Введение к работе
Актуальность исследования
Одной из актуальных задач современных медицины и биотехнологии является создание высокоэффективных лекарственных средств, характеризуемых не только широким спектром действия и минимальным числом побочных эффектов, но и простотой синтеза биологически активных соединений, составляющих препарат, а также возможностью организации массового производства различных лекарственных форм на их основе. Начальным этапом в решении поставленной проблемы является установление истинной причины возникновения и развития конкретного заболевания. В последние годы основным фактором, провоцирующим появление болезни, все в большем числе случаев склонны считать нарушение баланса во взаимодействии систем клеточных химических регуляторов. Совершенствование биотехнологических методов исследования в медицине и биологии позволило не только установить своеобразие регуляторных пептидных пулов, присутствующих в различных тканях, но и обнаружить изменения характерного пептидного состава в случае патологии. Как следствие - все чаще в терапии и профилактике довольно многих заболеваний в качестве лекарственных препаратов используют различные белки и пептиды. В основном пептидосодержащие лекарственные средства представляют собой экстракты из материалов различного биологического происхождения - органов свиньи, лосося, других рыб и млекопитающих. Из более чем 200 запатентованных на сегодняшний день препаратов, всего лишь несколько десятков являются синтетическими аналогами, либо продуктами модификации эндогенных регуляторных пептидов. В их числе семакс и селанк, относящиеся к классу глипролинов. Данные нейропептиды содержат PGP С-концевую последовательность (глипролины) и синтезированы на основе фрагмента АКТГ(4-10) и тафтсина, соответственно.
Особенностью пептидных регуляторов является не только полифункциональность, но и довольно быстрая их деградация во внутренних средах организма. В большинстве случаев часть образованых в результате протеолиза коротких фрагментов обладает собственной биологической активностью. Так, не только синтетический аналог АКТГ(4-10) - семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), но и ряд фрагментов этого пептида, также относящихся к семейству глипролинов меланокортинового ряда, обладают
* В руководстве работы принимал участие д.х.н. Шевченко В.П.
Список принятых сокращений: АА, АК - арахидоновая кислота; АААА - амино-ацилариламидаза (Е.С. 3.4.11.2); AA-Gly - N-арахидоноил-глицин; AA-Phe - ТЧ-арахидоноил-Ь-фенилаланин; AA-Pro - N-арахидоноил-пролин; BGE - глутамилэндопептидаза Bacillus intermedius; CBR - каннабиноидный рецептор; DR - дофаминовый рецептор; HTR - серотониновый рецептор; MC1R - MC5R - рецепторы меланокортинов; VR - ванилоидный рецептор.
4 широким спектром действия, спосбны улучшать внимание, память и способность к обучению, положительно влияют на общее состояние организма. Несмотря на успешное широкое клиническое применение семакса, механизм его действия остается не ясным. Кроме того, практически не изучены процессы, лежащие в основе действия его коротких производных. Исследование таких процессов на молекулярном уровне, в микро- и нано- молярных концентрациях, требует применения комплексного биотехнологического подхода - использования знаний по физиологии и биохимии, аналитической химии и радиохимии. Разработанный нами метод биосинтеза позволяет приблизить способ получения изучаемых пептидов к процессу их образования в организме, упрощает синтез биологически активных соединений, имеющих в структуре не только пептидные, но и иные составляющие - например, пептиолипинов. Таким образом, изучение молекулярных механизмов действия искусственных аналогов нейропептидов представляет огромный теоретический и практический интерес, позволит не только охарактеризовать процессы, лежащие в основе биологической активности исследуемой группы коротких пептидов, но и приблизиться к пониманию общих закономерностей пептидной регуляции.
Работа выполнена при частичной поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грантов «Ведущие научные школы» № НШ-2150.2003.4, НШ-5638.2006.4, НШ-3626.2008.4 и Государственных контрактов «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» и «Синтез и исследования фармакологически важных пептидов, включая изотопно-модифицированные».
Цель работы
Исследовать ключевые моменты механизма биологического действия семакса и его производных (глипролинов меланокортинового ряда), включающие ограниченный пептидолиз с образованием укороченных форм и специфическое связывание с плазматическими мембранами.
В задачи настоящего исследования входило:
Изучение процесса биодеградации глипролинов меланокортинового ряда (начиная с гептапептида семакса) при взаимодействии с плазматическими мембранами клеток мозга крысы, определение интенсивности протеолитических процессов в различных тканях мозга, а также последующий анализ условий, необходимых для снижения активности мембранных ферментов протеолиза.
Поиск центров специфического связывания глипролинов на плазматических мембранах клеток мозга крысы, включая характеристику обнаруженных мест взаимодействия.
Разработка биотехнологического способа синтеза меченых тритием и немеченых пептидов с применением ферментов различной степени специфичности.
Изучение влияния коротких пептидов (продуктов N-концевого протеолиза семакса, содержащих PGP С-концевую последовательность), а также N-ацилпептидов и N-ациламинокислот на специфическое связывание глипролинов с мембранами мозга крысы.
Исследование конкуренции за места связывания глипролинов со стороны некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов.
Изучение взаимодействия с мембранами мозга крысы ряда ацилированных производных семакса, а также их влияния на специфическое связывание глипролинов.
Научная новизна
В работе впервые удалось установить существование положительной корреляции между наличием и плотностью специфических мест связывания глипролинов и их концентрацией в различных отделах головного мозга крысы. На плазматических мембранах мозжечка и гиппокампа крысы было установлено существование и определены характеристики мест специфического связывания семакса, пентапептида HFPGP и арахидоноил-семакса, на плазматических мембранах базальных ядер -трипептида Pro-Gly-Pro. Впервые изучено влияние ряда коротких пептидов, N-ацилпептидов и N-ациламинокислот, а также некоторых агонистов и антагонистов известных нейрорецепторов на специфическое связывание меченых семакса и пентапептида с мембранами гиппокампа крысы. Установлено, что многие эффекторные молекулы известных нейрорецепторов, имеющие в своей структуре похожие на PGP фрагменты, способны значительно вытеснять трипептид с мест специфических связывания.
Разработан биотехнологический способ синтеза коротких пептидных и комбинированных молекул, а также их радиоактивно-меченых аналогов, из соответствующих модифицированных пептидов, при помощи высокоспецифических ферментов различного типа.
Несомненный научный интерес представляют обнаруженные в данном исследовании особенности и общие характеристики процессов взаимодействия глипролинов меланокортинового семейства, а также их ацилированных производных, с плазматическими мембранами мозга крысы.
В совокупности, полученные данные позволили сформулировать новую гипотезу, объясняющую один из возможных молекулярных механизмов действия семакса, эффективность которого связана, по-видимому, с действием целой группы коротких биологически активных пептидов и аминокислот - продуктов деградации семакса.
Практическая значимость работы
Разработанный и описанный в работе биотехнологический способ получения представляет собой перспективный метод получения коротких пептидных и комбинированных молекул, а также их радиоактивно-меченых аналогов, и, благодаря высокой специфичности фермента, позволяет проводить реакции с большим количеством исходного реагента сразу (с очень высоким выходом 96% - 100%), использовать в качестве субстрата различные соединения на основе Glu - содержащих пептидов, избегая образования множественных побочных продуктов. При помощи данного метода была синтезирована группа меченных и немеченных пептидов, необходимых для изучения механизмов действия глипролинов радиолигандным методом анализа.
Апробация работы
Основные положения работы были представлены на российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе: II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), 8th ECNP Regional Meeting (Moscow, 2005), VI симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2007). IV международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008), конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 статей в российских и зарубежных журналах, 5 публикаций представлено в тезисах материалов российских и международных конференций.
Объем и структура диссертации
