; Ко-няеваи др., 1987).
Ранее считалось, что основным фактором вирулентности грам-положительной бактерии Cms, является экскретируемый бактерией гликопептид с молекулярной массой 22 кДа, который рассматривался как токсин (Strobel, Hess, 1968; Strobel, 1977). Однако в ряде работ бы ло показано, что Cms продуцирует экзополисахариды (ЭПС), токсические свойства которых подверглись сомнению (Vidaver, 1982; Denny, 1995).
Симптомы бактериоза, вызываемого возбудителем кольцевой гнили картофеля Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (по Н.М. Конеявой и др., 1987) А - увядание растения; Б - разрушенное сосудистое кольцо клубня; В - выделение слизи при сдавливании клубня В литературе последних лет активно дискутируется вопрос о роли бактериальных ЭПС в развитии патогенеза растений (Романенко и др., 1999а; 19996; Ломоватская и др., 2000; Граскова и др., 2002).
Известно, что вирулентность многих фитопатогенных бактерий определяется их способностью к синтезу ЭПС. Например, у патогенных бактерий Erwinia stewartii, Erwinia amilovora, Clavibacter michiganensis subsp. indiosus, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis продуцируемые ими ЭПС являются факторами вирулентности (Geier and Geider, 1992; Bermpohl et al., 1996).
По имеющимся в литературе сведениям бактерии рода Clavibacter в культуре синтезируют два типа ЭПС: Тип А -высокомолекулярный анионный полимер; тип В - низкомолекулярный нейтральный полимер (Denny, 1995).
Различные виды Clavibacter вырабатывают полисахариды, различающиеся по составу и структуре (Vidaver, 1982; Nissinen et al, 1995). Так, в состав ЭПС из штаммов Сті входят D-глюкоза, галактоза, фукоза и остаток пировиноградной кислоты (ПВК) (Vidaver, 1982). Полисахариды Стт состоят из рамнозы, маннозы, глюкозы, остатков ПВК и уроновой кислоты, в состав ЭПС некоторых штаммов входит также фукоза (Варбанец и др., 1986). Штаммы Cms синтезируют ЭПС, который содержит маннозу, фукозу, галактозу, глюкозу (Westra, Slack, 1992).
ЭПС, в отличие от токсинов, продуцируются большинством бактерий, влючая фитопатогены и секретируются как слизь или капсуляр-ный материал. Поэтому можно предполагать, что ЭПС наиболее важны для выживания бактерий в растении и образования колоний (Denny, 1995).
Отмечается также, что ЭПС защищают свободноживущие бактерии в инфекционных локусах от различных стрессов окружающей среды и способствуют развитию заболевания: поддерживая водное набухание межклеточных пространств; изменяя восприимчивость к защитному арсеналу растения, в том числе к антимикробным компонентам; блокируя ксилему и тем самым, производя симптомы завядания (Goodman, Novacky, 1994).
Имеются сведения, что ЭПС, секретируемые вирулентными штаммами Cms, участвуют в возникновении симптомов болезни, в частности, вилта (Daly, 1981; Van Alfen, 1989; Benhamou, 1991). Данные, полученные на люцерне и картофеле, показывают, что вилт обусловливается нарушением функций сосудистой системы растений (Bishop, Slack, 1992). Молекулы полисахаридов, препятствуют водному току, закупоривая поры в мембранах (Van Alfen, McMillan, 1982). Природно немукоидные штаммы Cms колонизируют и вызывают вилт растений картофеля так же, как и мукоидные. Это свидетельствует о том, что если некоторые ЭПС и вовлекаются в вилт, то к ним относятся их низкомолекулярные компоненты (Westra, Slack, 1992; Baer, Gudmestad, 1993; Hennigson, Gudmestad, 1993).
В настоящее время у вирулентных штаммов Cms обнаружен белковый фактор, вызывающий реакцию сверхчувствительности у растений-нехозяев (Nissinen et al., 1995). Есть данные, что к факторам вирулентности этого вида бактерий относятся внеклеточные ферменты, например, плазмидкодируемая целлюлаза (Metzler et al., 1997). Экспериментально доказано, что штаммы, несущие ген целлюлазы, способны индуцировать у растений симптомы заболевания, а штаммы, в которых этот ген отсутствует - нет (Meletzys, Eichenlaub, 1991).
Выделение и очистка эпс cms (штамм 5369)
Содержание углеводов в составе ЭПС определяли антроновым методом (Филиппович и др., 1975), белков - методом Бредфорда (Bradford, 1976).
Для определения азотсодержащих компонентов ЭПС (аминокислот и аминосахаров) навеску (20 мг) сухого препарата вносили в круг-лодонную колбу емкостью 10 мл, добавляли 5 мл 6 N НС1 и гидроли-зовали в вакууме при температуре 110С в течение 24 часов. Анализ поводился на аминокислотном анализаторе AAA 881 («Mikrotechna», Чехия) в натриевом цикле.
Комплекс ЭПС разделяли методом колоночной гель-фильтрации (Остерман, 1985) на колонке (73x1,5 см), заполненной сефадексом -G-25 со скоростью элюции 120 мл/ч, которая была подобрана экспериментально. Для этого 1,5 мл 2%-ного раствора ЭПС на бидистилли-рованной воде наносили на колонку и проводили элюцию бидистил-лятом. Оптическую плотность элюата фиксировали при длине волны 206 нм на хроматографическом оборудовании Uvicord («LKB», Швеция).
Фракции элюта, собранные соответственно каждому пику, высушивали с использованием оборудования для лиофильной сушки «ИНЕЙ-32» (Россия) до порошкообразного состояния и хранили при температуре 4С.
Для установления моносахаридного состава ЭПС проводили их полный кислотный гидролиз в 2 N H2SO4 , в течение четырех часов на водяной бане, при температуре 96С. Полученые гидролизаты анализировали в виде ацетатов полиолов методом ГЖХ на приборе CROM-5 (Чехия), при температуре 220С, на колонке 0,3x30см, заполненной 5% ХЕ-60, на хроматоне N-AW, газ-носитель N2. Идентификацию моносахаридов проводили с помощью стандартных образцов. Количественные измерения проводили на хроматограммах, измеряя площади соответствующих пиков.
13С-ЯМР-спектры снимали на спектрометре Bruker DRX-400 (Германия) при 60С, используя D20 в качестве растворителя и (CD3)2CO - как внутренний стандарт. ИК-спектры записывали на приборе Specord IR-20 (ГДР) в таблетках КВг. 0,2 г ЭПС или декстрана с молекулярной массой 65-85 кДа («Sigma», США) растворяли в 10 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 8,9. В таком же буфере и объеме растворяли 0,02 г 5-([4,6-дихлортриазин-2-ил] аминофлуоресцеин) (ДХТАФ, «Sigma», США). Растворы смешивали и помещали на шейкер (27С) на 3 часа. Полученные конъюгаты обессоливали и очищали от несвязавшегося красителя на колонке (2,2 х 40 см) с сефадексом G-25 («Sigma», США) элюированием бидистил-лированной водой. Выход элюата контролировали при длине волны 206 нм с использованием хроматографического оборудования Uvicord (LKB, Швеция). Конъюгаты высушивали с использованием оборудования для лиофильной сушки «ИНЕЙ-32» (Россия) до порошкообразного состояния и хранили при температуре 4С.
Клеточные стенки выделяли из суспензионных клеток картофеля сортов, различающихся по устойчивости к Cms: Луговской, Соснов-ский и Лукьяновский. Клетки отмывали от культуральной среды, гомогенизировали в 25 мМ Na-фосфатном буфере рН 7.2, содержащем 2 мМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанол, парахлормеркурибензоат («Sigma», США) и центрифугировали при 5000 g 15 мин. Полученный осадок клеточных стенок солюбилизировали в 100 мМ Na-фосфатном буфере рН 7.2, содержащем 1 М КС1 в течение 12 часов на шейкере.
Выделение рецепторов клеточных стенок картофеля к экзополисахаридам патогена осуществляли методом аффинной колоночной хроматографии с использованием аминированного силикагеля, на котором в качестве лиганда были иммобилизованы ЭПС Cms. Элю-цию проводили растворами со ступенчатыми градиентами рН и ионной силы: 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 0,1 % Na-холат; 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8.0, содержащим 0,2% Na-холат и 1 М КС1; 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8.8, содержащим 0,2% Na-холат и 2 М КС1.
Микросомальные мембраны выделяли методом дифференциального центрифугирования (Кораблева и др., 1980) из 7-10 дневных суспензионных клеток картофеля сортов, контрастных по устойчивости к Cms: Луговской - устойчивый, Лукьяновский - восприичивый. Клетки отмывали от культуральной среды и гомогенизировали при 4С в 40 мМ Трис-HCl буфере рН 7,8, содержащем 250 мМ сахарозу, 3 мМ ЭД-ТА, 2 мМ меркаптоэтанол («Sigma», США), а также 1 мМ фенилме-тилсульфонилфлуорид в качестве ингибитора протеолитических ферментов (Эванз, 1990). Для блокировки неспецифического связывания ЭПС с поверхностными детерминантами плазмалеммы и предотвращения гидролиза белковой части рецепторов протеазами в буфер выделения добавляли 1% БСА (Timmons, Dunbar, 1990; Diekmann et al., 1994).
Микросомальные фракции мембран суспензионных клеток картофеля
Ранее сотрудниками лаборатории было показано, что возбудитель кольцевой гнили картофеля и продуцируемые им ЭПС могут неспецифически воздействовать на растения через нарушение их клеточного рН-гомеостаза (Романенко и др., 1996; Romanenko et al., 1999). В дальнейшем нами были получены данные о присутствии в клетках картофеля сайтов сродства к ЭПС Cms, которые были выделены из го-могената суспензионных клеток картофеля (Романенко и др., 1997а). Поскольку было установлено наличие сродства экзополисахаридов патогена к компонентам клеток растения-хозяина, представлялось существенным выяснить, на каком уровне осуществляются эти взаимодействия и какие клеточные компоненты растения задействованы в этом процессе.
Известно, что клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана являются не только защитным барьером клеток от воздействий извне, но и потенциальным местом проведения сигналов из внешней среды внутрь клетки. Сигнальные молекулы, такие как элиситоры и супрес-соры патогенов, как правило, не проникают внутрь растительной клетки, а специфически взаимодействуют с ее наружной поверхностью, точнее с рецепторами, которые могут локализоваться как в клеточной стенке, так и в плазмалемме (Озерецковская, 2002; Тарчевский, 2002). Образование комплекса сигнальной молекулы с рецептором, в зависимости от типа взаимоотношений патогена и растения (совместимые или несовместимые), инициирует защитную реакцию, блокирует ее или изменяет интенсивность.
Поэтому следующей задачей исследований в этом направлении был поиск детерминант сродства к ЭПС Cms в клеточных стенках кар тофеля. Были получены данные о наличии рецепторов к ЭПС в клеточных стенках суспензионных культур картофеля сортов, различающихся по устойчивости к Cms. Как показали результаты, у восприимчивого сорта таких рецепторов оказалось на порядок больше, чем у устойчивого сорта (табл. 3). В клеточных стенках восприимчивого сорта присутствовали рецепторы наиболее гетерогенной природы: глико-пептиды, пептиды и углеводы. В клеточных стенках устойчивого сорта обнаружено незначительное количество рецепторов, которые состояли из углеводов и следовых количеств белка. Рецепторы среднеустойчи-вого сорта занимали промежуточное положение по количеству в сравнении с контрастными сортами и состояли из гликопептидов и пептидов. Полученные данные дали основание считать, что ЭПС Cms обладают детерминантными группами специфичности и имеют рецепторы, которые локализуются, в первую очередь, в клеточных стенках картофеля.
Исходя из полученных результатов и с учетом литературных данных мы предположили, что для восприятия и последующей передачи в геном сигнала, обеспечивающего запуск защитного ответа растения на воздействие патогена, рецепторы должны локализоваться также и в плазматической мембране клеток картофеля.
Для проверки этого предположения были использованы микро-сомальные мембраны, выделенные из суспензионных клеток картофеля, двух контрастных по устойчивости сортов и конъюгат ЭПС с флуоресцентным красителем (ЭПС-ДХТАФ), что позволило визуализировать процесс связывания экзополисахаридов с мембранами. По интенсивности флуоресценции судили о наличии и относительном количестве сайтов сродства к ЭПС.
Согласно проведенным наблюдениям, микросомальные мембраны практически не обладали собственной флуоресценцией (рис. 12 а, и). Их обработка флуорохромным красителем также не вызывала свечения, что свидетельствовало об отсутствии неспецифического связывания мембран с данным соединением (рис. 12 з, р). Инкубирование образцов мембран, выделенных из клеток устойчивого сорта, с меченными флуорохромом экзополисахаридами различных молекулярных масс (из колонки с сефадексом G 25 элюировались три фракции с мо
лекулярными массами: 3 кДа, 1-3 кДа и 1 кДа), приводило к появлению лишь незначительной их флуоресценции (рис. 12 б-г). Напротив, обработка аналогичными конъюгатами мембран, выделенных из клеток восприимчивого сорта, сопровождалась интенсивной флуоресценцией (рис. 12 к-м). Отмывание образцов в нескольких сменах фосфатного буфера в течение 24 часов на интенсивность свечения не влияло, что свидетельствовало о прочном связывании исследуемых компонентов ЭПС с микросомальными мембранами клеток данных сортов.
Поскольку микросомальные фракции обогащены на 60-65 % фрагментами плазматических мембран, можно полагать, что имеет место специфическое связывание ЭПС с рецепторами, локализованными именно на плазмалемме. Как показали исследования, преинкубация мембран с проназой Е перед добавлением коньюгата ЭПС-ДХТАФ инактивировала процесс связывания ЭПС с мембранами, о чем судили по отсутствию флуоресценции данных образцов (рис. 12 д, н). Инактивация сайтов связывания ЭПС Cms под действием протеолитических ферментов свидетельствует о протеиновой природе доменов, локализованных на наружной стороне плазматической мембраны. Таким образом, с высокой долей вероятности можно считать, что образование лиганд-рецепторного комплекса, где лигандом является определенный компонент ЭПС, происходит на наружной поверхности плазмалеммы на основе белок-углеводного взаимодействия.
Полученные данные соответствуют определению рецепторов, согласно которому «рецепторы - это трансмембранные белки или гли-копротеины, которые обычно состоят из нескольких доменов и содержат на внешней поверхности плазмалеммы по меньшей мере один связывающий домен, специфичный для природного лиганда» (цит по: Стросберг, 1987, с. 107).
